Name: CRISPR-Cas9 kullanılarak Bal Arısı Beyin Bölümlerinde Anti-RDL ve Anti-mGlutR1 Reseptörleri Antikor Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Keşfedin bal arısı beyinlerinde CRISPR-Cas9 gen düzenleme ile GABAA ve glutamat reseptörlerinin öğrenme ve hafızadaki rollerini. Bu yöntem antikor spesifitesini test etmek için de kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma BHS: Human Frontiers Science Program'a verilen ödüllerle desteklenmiştir; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Fikirler Lab (1556337). DmGluRA için peptid ve antikorlar Dr Serge Birman (Marsilya, Luminy, Fransa) laboratuvar da zaman IS Program d'Urgence FRM / Postdocs UFP20060306548 fondation pour la Recherche Medicale tarafından desteklendi tasarlanmıştır. Biz Daniela Junqueira Marosi ve Alex Hanter Entegre DNA Teknolojisi (IDT) RDL kılavuzları ve qPCR bırakma tahlilleri tasarımı ile yardım için müteşekkiriz.

<ol><li>Harms, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System.</a> Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Kouranova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRs+for+Optimal+Targeting%3A+Delivery+of+CRISPR+Components+as+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+Cultured+Cells+and+Single-Cell+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos.</a> Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).</li>
<li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+tracrRNA+provides+efficient+genome+editing+while+allowing+cellular+microscopy+and+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis.</a> Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).</li>
<li>Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+metabotropic+glutamate+receptor+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%3A+implications+for+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation.</a> Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).</li>
<li>Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+two+GABA+receptor-like+subunits+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS.</a> Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).</li>
<li>Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+cyclodiene+insecticide+resistance-associated+mutations+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects.</a> Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).</li>
<li>Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GABA%28A%29+receptor+RDL+acts+in+peptidergic+PDF+neurons+to+promote+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila.</a> Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).</li>
<li>Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+intracellular+loop+variants+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29+RDL+GABA+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor.</a> Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).</li>
<li>Jones, A. K., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cys-loop+ligand-gated+ion+channel+superfamily+of+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera.</a> Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).</li>
<li>Dupuis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homomeric+RDL+and+heteromeric+RDL%2FLCCH3+GABA+receptors+in+the+honeybee+antennal+lobes%3A+two+candidates+for+inhibitory+transmission+in+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing.</a> Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).</li>
<li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li>
<li>Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNAi+knockdown+effect+of+tyramine+receptor+1+induced+by+dsRNA+and+siRNA+in+brains+of+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera.</a> Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).</li>
<li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+switch+for+worker+nutrition-mediated+traits+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees.</a> PLOS Biology. 17 (3), e3000171(2019).</li>
<li>Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Knockout+Mutants+by+CRISPR%2FCas9+in+the+European+Honeybee%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Science+%28BIOONE%29%22%5BJournal%5D)">Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L.</a> Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).</li>
<li>Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing+in+Honeybee+Apis+mellifera+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).</li>
<li>Smith, B. H., Burden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proboscis+Extension+Response+Protocol+for+Investigating+Behavioral+Plasticity+in+Insects%3A+Application+to+Basic%2C+Biomedical%2C+and+Agricultural+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51057(2014).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).</li>
<li>Rodriguez, J., Deinhardt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+semipermanent+mounting+medium+for+fluorescent+antibody+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies.</a> Virology. 12, 316-317 (1960).</li>
<li>Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).</li>
<li>Bonnafe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+thymol+application+on+olfactory+memory+and+gene+expression+levels+in+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollutant+Research+%28International%29%22%5BJournal%5D)">Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera.</a> Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honeybee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Anti-RDL ve anti-mGlutR1 karakterizasyonu İlk olarak, anti-RDL ve anti-mGlutR1 antikorlarını sabit bal arısı beyin dilimlerinde immünoblot ve pre-adsorpsiyon ile karakterize ettik. Her antikor bilinen tüm izoformları tanımak için yapıldı, ve Batı analizi onların öngörülen molekül ağırlıklarına karşılık gelen bantları tanıdıklarını gösteriyor. Daha sonra, her iki antikor da bal arısı beyin kesitlerinde üretildikleri konjuge peptid tarafından bloke edildi.
Çalışmamızdaki ilk amaçlardan biri, spesifik konjuge peptide karşı üretilen antikorların sabit beyin dokusundaki proteinine özgü olduğunu saptamaktı. Bu amaçla CRISPR-Cas9 sisteminden yararlandık. Bal arısı RDL ve mGlutR1 için özel kılavuzlar tasarladık ve her birini CRISPR-Cas9'u floresan prob ATTO550 ile etiketlenmiş yapmak için kullandık. Her reseptör için, biz ocelli üç farklı CRISPR-Cas9 ribonükleoproteinlerin bir karışımı enjekte yetişkin bal arısı beyninde hedeflenen protein miktarını azaltmak için bizim tasarlanmış Cas9 sistemi aldı hücrelerde karşılık gelen geni ortadan kaldırarak. Çalışmamızda bu adımı başardık.
Bu deneylerin başarısı için ilk önemli adımlardan biri uygun kılavuz RNA'lar tasarlamaktır. Gen dizisinin başında, ortasında ve sonunda bulunan en fazla beş kılavuz RNA tasarlamanızı öneririz. İlk çalışmamızda, onları üç ila beş arı üzerinde çeşitli kombinasyonlarda test ettik. Ayrıca enjeksiyonlar farklı konsantrasyonlarda çalıştı, enjeksiyon sonrası kez, ve enjeksiyonlarda RNP çeşitli karışımları. Beyinleri inceledik ve anti-RDL ve anti-mGlutR1 antikorları kullanarak inceledik. Bu ilk testlerde, enjeksiyon için uygun kombinasyonu, enjeksiyon sonrası zamanı ve enjeksiyon için CRISPR-Cas9 konsantrasyonunu ve miktarını belirledik. Bu ilk testler burada ayrıntılı olarak açıkladığımız deneyleri ayarlamak için temel teşkil ediyordu.
Amaç iki aşamalıydı: 1) bir arıda antikor boyamamızın CRISPR-Cas9 ile tedaviden sonra azaldığını ve 2) davranışsal çalışmalar için en iyi deneysel koşulları gözden geçirmek olduğunu göstermekti. Bu nedenle, birçok hücre çekirdeği enjeksiyondan sonra CRISPR-Cas9 48 h içeriyorsa, anti-RDL ve anti-mGlutR1 boyama nın azaltılmasının önemli olduğunu gösteriyoruz. Ayrıca, test edilen antikorların özellikle bal arısı beyin hazırlığında mGlut1 ve RDL proteinini tanıdığını ve bal arısı beyninde lokalizasyon çalışmaları için kullanılabileceğini göstermektedir.
Davranışsal çalışma için crispr-Cas9'un deneysel ayarı Daha sonra, CRISPR-Cas9'un davranış salçalarında kullanılabilsi için deneyleri kurduk. Sekiz ya da dokuz bal arıları kontrol ve deneysel tedaviler için toplandı. Enjeksiyondan önce ve sonra davranışsal olarak test edildiler ve daha sonra beyinleri atto550 ve/veya immünositokimya için incelenmiş ve hedef proteinin azaldığını gösteren beyin bölgelerini saptamaktadır. Burada, bir dizi deney için alınan arı sayısının kontrol ve deneysel koşullar için en fazla 8-9 arı ile sınırlı olduğunu belirtmek gerekir. Bu şekilde her iki koşul da aynı gün test edilebilir. Ayrıca CRISPR-Cas9 karışımlarını enjeksiyon için hazırladığımız da olmadı. CRISPR-Cas9 karışımı 3 gün üst üste kullanıldığında potens değişmedi ve 4-8 °C'de tutuldu. Ancak, biz 3 gün sonra test etmedi.
Her iki deneysel enjeksiyon seti ve her iki antikor için sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi, test edilen 16 arıdan sadece üç arı mantar gövdesi, protoerebrum ve anten loblarında büyük bir dağılım ATTO550 gösterdi. Diğer tüm arılarda CRISPR-Cas9'un dağılımı mantar gövdesi, merkezi kompleks ve/veya posterior protocerebrum ile sınırlıydı. Bu enjeksiyon yöntemi kullanılarak hedef proteinin azaltılması arıların çoğunda mantar vücut sadece sınırlı olacağını herhangi bir davranış çalışmaları için anlamak esastır. Bu anten lob veya subesophageal ganglion genişletmek olmaz. Bu nedenle, kullandığımız enjeksiyon tekniği mantar gövdesi ve merkezi kompleksteki reseptörlerin azaltılmasının etkisini davranışsal deneylerde incelemek için uygundur, CRISPR-Cas9'u tanıtmanın farklı bir yöntemi ise diğer beyin bölgelerinin incelenmesi için daha uygun olacaktır.
Sonuç olarak, çalışmamız CRISPR-Cas9'un beyinde antikor boyama için bir kontrol olarak başarılı bir şekilde uygulanmasını göstermiştir. Her iki antikoriçin (anti-RDL ve anti-mGlutR1), mGlutR1-CRISPR-Cas9 veya RDL-CRISPR-Cas9 alımı başarılı olduğunda, karşılık gelen antikor boyama düzeyi de önemli ölçüde azaltıldı. Ayrıca, ocelli enjeksiyon homojen değildi beyinde CRISPR-Cas9 bir dağılıma yol açtığını belirtmek önemlidir. Dağılım, ocelli ve mantar vücudunu çevreleyen minimal bir alandan tüm beyindeki birçok hücreye kadar değişmekteydi. MGlutR1-veya RDL-CRISPR-Cas9 alımının hücreler tarafından değişkenliği büyük olasılıkla enjeksiyonlarda farklılıklara bağlıydı. Verilerimiz CRISPR-Cas9 sisteminin bal arılarında çalıştığını göstermektedir, ancak crispr-Cas9 alımının tek tek arı beyinleri arasında değişkenliğini azaltmak için enjeksiyon yönteminin geliştirilmesi gerekmektedir. Bu kısıtlamalar içinde, artık davranışsal deneyler için yetişkin arılarda genleri işlemek için bu tekniği kullanmak mümkündür.

Yakın zamanda keşfedilen CRISPR/Cas9 sistemi, çeşitli model sistemlerinde ve organizmalarda genomik DNA'yı değiştirmek için kullanılan güçlü bir araçtır. Genom modifikasyonunu önceki yöntemlere göre daha verimli ve sağlam hale getirerek biyomedikal araştırmaları ve önemli teknolojik atılımları hızlandırmıştır1. S. pyogenes bakterilere özgü olan sistem, aktivitesi DNA'da çift iplikli kırılmalara (DSB) yol açan cas9 enonukleazve Cas9 proteinini belirli, diziye bağlı bir konuma yönlendiren bir kılavuz RNA'ya (gRNA) dayanır2. CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan çift iplikli molalar homolog olmayan son birleştirme (NHEJ), frameshifts yol açabilir bir hata eğilimli bir süreç veya bir donör şablonu mevcut olduğunda homoloji doğrudan onarım yoluyla onarılabilir. GRNA kendisi bir hedefe özgü CRISPR RNA (crRNA) ve evrensel bir trans-aktive crRNA oluşur (tracrRNA) kimyasal olarak sentezlenebilir ve bir ribonükleoprotein kompleksi olarak saflaştırılmış Cas9 nükleaz ile teslim edilebilir (RNP)2,3. gRNA veya Cas9 nükleazının floresan etiketlemesi, moleküler bileşenlerin floresan mikroskopi ile algılanmasına ve hücre içi görselleştirilmesine olanak sağlayabilir4.
Mevcut çalışmamızda crispr-Cas9 sisteminden yararlanarak yetişkin bal arısı beyinlerindeki protein seviyelerini azaltıyoruz. Metabotropik glutamat reseptörü (mGluR) ve anti-mGlutR1 reseptör antikorları ve GABAA reseptör alt birimi RDL ve anti-RDL antikorları üzerinde çalıştık. Yetişkin bal arının beynindeki protein miktarını azaltmak için basit bir yöntem geliştirdik ve buna karşılık gelen proteinlere karşı geliştirilen antikorların ek testlerini yapmak için kullandık. CRISPR-Cas9 floresansının izlenmesi, proteinin azaltılmasında rol oynayan alanları ve hücreleri tahmin etmemizi sağladı.
Bu yöntemi kullanarak, biz de konjuge peptid karşı tavşan yapılan anti-mGlutR1 antikorlar karakterize. Bal arısı genomu yüksek derecede korunmuş AmGluRA kodlar (NCBI adlandırma göre mGlutR1 adlı) metabotropic glutamatreseptörü 5. Bal arısı mGlutR1 geni, NCBI veritabanına göre tahmin edilen dört splice varyantına sahiptir. Hem pupal hem de erişkin arı evrelerinin merkezi sinir sisteminde (CNS) ifade edildiği ve uzun süreli hafıza oluşumunda rol aldığıbildirilmiştir 5. mGlutR1'e karşı geliştirilen antikorlar bal arılarında öğrenme ve hafıza sürecinde glutamaterjik sistemin incelenmesi için gerekli bir araç olabilir.
Çalışmalarımızda, Apis mellifera RDL reseptör alt ünitesinden konjuge peptidler ile aşılanmış tavşanlarda geliştirilen anti-RDL antikorlarını da karakterize ettik. Bal arısı Rdl geni AmRdl (XM_006565102.3, NCBI veritabanı), 14 tahmin edilen splice varyantları vardır. NCBI veritabanı AF094822.1'de kısmen klonlanmış bir parça bildirilmiştir. RDL reseptör fonksiyonu ve fizyolojisi iyi böcekler de çalışılır6,7,8, bal arıları dahil9,10,11. Anti-RDL karşı geliştirilen antikorlar bal arılarında öğrenme ve hafıza sürecinde GABAerjik sistemi incelemek için önemli bir araç olabilir.
Ahtapotamin ve tiramin reseptörlerinin rolü üzerinde daha önceki bir çalışmada RNAi Batı leke tarafından protein miktarının sonraki bir test ile beyne enjekte kullanılan12,13. Ancak, RNAi bazı önemli sınırlamalar vardır. RNAi enjeksiyonundan sonra protein indüksiyonunun oluştuğu sadece kısa bir zaman dilimi vardır13. CRISPR-Cas9 bal arısı embriyolarında çok yakın zamanda tüm hayvan14,15,16genleri silmek veya değiştirmek için kullanılmıştır. Biz yetişkin bal arısı protein miktarını azaltmak için CRISPR-Cas9 kullanımını bildirdi. Biz kontrollü laboratuvar koşulları altında öğrenme ve bellek davranışsal çalışmalara çift yeteneği nedeniyle bal arıları için bu yaklaşımı geliştirdi17.
Bu çalışmada, iki reseptöre karşı antikorlar geliştirdik ve protein CRISPR-Cas9 enjeksiyonu ile azaltıldıktan sonra yetişkin bal arısı beyin bölümlerinde test ettik. Aynı zamanda, davranışsal deneyler için yöntemin kullanılmasına olanak sağlayan deneysel bir tasarım oluşturduk.

<table><tbody><tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283_100 mL</td><td>batı lekeleme</td></tr><tr><td>Akrilamid-bis Akrilamit</td><td>Bio-Rad</td><td>500 mL 1610156</td><td>batı lekeleme</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-250g</td><td>bal arısı beynini bloklara sabitlemek için damıtılmış su ile kullanılır</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Parça Eşek Anti-Tavşan IgG (H+L)</td><td>Jackson Araştırma Laboratuvarları</td><td>711-546-152</td> tavşan Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO IDT'den <td>birincil antikorları ortaya çıkarmak için ikincil antikor</td></tr><tr><td></td><td></td><td>tasarlanmış</td><td>kılavuz RNA ile 1075934, gRNA</td></tr><tr><td>oluşturur Alt-R SP Cas9 nükleaz V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td>CRISPR sistemi için ribonükleoprotein yapmak için kullanılan enzim</td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat</td><td>Bio-RAD</td><td>10 g 1610700</td><td>batı lekeleme</td></tr><tr><td>Anti-mGlutR1 antikorları</td><td>Covalab (FRANSA)/21st Century Bu</td><td>makaledeki yazarlar tarafından karakterize</td> edilen biyokimyasal <td>Bal arılarında mGlut 1'in birincil inkübasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-RDL antikorları</td><td>21. Yüzyıl Biyokimyasal</td><td>Bu makaledeki yazarlar tarafından karakterize</td> edilmiştir <td>Bal arılarında RDL'nin birincil inkübasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001154</td><td>proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Barraquer İris Makas 7mm Bıçak Keskin nokta</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>14128-G</td><td>diseksiyon için kullanılır bal arısı beyni</td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td>proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Bıçak tutucu için bıçak (kırılabilir)</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>10050-00</td><td>batı lekeleme için diseksiyon</td></tr><tr><td>Bıçak tutucu ve kırıcı</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>15309</td><td>diseksiyon batı lekeleme için</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Enjeksiyon prosedürü için</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100 F</td></tr><tr><td>Kemilüminesan batı leke tespit substratı</td><td>Bio-Rad</td><td>1705062</td><td>batı lekeleme</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472476-50mL</td><td>RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td>batı lekeleme</td></tr><tr><td>DNA kolay kiti</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>DNA ekstraksiyonuj</td></tr><tr><td>DNA içermeyen kit</td><td>INVITROGEN</td><td>AM1907</td><td>DNA'yı çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipet, 3'lü paket</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Kuyulu Polistiren Çok Kuyulu</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>Çok</td></tr><tr><td>Kuyulu Düz Tabanlı Gömme Kapsüller, Polietilen Elektron</td><td>Mikroskobu Beyin</td> bölümleri için Science <td>70021</td><td>sepeti</td></tr><tr><td>Forseps Dumont #5 (çift)</td>Bal <td>arısı beyninin kafadan diseksiyonu için</td> <td>Güzel Bilim Aracı</td><td>11254-20</td></tr><tr><td>Forseps Dumont #5S (çift)</td><td>Beyni trakea befor diseksiyonundan temizlemek için</td> <td>Güzel Bilim Aracı</td><td>11252-00</td></tr><tr><td>Gen Ekspresyonu Master Mix</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>1055770</td><td>qPCR bırakma testi</td></tr><tr><td>Pelabsiyon</td><td>kontrolü için peptit konjugatlarının hazırlanmasında kullanılan</td>glutaraldehit <td>EMS</td><td>16220</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500 mL</td><td>batı lekeleme, gömme ortamı</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Bio-Rad</td><td>1610718</td><td>batı lekeleme</td></tr><tr><td>Hidrofobik filtreli naylon örgü</td><td>Spectrum Labs</td><td>145910</td><td>beyin bölümleri için sepetin dibi için</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030-50mL</td><td>RNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Anahtar deliği limpet hemosiyanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7017</td>, <td>kontrol için konjugatların hazırlanmasında kullanılır</td></tr>, <tr><td>LSM800 kofokal mikroskop</td>, <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mGlu_Guide 1</td>, <td>IDT,</td><td></td><td>CRISPR-Cas 9 için tasarlanmış kılavuz RNA. </td></tr><tr>CRISPR-Cas 9<td>için 2</td><td>IDT</td><td></td> tasarlanmış kılavuz RNA'mGlu_Guide hedef mGlutR1 genom dizileri<td>. CRISPR</td></tr><tr>için<td>3</td><td>IDT</td><td></td> tasarlanmış kılavuz RNA mGlu_Guide mGlutR1 genom dizilerini <td>hedefleyin. Hedef mGlutR1 genom dizileri</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>batı blotlama</td></tr><tr><td>96 oyuklu PCR mikroplaka</td><td>Uygulanan biyosistem</td><td>4346907</td><td>qPCR bırakma testi ve qRT-PCR</td></tr><tr><td>384 kuyulu PCR mikroplaka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z374911</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Enjeksiyon</td><td>prosedürü için</td>mineral yağ <td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904_500mL</td></tr><tr><td>Model p87 Alevli Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Kılcal Hazırlama</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td> gömme <td>çözeltisi için</td></tr><tr><td>Nanolitre 2000</td><td>Dünya Hassas Aletler Nanolitre</td><td></td><td>Enjeksiyon Aparatı</td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson Araştırma Laboratuvarları</td><td>AB_2337258</td><td>immünositokimya için bloke edici ajan</td></tr><tr><td>İmmün olmayan Keçi Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>50-062Z 100 mL</td><td>immünoblotlama için bloke edici ajan</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen tampon</td><td>IDT</td><td>1072570</td><td>CRISPR-Cas9 enjeksiyonunun hazırlanmasında kullanılan nükleaz içermeyen</td></tr><tr><td>tampon Nükleaz içermeyen su</td><td></td><td>IDT AM9337</td><td>CRISPR-Cas 9 sisteminin hazırlanmasında kullanılan nükleaz içermeyen su</td></tr><tr><td>OrbitalShaker Mp4</td><td>Genemate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500 g</td><td>, arı beyinleri için fiksatif yapmak için PBS ile birlikte kullanılır</td></tr>. <tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250 mg</td><td>proteaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponu Salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Fiksatif olarak Paraformaldehit ile birlikte kullanılır; antikorlar için tampon</td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 kullanılarak bal arısı beyin bölümlerinde anti-rdl ve anti-mglutr1 reseptörleri antikor testi

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Küme Düzenli Olarak Uzaydan Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili protein 9 (Cas9) gen fonksiyonu çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir gen düzenleme tekniğidir. Bu çalışmada, haşere GABAA reseptör alt birimi Dieldrin direnç (RDL) ve metabotropik glutamat reseptör mGlutR1 (mGluRA) karşı geliştirilen antikorların özgüllüğünü kontrol etmek için bu yöntemi kullanın. Antikorlar tavşanlarda meyve sinerelerine özgü konjuge peptidlere(Drosophila melanogaster)ve bal arılarına(Apis mellifera)karşı üretilmiştir. Bu antikorları bal arısı beyinlerinde reseptörlerin dağılımını incelemek için bal arısı beyin bölümlerinde kullandık. Antikorlar peptide karşı saflaştırılmış ve immünoblotting ve peptid konjugat ile preadsorpsiyon klasik yöntem ile antikorlar karşı yetiştirilen karşı ilgili peptid konjugat özgü olduğunu göstermek için test edildi. Burada, ilgili reseptör için tasarlanmış kılavuz RNA'lar ile CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra beyindeki protein hedeflerinin 48 h azaltılmasını test etmek için CRISPR-Cas9 tekniğini geliştirdik. CRISPR-Cas9 yöntemi, bir veya birden fazla genin değiştirilmesi gerektiğinde yetişkin arılarda davranışsal analizlerde de kullanılabilir.

Anti-RDL antikor testleri Antikorlar Şekil 1A'dagösterildiği gibi RDL peptid konjugatlarına karşı üretildi. Anti-RDL antikorları karakterize ilk adım anti-RDL antikorları ve HRP etiketli keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor(Şekil 1A, eklemek) ile batı leke kullanarak arı beyninden çıkarılan proteinhomojen kontrol etmektir. Her iki anti-RDL antikorları ~ 50-60 kD (ok) bulunan bant tanıdı, RDL alt birim isoform proteinlerin tahmini ağırlığına karşılık. Anti-RDL antikorlarının beyin dilimlerindeki peptidi tanıdığını göstermek için bir pizsorpsiyon kontrolü kullandık (Şekil 1B,C). Antikorlar konjuge peptidlerle preincubated edildiğinde, kesitteki lekelenme yoktu. Bu, anti-RDL antikorlarının yetiştirildikleri konjuge peptidi tanıdığını göstermiştir. Anti-RDL antikorlarının sabit beyin dokusundaki proteini tanıdığını göstermek için hücrelerde RDL proteini üreten RDL genini yok etmek için CRISPR-Cas9 kullandık. Şekil 1D1-3,anti-RDL antikorları ile etiketlenmiş kontrol frontal arı beyin kesitleri gösterir. Bu arıRDL-CRISPR-Cas9 RNP enjekte edilmedi. Şekil 1D1'de,arı beyninin ön kısmında anti-RDL etiketleri nöropiller. Şekil 1D2'deki aynı frontal bölüm ATTO550'den floresan olmadığını göstermektedir, çünkü RDL-CRISPR-Cas9 kompleksi enjekte edilmemese.
Şekil 1E1-E3, RDL-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen ve daha sonra Şekil 1D1-D3'tekikontrol beyniyle aynı miktarda antikor ile işlenen bir arının beyin bölümünü gösterir. Anti-RDL boyama enjeksiyondan sonra tüm beyinde 48 saat önemli ölçüde azaldı ve beyindeki ATTO550 boyama dağılımı(Şekil 1E2) arorta ocelli RDL-CRISPR-Cas 9 enjeksiyonlarının başarısını gösterir. Beynin birden fazla dağınık hücreleri ATTO550 sergiler. RDL-CRISPR-Cas 9'un başarılı enjeksiyonu, protein ekspresyonunu kontrole göre azaltmıştır(Şekil 1E1-3). Sekiz immünosül arı beyninden, sadece bir beyin mantar vücut hücrelerinde RDL-CRISPR-Cas9 dağılımı yüksek düzeyde vardı, protoerebrum, ve anten lob, diğer beyinler mantar vücut kalyx ATTO550 ile hücre boyama vardı ise, merkezi kompleks, ama anten lob değil. Bu arılarda, redüksiyon anti-RDL immünboyama şekil 1E1'degösterilen beyindeki kadar dramatik olmadığını belirtmek önemlidir.
Daha sonra, RDL-CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra arılar 48 h'deki modifiye RDL gDNA düzeyini tahmin etmek için, bırakma sondasının RDL gRNA'larından birinin alanına uyacak şekilde tasarlandığı bir qPCR bırakma testi gerçekleştirdik. Bu deneylerde, RDL-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen arı beyinlerinde floresan'ın göreceli azalması örneklerdeki modifiye gDNA sayısına karşılık gelmektedir. Testlerimizde RDL-CRISPR-Cas9 enjekte edilen 12 arıda gDNA'da bu kılavuza karşılık gelen alan enjekte edilmeyen arılarda gDNA ile karşılaştırıldığında % 64 ± (ortalama ± 0 SD) idi(Şekil 3A).
Daha sonra, enjeksiyondan sonra 48 h arılarda RDL RNA düzeyini tahmin etmek için ayrı bir arı grubunda qRT-PCR uyguladık (Şekil 3B). RDL-CRISPR-Cas 9 enjekte edilen arıların RDL RNA düzeyini (n = 19) enjekte edilmedi arılarda RNA düzeyi ile karşılaştırdık (n = 12). Bu deneylerde mRNA RDL'nin bağıl azalması enjekte edilmeyen arılarda RNA düzeyine kıyasla Y ± (ortalama ± SE) idi. Her arıdaki RDL RNA düzeyini tek tek incelediğimizde, 19 arıdan sadece 13'ü RNA'da önemli bir azalma göstermiştir. Bu veriler, rdl-CRISPR-Cas9'un ocelli üzerinden enjeksiyonunun her zaman çok sayıda beyin hücresine ulaşamayabileceğini göstermektedir, bu da RDL immün lekeli RDL-CRISPR-Cas9 enjekte edilen arılarla ilgili verileri doğrulamaktadır. Bu preparatlarda, 8 arıdan sadece birinde rdl CRISP-Cas9 birçok beyin hücrelerinde (mantar gövdesi, protocerebrum ve anten lob) diğer arı beyinleri ile karşılaştırıldığında, RDL-CRISPR-Cas9 dağılımı protocerebrum (mantar vücut kaliks ve merkezi kompleks) hücrelerinde yoğunlaşmıştır ama anten lob(Şekil 4A-D)vardı.
Anti-mGlutR1 antikor testleri Tavşanda üretilen anti-mGlutR1 antikorlarını Drosophila melanogaster'e özgü konjuge peptidlere karşı kullandık (Şekil 2A). Bu peptid in dizilimi arı peptidi (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Şekil 2A<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig1a.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig2a.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59993/59993fig4a.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59993/59993fig4large.jpg" target="_blank"></a>

Burada sunulan bir protokol antikor özgüllüğünü test etmek için yetişkin bal arısı beyninde bir protein üretimini azaltmak için CRISPR-Cas9 sistemi kullanmaktır.

CRISPR-Cas9 kullanılarak Bal Arısı Beyin Bölümlerinde Anti-RDL ve Anti-mGlutR1 Reseptörleri Antikor Testi

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

İlk defa yetişkin bal arısı beyninde nöronların alt kümelerinde iyonotropik GABAA ve metabotropik glutamat reseptörleri için kodlanmış genlerin bir modifikasyonu kurduk. CRISPR-Cas9 gen düzenleme kontrollü laboratuvar koşulları altında öğrenme ve bellek rollerini keşfetmek için yetişkin arı beyinlerinde bir veya birden fazla gen değiştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem, erişkin arılarda spesifik proteinlerin işlevini incelemek ve antikorların ilgili proteinlere karşı özgüllüğünü test etmek için kullanılabilir.Irina Sinakevitch ile prosedürü gösteren Lev Kurtzman ve Hyun Choi, benim laboratuvar eski lisans olacak. CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra rdl ve mGlutR1 ekspresyonunu immünositokimyasal analiz ile test etmek için, ilk olarak, apis mellifera, RDL ve mGlutR1 kılavuz DNA dizisini kullanarak kılavuzları tasarlamak için çevrimiçi CRISPR-Cas9 aracını kullanın. Her kılavuz RNA için kılavuz RNA karmaşık oluşumları hazırlamak için, kılavuz RNA adı ile her kılavuz için bir test tüpü etiketve nükleotit içermeyen tampon 92 mikrolitre, 100 mikromolar florofor dört mikrolitre, CRISPR RNA transactivating etiketli ve her tüp için uygun kılavuz RNA çözeltisi dört mikrolitre ekleyin.Tüm malzemeler eklendiğinde, çözeltileri nazikçe karıştırın ve çözeltiyi tortulamak için tüp içeriğini beş saniye boyunca tezgah üstü bir santrifüjde döndürün. Ardından, çözümleri 5 dakika boyunca 95 dereceye kadar saklayarak bir kılavuz RNA kompleksi ve ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık soğuma oluşturun. Ribonükleoprotein kompleks oluşumları hazırlamak için uygun etiketli tüplere her kılavuz RNA çözeltisinin altı mikrolitreve mikrolitre Başına 0,5 mikrolitre SP-Cas9 nükleaz V3 ekleyin.Nazik karıştırma sonra, enjeksiyon için RNP ribonükleoprotein karışımları yapmak için 10 dakika boyunca 37 derece santigrat çözeltiler kuluçka, kuluçka sonunda uygun RDL her ribonükleoprotein dört mikrolitre ekleyin. Bir kontrol yapmak için, kılavuzsuz RNA çözeltisi dört mikrolitre tracer RNA ile 92 mikrolitre tampon ve dört mikrolitre su karıştırın. Su ilavesi sonra, 95 santigrat derece beş dakika boyunca çözelti tutun ve oda sıcaklığına ulaşana kadar karışımı soğumasını bekleyin.Daha sonra, kılavuzsuz RNA çözeltisinin altı mikrolitresini, mikrolitre Başına 0,5 mikrogramlık altı mikrolitre cas9 nükleaz V3 ile karıştırın. Ribonükleoprotein karışımı enjeksiyonu için, şişelerde küçük bir delik ile tek tek arıları yakaladıktan sonra, arıları buzüzerinde en fazla üç dakika hareketsiz hale getirin ve her arıyı koli bandı ile önceden hazırlanmış metal tutuculara sabitleyin. Arka göğüs kafesi, kanatları ve kafası açıkta. Arıları aç kalmadan tek azılı sakkaroz çözeltisi ile beslemek için beş mililitrelik bir şırınga kullanın ve güvenli arıları nem için ıslak kağıt havlulu bir kutuya yerleştirin.Daha sonra, iki 35 mililitre petri yemekleri kapaklarının içine balmumu yerleştirin ve balmumu üzerine yemeklerin dipleri yerleştirin. Her kabın kapağı ve alt arasında bir azı sakaroz enjekte edin ve bir cam slayt ile beyaz kutu içine bir besleme petri çanak yerleştirin ve bir cam slayt ile siyah kutu içine diğer yerleştirin. Daha sonra, her kutuya küçük bir tarak yerleştirin ve RDL CRISPR-Cas9 karışımı ile bir mikroenjeksiyon sistemi yükleyin.RDL CRISPR-Cas9 enjeksiyonu için, sekiz arının median ocelli'sini 345 nanolitre ribonükleoprotein RDL karışımı ile enjekte edin ve ardından arıları kara deneysel kutuya bırakmadan önce bir azı sakarozla besleyin. Herhangi bir enjeksiyon olmadan kontrol olarak sekiz arılar ikinci bir set beslemek ve beyaz kontrol kutusuna bırakın. Daha sonra, her iki kutuyu da ıslak kağıtla polistiren bir kap içine yerleştirin, arıları günde iki kez gözlemleyerek yeterli yiyecek ve iyi bir neme sahip olmalarını sağlayın.Enjeksiyondan 48 saat sonra arıları buzüzerinde 30 saniye hareketsiz hale getirin ve her böceğin kafasını kesmek için makas kullanın. PBS'de %4 paraformaldehit başlığını duman kaputunda bir diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin ve antenleri, bileşik gözleri ve üst dış iskeleti dikkatli ama hızlı bir şekilde çıkarmak için barraquer iris makası kullanın. Başların ekso iskeletin geri kalanını kafadan ve kalan tüm trakeadan çıkarmadan önce 10 dakika boyunca fiksatif çözeltide oturmasını bekleyin.Daha sonra, her beyin yerleştirin 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içeren en az bir mililitre içeren 4% paraformaldehit bir gecede dört ila sekiz santigrat derece. Ertesi sabah, bir erlenmeyer şişesinde 50 mililitre distile suya 3,8 gram argrose ekleyin ve argrose sıvılaştırılana kadar mikrodalga çözeltisi. Yeni bir 35 milimetre petri çanak içine 3-4 sabit bal arısı beyinleri aktarın ve aşırı fiksatif kaldırmak için doku kağıt kullanın.Dikkatlice beyin üzerinde sıvı argrose dökün ve anten lobları yukarı bakacak şekilde argrose içinde örnekleri yönlendirmek. Argrose katılaşmış sonra, tek bir beyin içeren argrose bireysel blokları kesmek ve bir hidrofobik örgü alt ve iyi başına PBS 600 mikrolitre ile bir sepet ile yüklü 24 iyi plaka her kuyu doldurmak için bir neşter kullanın. Sonra, her argrose blok beyin dokusunun 70 mikrometre kesitleri elde etmek için bir vibratom kullanın.Tek bir beyinden gelen kesitleri elde edilen sepetin örgüsünün üzerine yerleştirmek. Standart protokollere göre, forofororon konjuge antikorlar ile bölümleri etiketledikten sonra, montaj ortamı bir damla kullanarak tek bir beyinden bölümleri ile her slayt gömmek ve floresan mikroskopi ile örnekleri görselleştirmek. Anti-RDL etiketler vahşi tip frontal bölümünde nöropiller, ama CRISPR-Cas9 RDL nakavt arı beyinleri.Anti-mGlutR1 antikorları için benzer bir özgüllük gözlendi. Bu temsilde, rdl CRIPSR-Cas9 enjekte arı beyinlerinde kantitatif PCR bırakma testleri, floresence göreli azalma örnekte değiştirilmiş kılavuz DNA sayısına karşılık geldi. mGlutR1 CRISPR-Cas9 enjeksiyonundan sonra, kılavuz DNA'nın göreceli modifikasyonu enjekte edilen arıların beyinlerinde enjekte edilmeyen arıların beyinlerinde gözlenen kılavuz DNA ile karşılaştırıldığında yaklaşık %59 idi.Bu kantitatif RT-PCR inader ayrı bir grupta haberci RNA RDL göreli azalma yaklaşık% 59 enjekte arılarda RNA düzeyine göre, ve enjekte arılarda haberci mGlutR1 RNA göreli azalma yaklaşık% 53 önemli oldu, ocelli üzerinden RDL CRISPR-Cas9 enjeksiyonu her zaman beyin hücrelerinin çok sayıda ulaşmak olmayabilir. Örneğin, bu preparatlarda sekiz kişiden sadece birinde diğer arı beyinlerine göre çok sayıda beyin hücresi bulunan RDL CRISPR-Cas9 vardı. RDL CRISPR-Cas9 protocerebrum hücreleri içinde yoğunlaşmış ile, ama anten lob.Dondurulmuş ve yeniden dondurulmuş RNA önlemek için emin olun. Arıları aşırı soğutmamaya dikkat edin. Şişede hareket etmeyi bıraktıktan hemen sonra onları dizginleyin.Bu teknik mantar gövdesi ve bal arısı davranışı üzerinde merkezi kompleks inhibitör iyonotropik ve metabotropik reseptörlerin azaltılması etkilerini incelemek için kullanılabilir.

anti-rdl-anti-mglutr1-receptors-antibody-testing-honeybee-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Bu yazının serbest uçan arılar için basit non-invaziv yöntemler yanı sıra ölçülü arıların kesin lokalize tedavi izin daha invaziv varyantları da dahil olmak üzere, bal arıları için farmakolojik ajanların uygulanması için çeşitli protokoller açıklanır.

Ölçülü ve Serbest uçan Bal Arısı Nörofarmakolojik Manipülasyon,<em&gt; Apis mellifera</em

Bu yazıda, özellikle digoxigenin (DIG) etiketli veya biotin etiketli problar kullanılarak böcek antenlerinde, düşük seviyeli Odorant Reseptör (OR) genleri ve diğer genler için yerinde hibridizasyon protokolünde ayrıntılı ve etkili bir RNA açıklanmaktadır.

Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Bal arısı beyin farklı bölgelerinde farmakolojik ajanların inhibitör etkileri Fosfolifaz C (PLC) üzerinde test etmek için biz bu bölgelerde PLC etkinliği ölçmek için biyokimyasal bir tahlil mevcut. Bu tahlil PLC etkinlik dokular arasında hem de farklı davranışlar sergileyen arılar arasında karşılaştırmak için yararlı olabilir.

Balarısı üzerinden beyin Homogenate Fosfolifaz C aktivite tespiti

Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.

Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Murin koroid pleksusunda insülin reseptör izoformları IR-A ve IR-B'yi haritalamak için bir Dubleks in situ hibridizasyon testi oluşturduk ve geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden geldik. Bu yüksek çözünürlüklü yaklaşım, beyin insülin sinyalizasyonu ve nörolojik bozukluklar için potansiyel izoform hedefli tedaviler hakkında yeni bilgiler sunan izoforma özgü ifadeyi ortaya çıkarır.

Murin Beyninde İnsülin Reseptörleri A ve B'nin RNA In Situ Hibridizasyon Testi ile Hassas Görselleştirilmesi

Burada, amplifikasyona hazır hücre lizzi, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR/Cas12a tahlilleri kullanarak Lotmaria passim ve Nosema ceranae gibi arı patojenlerinden DNA'yı tespit etmek için basit ve hızlı bir prosedürü açıklıyoruz.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Keşfedin bal arısı beyinlerinde CRISPR-Cas9 gen düzenleme ile GABAA ve glutamat reseptörlerinin öğrenme ve hafızadaki rollerini. Bu yöntem antikor spesifitesini test etmek için de kullanılır.

CRISPR-Cas9 kullanılarak Bal Arısı Beyin Bölümlerinde Anti-RDL ve Anti-mGlutR1 Reseptörleri Antikor Testi

Daha fazla video keşfet