CRISPR-Cas9 kullanılarak Bal Arısı Beyin Bölümlerinde Anti-RDL ve Anti-mGlutR1 Reseptörleri Antikor Testi

İlk defa yetişkin bal arısı beyninde nöronların alt kümelerinde iyonotropik GABAA ve metabotropik glutamat reseptörleri için kodlanmış genlerin bir modifikasyonu kurduk. CRISPR-Cas9 gen düzenleme kontrollü laboratuvar koşulları altında öğrenme ve bellek rollerini keşfetmek için yetişkin arı beyinlerinde bir veya birden fazla gen değiştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, erişkin arılarda spesifik proteinlerin işlevini incelemek ve antikorların ilgili proteinlere karşı özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir.

Irina Sinakevitch ile prosedürü gösteren Lev Kurtzman ve Hyun Choi, benim laboratuvar eski lisans olacak. CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra rdl ve mGlutR1 ekspresyonunu immünositokimyasal analiz ile test etmek için, ilk olarak, apis mellifera, RDL ve mGlutR1 kılavuz DNA dizisini kullanarak kılavuzları tasarlamak için çevrimiçi CRISPR-Cas9 aracını kullanın. Her kılavuz RNA için kılavuz RNA karmaşık oluşumları hazırlamak için, kılavuz RNA adı ile her kılavuz için bir test tüpü etiketve nükleotit içermeyen tampon 92 mikrolitre, 100 mikromolar florofor dört mikrolitre, CRISPR RNA transactivating etiketli ve her tüp için uygun kılavuz RNA çözeltisi dört mikrolitre ekleyin.

Tüm malzemeler eklendiğinde, çözeltileri nazikçe karıştırın ve çözeltiyi tortulamak için tüp içeriğini beş saniye boyunca tezgah üstü bir santrifüjde döndürün. Ardından, çözümleri 5 dakika boyunca 95 dereceye kadar saklayarak bir kılavuz RNA kompleksi ve ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık soğuma oluşturun. Ribonükleoprotein kompleks oluşumları hazırlamak için uygun etiketli tüplere her kılavuz RNA çözeltisinin altı mikrolitreve mikrolitre Başına 0,5 mikrolitre SP-Cas9 nükleaz V3 ekleyin.

Nazik karıştırma sonra, enjeksiyon için RNP ribonükleoprotein karışımları yapmak için 10 dakika boyunca 37 derece santigrat çözeltiler kuluçka, kuluçka sonunda uygun RDL her ribonükleoprotein dört mikrolitre ekleyin. Bir kontrol yapmak için, kılavuzsuz RNA çözeltisi dört mikrolitre tracer RNA ile 92 mikrolitre tampon ve dört mikrolitre su karıştırın. Su ilavesi sonra, 95 santigrat derece beş dakika boyunca çözelti tutun ve oda sıcaklığına ulaşana kadar karışımı soğumasını bekleyin.

Daha sonra, kılavuzsuz RNA çözeltisinin altı mikrolitresini, mikrolitre Başına 0,5 mikrogramlık altı mikrolitre cas9 nükleaz V3 ile karıştırın. Ribonükleoprotein karışımı enjeksiyonu için, şişelerde küçük bir delik ile tek tek arıları yakaladıktan sonra, arıları buzüzerinde en fazla üç dakika hareketsiz hale getirin ve her arıyı koli bandı ile önceden hazırlanmış metal tutuculara sabitleyin. Arka göğüs kafesi, kanatları ve kafası açıkta. Arıları aç kalmadan tek azılı sakkaroz çözeltisi ile beslemek için beş mililitrelik bir şırınga kullanın ve güvenli arıları nem için ıslak kağıt havlulu bir kutuya yerleştirin.

Daha sonra, iki 35 mililitre petri yemekleri kapaklarının içine balmumu yerleştirin ve balmumu üzerine yemeklerin dipleri yerleştirin. Her kabın kapağı ve alt arasında bir azı sakaroz enjekte edin ve bir cam slayt ile beyaz kutu içine bir besleme petri çanak yerleştirin ve bir cam slayt ile siyah kutu içine diğer yerleştirin. Daha sonra, her kutuya küçük bir tarak yerleştirin ve RDL CRISPR-Cas9 karışımı ile bir mikroenjeksiyon sistemi yükleyin.

RDL CRISPR-Cas9 enjeksiyonu için, sekiz arının median ocelli'sini 345 nanolitre ribonükleoprotein RDL karışımı ile enjekte edin ve ardından arıları kara deneysel kutuya bırakmadan önce bir azı sakarozla besleyin. Herhangi bir enjeksiyon olmadan kontrol olarak sekiz arılar ikinci bir set beslemek ve beyaz kontrol kutusuna bırakın. Daha sonra, her iki kutuyu da ıslak kağıtla polistiren bir kap içine yerleştirin, arıları günde iki kez gözlemleyerek yeterli yiyecek ve iyi bir neme sahip olmalarını sağlayın.

Enjeksiyondan 48 saat sonra arıları buzüzerinde 30 saniye hareketsiz hale getirin ve her böceğin kafasını kesmek için makas kullanın. PBS'de %4 paraformaldehit başlığını duman kaputunda bir diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin ve antenleri, bileşik gözleri ve üst dış iskeleti dikkatli ama hızlı bir şekilde çıkarmak için barraquer iris makası kullanın. Başların ekso iskeletin geri kalanını kafadan ve kalan tüm trakeadan çıkarmadan önce 10 dakika boyunca fiksatif çözeltide oturmasını bekleyin.

Daha sonra, her beyin yerleştirin 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içeren en az bir mililitre içeren 4% paraformaldehit bir gecede dört ila sekiz santigrat derece. Ertesi sabah, bir erlenmeyer şişesinde 50 mililitre distile suya 3,8 gram argrose ekleyin ve argrose sıvılaştırılana kadar mikrodalga çözeltisi. Yeni bir 35 milimetre petri çanak içine 3-4 sabit bal arısı beyinleri aktarın ve aşırı fiksatif kaldırmak için doku kağıt kullanın.

Dikkatlice beyin üzerinde sıvı argrose dökün ve anten lobları yukarı bakacak şekilde argrose içinde örnekleri yönlendirmek. Argrose katılaşmış sonra, tek bir beyin içeren argrose bireysel blokları kesmek ve bir hidrofobik örgü alt ve iyi başına PBS 600 mikrolitre ile bir sepet ile yüklü 24 iyi plaka her kuyu doldurmak için bir neşter kullanın. Sonra, her argrose blok beyin dokusunun 70 mikrometre kesitleri elde etmek için bir vibratom kullanın.

Tek bir beyinden gelen kesitleri elde edilen sepetin örgüsünün üzerine yerleştirmek. Standart protokollere göre, forofororon konjuge antikorlar ile bölümleri etiketledikten sonra, montaj ortamı bir damla kullanarak tek bir beyinden bölümleri ile her slayt gömmek ve floresan mikroskopi ile örnekleri görselleştirmek. Anti-RDL etiketler vahşi tip frontal bölümünde nöropiller, ama CRISPR-Cas9 RDL nakavt arı beyinleri.

Anti-mGlutR1 antikorları için benzer bir özgüllük gözlendi. Bu temsilde, rdl CRIPSR-Cas9 enjekte arı beyinlerinde kantitatif PCR bırakma testleri, floresence göreli azalma örnekte değiştirilmiş kılavuz DNA sayısına karşılık geldi. mGlutR1 CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra, kılavuz DNA'nın göreceli modifikasyonu enjekte edilen arıların beyinlerinde enjekte edilmeyen arıların beyinlerinde gözlenen kılavuz DNA ile karşılaştırıldığında yaklaşık %59 idi.

Bu kantitatif RT-PCR inader ayrı bir grupta haberci RNA RDL göreli azalma yaklaşık% 59 enjekte arılarda RNA düzeyine göre, ve enjekte arılarda haberci mGlutR1 RNA göreli azalma yaklaşık% 53 önemli oldu, ocelli üzerinden RDL CRISPR-Cas9 enjeksiyonu her zaman beyin hücrelerinin çok sayıda ulaşmak olmayabilir. Örneğin, bu preparatlarda sekiz kişiden sadece birinde diğer arı beyinlerine göre çok sayıda beyin hücresi bulunan RDL CRISPR-Cas9 vardı. RDL CRISPR-Cas9 protocerebrum hücreleri içinde yoğunlaşmış ile, ama anten lob.

Dondurulmuş ve yeniden dondurulmuş RNA önlemek için emin olun. Arıları aşırı soğutmamaya dikkat edin. Şişede hareket etmeyi bıraktıktan hemen sonra onları dizginleyin.

Bu teknik mantar gövdesi ve bal arısı davranışı üzerinde merkezi kompleks inhibitör iyonotropik ve metabotropik reseptörlerin azaltılması etkilerini incelemek için kullanılabilir.