Name: Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Öğrenin, optik temizleme ve immünolabeling kullanarak böbrek dokusunun üç boyutlu görüntülenmesini. Bu yöntem, büyük çok hücreli yapıların nicelendirilmesini sağlar ve tanısal yetenekleri artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T. S. DFG Alman Araştırma Vakfı (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) ve RWTH Aachen Tıp Fakültesi (RWTH Returner programı) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. V. G. P. Deutsche Gesellschaft kürk Nefrologie, Alexander von Humboldt Vakfı ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi araştırma Burslar tarafından desteklenmektedir. D. H. E, Fondation LeDucq tarafından desteklenmektedir. R. K. DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) devleti ve RWTH Aachen Üniversitesi 'nde klinik araştırmalar için disiplinlerarası Merkezi (O3-11) ' den hibe tarafından desteklenmektedir.

Not: Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Portland, Oregon, ABD ve Almanya 'nın Aachen kentinde ilgili yerel makamların kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1. retrograd abdominal aort perfüzyon ve fare böbrekleri Fikrasyonu
<ol><li>Çözümleri aynı gün veya akşam önce hazırlayın ve bir gecede bir buzdolabında saklayın. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) sıcak çözümler.</li>
	<li>
1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde% 3 paraformaldehit (PFA) taze bir toplu olun. Yaklaşık 50-100 mL PFA fare başına gereklidir.
	<ol>
<li>% 3 PFA 1 L yapmak için: PFA 30 g tartım ve duman kaputu damıtılmış su 800 mL ekleyin. 50-60 °C ' ye kadar karıştırın ve ısıtın. 70 °C ' nin üstünde ısınmayın. DIKKAT: PFA zehirli. PFA 'yı duman kaputunda hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça 2N NaOH birkaç damla ekleyin. PFA çözüme gider veya birkaç damla daha eklemek kadar birkaç dakika bekleyin. Bazı küçük parçalar çözülür olmaz.</li>
		<li>Solüsyonu ısıdan çıkarın. 50 mL 20X PBS ekleyin. RT buz üzerinde Chill.</li>
		<li>HCl ile f 7.3-7.4 ayarlayın. 1 L 'ye damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>0,22 μm filtreli 1x PBS ve% 3 PFA filtreleme yaparak çözülmemiş parçacıkları çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 L 1x PBS için heparin 1.000 birimleri ekleyin. 1x PBS 'de heparin ve% 3 PFA içeren 1x PBS 'yi ayrı 50 mL Plastik şırıngalar halinde aktarın. Not: Varsa, basınç kontrollü pompa 80-100 mmHg veya hidrostatik basınç (damla yöntemi, perfüzyon çözümleri yüksekliği: 160-200 cm hayvan) böbrek perfüzyon için kullanılabilir ayarlayın.</li>
	<li>PBS, PFA ve körelmiş 21 G kelebek iğne üç yönlü stopcock bağlayın. Tüm sistemde hava kabarcıkları olmadığından emin olun.</li>
	<li>15 mL konik tüpü etiketleyin ve 10 mL PFA 'yı içine yerleştirin.</li>
	<li>Derin anestezi bir erkek veya kadın C57BL/6 fare 12-24 kullanarak yaş 120 mg/kg vücut ağırlığı ketamin ve 16 mg/kg vücut ağırlığı xylazine. Hayvan cerrahiye geçmeden önce refleksleri pinching tarafından yanıt tam yokluğunda kontrol edilmelidir (örneğin, ayak tutam refleks).</li>
	<li>Hayvan anestezi bir cerrahi düzlem ulaştı sonra, onun arkasına diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Cerrahi bir makas kullanarak orta hat abdominal kesi ile karın açmak ve abdominal aorta maruz.</li>
	<li>Karın aortunu, eğri bir hemostat ile iliak arter için dallanma hemen yukarıda kelepçe. Sonra bir mikro serrafine ile böbrek arterlerin hemen altında abdominal aort kelepçe. Vannas makas ile iki kelepçeler arasında abdominal aort üzerinde küçük bir kesi (1 mm) olun. Kelebeği iğnesini yavaşça kesi içine takın ve abdominal aort açık olarak yırtmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Bir 5-0 ipek sütür ile sağ böbrek arter ligate ve perfüzyon ve fiksasyon için sadece bir böbrek gerekirse diğer analiz için sağ böbrek çıkarın.</li>
	<li>Mikro serrafine çıkarın, Vannas makas ile portal ven Transect ve hemen heparin içeren PBS 50 ml ile serpmek, sonra geçiş ve% 3 PFA 50 ml ile serpmek. Not: Abdominal aort ile yüksek perfüzyon basıncı, doku yoluyla daha iyi antikor difüzyon için böbrek tübülleri açmak için gereklidir. Kalp yoluyla perfüzyon böbrek tübülleri açmayabilir.</li>
	<li>Özenle perfüze böbrek toplayın ve delme veya doku sıkılması kaçının.</li>
	<li>Kapsülü çıkarın ve böbreği 1 mm kalınlığında koronal dilimlere keser. Dilim kalınlığını standartlaştırmak etmek için bir dilimleyici matrisini (malzeme tablosu) kullanın. Not: Alternatif olarak, bir vibratome kullanmayı düşünebilirsiniz.</li>
	<li>Yazılı 15 mL konik tüpte hazırlanan PFA ile böbrek dilimlerini batırın.</li>
	<li>10 mL PFA 'yı başka bir etiketli 15 mL Konik Tüpe dağıtın. Sonraki fare geçmeden önce PBS ile üç yönlü stopkoku ve kelebek iğne Flush.</li>
	<li>RT 'de gün ışığına karşı korunan bir gece sonrası sabitleme gerçekleştirin.</li>
</ol>2. doku hazırlama ve Immünostasyon
<ol><li>Post-fiks sonra, iki kez 1x yıkama tampon (malzeme tablosu) ile 1 saat RT yatay rocker üzerinde böbrek dilimi yıkayın.</li>
	<li>Antigen alma gerçekleştirin. 500 mL 'lik, 92-98 °C ' ye kadar 300 mL 1x antijeni maskeleme çözeltisi (TAble malzeme) ısı. 92-98 °C ' de 1 h için karıştırma ile ısıtılan tampona geçirgen kaset katıştırma dilimi içine alın. Isı kabı çıkarın ve RT serin bırakın. Not: Bazı satıcılar bağışıklık Histokimya uygulaması için antikorlarını test eder ve veri sayfasında önerilen bir antijen alma yöntemini içerir. Bu nedenle, bazı epitopları daha temel bir tampon gerektirebilir (örn., pH 9).</li>
	<li>Dilimi, 0,1% Triton X-100 ve kaya olarak bir gecede RT 'de 10 mL 1x yıkama tamponu içine aktarın. dilimlerini 2x ile 10 mL taze 1x yıkama tamponunu ertesi gün 1 saat yıkayın.</li>
	<li>Normal antikor seyreltici (malzeme tablosu) 500 μL 'de primer antikor seyreltilebilir. 1:50-1:100 bir konsantrasyon ile başlayın. 37 °C ' de 4 d için seyreltilmiş primer antikor içinde böbrek dilimini yavaşça kaya. Not: Her antikor benzersiz özelliklere sahip olduğundan, antikor inkübasyon sırasında sıcaklık ve antikor dilüsyonları bireysel prob için optimize edilmesi gerekir. İkincil antikor sadece kontroller için, primer antikor olmadan seyreltilme böbrek dokusu inkübe. Ticari antikor seyreltme yerine, 0,1% Triton X-100 ve% 0,01 sodyum azid ile 1x PBS kullanılabilir.</li>
	<li>8 saat sonra bir yıkama tampon değişikliği ile RT 'de gece 10 mL 1x yıkama tamponunun içinde böbrek dilimi yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikorları seyreltir (örn. 1:100, Alexa Fluor-konjuli ikincil antikorlar için), 500 μL 'de normal antikor seyreltici. 37 °C ' de 4 gün boyunca seyreltilmiş sekonder antikor içinde böbrek dilimlerini kulbe etme. Bu adımda, böbrek dilimleri ışığında koruyun.</li>
	<li>8 saat sonra bir yıkama tampon değişikliği ile RT 'de gece 10 mL 1x yıkama tamponunun içinde böbrek dilimleri yıkayın.</li>
</ol>3. doku Temizleme
<ol><li>Yüksek dereceli 100% etanol (malzeme tablosu) 5 ml 'ye transfer böbrek dilimi (1 saat sonra taze etanol bir değişiklik ile) yumuşak sallanan RT 2 h için. Bu adım doku dehidrasyon içindir. Not: Yüksek dereceli etanol sonraki adımda yüksek doku saydamlık elde etmek için gereklidir. Metanol veya tetrahidrofuran yüksek delipidation potansiyeli ile alternatif dehidrasyon reaktifler vardır.</li>
	<li>Sadece RT (2 saat sonra taze ECi bir değişiklik ile) bir gecede yumuşak sallanan ile ECi 2 mL (malzeme tablosu) böbrek dilim bırakın. Not: ECi 'nin donma/erime noktası 6-8 °C ' dir. Bu nedenle, örnekleri buzdolabına saklamayın. Düzgün havalandırılan bir duman kaputu içine daldırma ve giysi ve cilt ile doğrudan temas önlemek (ECi olmayan bir toksik gıda ve Ilaç Idaresi-onaylı bileşik ama güçlü bir koku vardır). Normal Eppendorf tüpler veya cam gemiler kullanın (polistiren gemiler yok).</li>
	<li>Doku saydam ecin daldırma sonra elde edilebilir ve böbrek dilimleri görüntüleme için hazır olduğunda.</li>
</ol>4. Confocalımaging ve görüntü analizi
Not: Görüntüleme için, refraktif endeks eşleştirme çözeltisi objektif objektif ile uyumlu olduğu sürece diğer mikroskopi teknikleri kullanılabilir. Bu protokol ters bir Konfokal mikroskop kullanır.
<ol><li>Cam alt çanak (malzeme tablosu) içine 600-1000 μL eci ekleyin. Not: Normal hücre kültürü yemeklerinden kaçının, çünkü ECi plastik yemekleri çözülecek bir organik çözücüdür. Benzer şekilde, ECi objektif lensler plastik parçalar/yalıtım halkaları saldırı olabilir. Uyumlu görüntüleme yemekleriyle ilgili genel bir bakış için uygun raporlara bakın30 ve kendinden Made 3-D baskılı Odalar28.</li>
	<li>Yarı saydam böbrek dilimini çanak içine aktarın. Cam alt doğru ışık basıncı uygulamak için böbrek dilimi üzerinde yuvarlak bir lamel magazini yerleştirin. Ecın sızıntısını önlemek için tabağı parafin filmi (malzeme tablosu) ile mühürleyin. Not: Tüm organlar veya birkaç milimetre kalınlığında doku dilimleri bir sınır gerektirebilir (diş çimento veya silikon elastomer; malzeme tablosunugörmek) numune Için bir eci-havuz yapmak için doku etrafında.</li>
	<li>Çanak mikroskop görüntüleme platformu üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Birkaç z-yığınları alın ve dikiş gerçekleştirin. Z-Step boyutu 5 μm ile başlayın. Not: Çok kalın doku dilimleri veya organlarının görüntülenmesi için uzun çalışma mesafesi (> 5 mm) ve yüksek sayısal diyafram (> 0.9) hedeflerini kullanmayı düşünün. Görüntüleme sonrası, doku etanol geri aktarmak ve yıkama tampon veya PBS 0,02% sodyum azid ile saklayın.</li>
	<li>Yazılım (malzeme tablosu) ile 3-b Rendering kullanarak görüntüyü analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+podocyte+depletion%3A+theoretical+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li>
<li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+%28in+press%29%22%5BJournal%5D)">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li>
<li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).</li>
<li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Optik temizleme teknikleri, 3-b görselleştirme ve çeşitli organlarda mikroanatomisinin ölçülmesi için geniş önem almıştır. Burada, solvent bazlı Temizleme Yöntemi (ECI) böbrek dilimleri içinde tüm tübüllerin 3-b görüntüleme için immünolabeling ile birleştirilir. Bu yöntem, basit, ucuz ve hızlı. Ancak, diğer araştırma soruları en iyi diğer temizleme protokolleri ile cevap olabilir5. Aynı zamanda solvent tabanlı yöntemlerin değişken derecelerde doku-küçülme neden, özellikle dehidrasyon adım<sup clas...

Tüm organlar veya büyük çok hücreli yapıların incelenmesi artan ilgi üç boyutta şeffaf doku görüntüleme içeren optik temizleme yöntemlerinin gelişmesine yol açmıştır. Yakın zamana kadar, tüm yapıların hücre numarasını, uzunluğunu veya hacmini tahmin etmek için en iyi yöntemler stereoloji veya kapsamlı seri bölümlendirme olmuştur, bu iki boyutta sonraki analiz için doku sistemik örnekleme dayanmaktadır1, 2 , 3. ancak, bu yöntemler zaman alıcı ve eğitim ve uzmanlık yüksek düzeyde gerekir4. Optik temizleme yöntemleri, 3-b görüntüleme5,6,7için doku yarı saydam yapmak için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenerek bu sorunların üstesinden.
İki ana kategoriye düşen çeşitli optik temizleme yöntemleri geliştirilmiştir: solvent bazlı ve sulu bazlı Yöntemler. Sulu-tabanlı yöntemler daha basit daldırma8,9, hiperhidrasyon10,11ve hidrojel gömme12,13bölünebilir. Solvent bazlı Yöntemler dokusu susuz bırakmak, lipidleri kaldırmak ve 1,55 civarında bir değere refraktif indeksleri normalleştirmek. Çoğu solvent bazlı yöntemin sınırlamaları, GFP, solvent toksisitesi, bazı görüntüleme odalarında veya objektif lenslerde kullanılan yapıştırmaları çözünme kapasitesine sahip yaygın olarak kullanılan muhabir proteinlerinin endojen floresans ve dehidrasyon14,15,16,17,18,19,20,21. Ancak, solvent tabanlı Yöntemler, basit, zaman verimli ve farklı doku türleri bir dizi çalışabilir.
Sulu tabanlı Yöntemler, 1,38-1.52 aralığında refraktif endeksleri olan sulu çözümlerde dokusunun daldırma güveniyor8,11,12,22,23,24 . Bu yöntemler endojen floresan muhabiri protein emisyonunu korumak ve dehidrasyon kaynaklı daralma önlemek için geliştirilmiştir, ancak en sulu bazlı Temizleme yöntemlerinin sınırlamaları protokolün daha uzun bir süre içerir, doku genişleme, ve protein modifikasyon (örneğin SCALea2 gibi hiperhidrasyon protokollerinde üretan proteinleri kısmi denatürasyon)7,11,23,25. SCALe, üre kaynaklı doku genişlemesinin dehidrasyon ile dengelenmesi ve elektron mikroskobu10ile değerlendirildiği gibi doku ultrastrasyonu korunmuş olan Ürea ile Sorbitol ile birleştirerek doku genişlemesini ele aldı. Doku daralma veya genişleme yapıların mutlak boyutlarını, nesneler arasındaki mesafeleri veya hacim başına hücre yoğunluğunu etkiler; Böylece, doku temizlendiğinde boyut değişikliklerinin ölçülmesi elde edilen sonuçların yorumlanmasından7,26' ya yardımcı olabilir.
Genel olarak, optik temizleme için bir protokol, ön tedavi, geçirgen, immünolabeling (gerekirse), refraktif indeksleme ve gelişmiş ışık mikroskobu ile görüntüleme (örn. iki foton, konfoköz veya Floresan mikroskopisi). Temizleme yaklaşımlarının çoğu nöronal dokusu görselleştirmek için geliştirilmiştir, ve gelişmekte olan çalışmalar diğer organlarda uygulama doğruluyor5. Bu kapsamlı araç daha önce glomerül27,28, bağışıklık infiltratlar28, damarsal28ve tübül segmentleri dahil olmak üzere böbrek yapıları, güvenilir ve verimli analiz izin göstermiştir 29, ve glomerüler fonksiyon ve sağlık ve hastalık tübül remodeling daha iyi anlayış için ideal bir yaklaşımdır.
Burada özetlenen burada böbrek tübüllerin immünostonluk birleştiren bir solvent tabanlı yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil sinamat (ECI) ile optik temizleme; ve tam tübül görselleştirme ve quantification sağlayan Konfokal mikroskobik görüntüleme. Bu yöntem basittir, antijen-alma böbrek dilimleri ticari antikorların boyama ile birleştirir ve en laboratuvarları için erişilebilir kılan özel ekipman gerektirmez.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m filtre</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G kelebek iğne</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>3 musluk</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>3D analiz yazılımı</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>3D analiz yazılımı</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>ücretsiz açık kaynaklı yazılım</td></tr><tr><td>5-0 ipek sütür</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastik şırıngalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU monoklonal antikor</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Antikor seyreltici</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat bazlı antijen geri kazanım çözeltisi</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako Yıkama Tamponu</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>Gömme kasetleri</td><td>Carl Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td>100983</tr><tr><td>Etil sinnamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Esnek film / Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-AQP2</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>Gine domuzu anti-NKCC2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>Yatay külbütör</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme kabı</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>MWI Hayvan Sağlığı</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Mikro serrefine</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Çalışma makası</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-foshoThr53-NCC</td><td>FosfoÇözeltiler</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>Silikon elastomer</td><td>Dünya Hassas Aletler Kwik-Sil</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Doku dilimleyici</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Lancer</td><td>Serisi 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MWI Hayvan Sağlığı</td><td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td><td></td></tr></tbody></table>

optik temizleme ve immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optik temizleme teknikleri, sonraki üç boyutlu (3-b) görüntüleme için bir örnek boyunca refraktif indeks dengelenmiş doku şeffaf hale. Makroskopik mesafelere uzanan mikroskobik çok hücreli yapıları analiz etme potansiyeli için tüm araştırma alanlarında büyük önem aldılar. Böbrek tübülleri, damar, sinirler ve glomerüller, sadece kısmen geleneksel iki boyutlu teknikler tarafından şimdiye kadar yakalanan birçok yönde, uzatmak göz önüne alındığında, doku Temizleme de böbrek araştırma birçok yeni alanlar açtı. Optik temizleme yöntemlerinin listesi hızla büyüyor, ancak bu alandaki yeni başlayanlar için belirli bir araştırma sorusu için en iyi yöntemi seçmek zor kalır. Burada sağlanan kalın fare böbrek dilimleri antikor etiketleme birleştiren basit bir yöntemdir; ucuz, toksik olmayan ve kullanıma hazır kimyasal etil cinnamate ile optik temizleme; ve Konfokal görüntüleme. Bu protokol, böbrekler perfkullanmak ve özel ekipman gerektirmeden antikor bağlama artırmak için bir antijen alma adımı kullanın açıklamaktadır. Onun uygulama böbrek içinde görüntüleme farklı çok hücreli yapıları sunulmaktadır, ve nasıl doku içine zayıf antikor penetrasyon sorunlarını gidermek için ele alınmıştır. Ayrıca endojen fluorophores görüntüleme ve çok büyük numuneler edinme ve onları aşmak için potansiyel zorlukları tartışıyoruz. Bu basit protokol, üç boyutta doku çalışması için kolay kurulum ve kapsamlı bir araç sağlar.

Böbrek 43 farklı hücre tipleri31oluşan karmaşık organlar vardır. Bu hücrelerin çoğu glomerül ve tübüller gibi büyük çok hücreli yapıları oluşturur ve fonksiyonları birbirleri ile etkileşimlere son derece bağımlıdır. Klasik 2-D histolojik teknikler, bu büyük yapıları kısmen yakalar ve bozulmamış yapıların içinde odak değişikliklerini kaçırabilir31. Bu nedenle, optik temizleme tekniklerini kullanan 3-b analizi, sağlık ve hastalıklarda nasıl çalışmasını anlamanıza yardımcı olu...

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Büyük, çok hücreli yapıların incelenmesine olan ilginin artması, saydam organlar daki büyük yapıların üç boyutlu bir görselleştirme ve nicelleştirilmesine olanak sağlayan bu optik temizleme tekniğinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu protokol, dokuları üç boyutlu olarak araştırmak için basit, ucuz, kurulumu kolay ve kapsamlı bir araç sağlar. Bir hastalığın çok katmanlı doğası her zaman geleneksel iki boyutlu teknikler ile simüle edilemez.Doku üç boyutlu analizi daha iyi teşhis ve hastalık izlemek için yardımcı olabilir. Bu yöntem böbrek dokusu ile sınırlı değildir ve herhangi bir normal ve hastalıklı doku uygulanabilir. Bu basit protokolü hayvan işleme bazı deneyime sahip herhangi bir bilim adamı için takip etmek kolaydır.Kötü antikor etiketleme durumunda farklı antikorların test etmek ve ikincil antikor kontrolleri yapmak önemlidir. 1X PBS'de PBS ve %3.0 paraformaldehit içeren heparini el yazması talimatlara göre hazırlayarak ve çözümleri ayrı 50 mL plastik şırıngalara aktararak başlayın. Paraformaldehit toksiktir ve duman kaputunda hazırlanmalıdır.El yazması talimatlara göre böbreği toplayın ve bolca kullanın. Sonra, kapsül kaldırmak ve bir mm kalınlığında koronal dilimler halinde böbrek kesti. Hazırlanan paraformaldehit çözeltisi ile böbrek dilimlerini 15 mL konik tüpe batırın.Fiksasyon sonra, yatay bir rocker bir saat boyunca 1X yıkama tampon ile iki kez böbrek dilimi yıkayın ve daha sonra antijen alma ile devam edin. 500 mL'lik bir kabın içinde 300 mL 1X antijen inmaskeleme çözeltisini ısıtın. Daha sonra, ısıtılmış tampon geçirilebilir bir gömme kaset bir böbrek dilimi içine ve 92 ila 98 santigrat derece bir saat karıştırın.Bu antijen alma adımı için sıcaklığı 92 ile 98 santigrat derece arasında sabit tutmak önemlidir. Daha sonra dilimi 10 mL 1X yıkama tamponuna %0,1 Triton X-100 ile aktarın ve bir gecede sallayın. Ertesi gün, dilimi 10 mL taze 1X yıkama tamponu yla iki kez bir saat yıkayın.Normal antikor dilüent 500 mikrolitre birincil antikor seyreltin. Böbrek dilimini seyreltilmiş primer antikorda 4 gün boyunca 37 santigrat derecede hafifçe sallayın. Kuluçkadan sonra böbrek dilimini 10 mL 1X'lik bir gecede oda sıcaklığında yıkayın ve tamponu sekiz saat sonra bir kez değiştirin.Normal antikor dilüent 500 mikrolitre ikincil antikorlar seyreltmek ve 37 santigrat derece dört gün boyunca böbrek dilimi ile kuluçka. Bu adımdan itibaren böbrek diliminin ışıktan korunması gerektiğini lütfen unutmayın. Sekonder antikorlarla kuluçkadan sonra böbrek dilimini 10 mL 1X yıkama tamponunu oda sıcaklığında bir gecede yıkayın.Böbrek dilimini susuz leştirmek için, yüksek dereceli %100 etanolün beş mL'sine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca sallayın, bir saat sonra etanolünü yenileyin. Böbrek dilimini iki mL etil cinnamate'e batırın ve bir gecede hafifçe kayalayın. Doku görüntü hazır olduğunda, bir cam alt çanak içine etil cinnamate 600 ila 1000 mikrolitre ekleyin ve çanak içine böbrek dilimi aktarın.Böbrek dilimi üzerine yuvarlak bir kapak fişi yerleştirin ve parafin film ile çanak mühür. Tabağı mikroskop görüntüleme platformuna yerleştirin ve el yazması talimatlara göre dokuyu görüntüleyin. Bu protokol böbrek dokusu üzerinde 3Boyutlu analizleri başarıyla gerçekleştirmek ve hücre fonksiyonlarını ve etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılmıştır.Yöntem floresan muhabirin söndürülemelerine neden olabilir ancak diğer güçlü floresan proteinler sinyal söndürmeye karşı koyabilir. Abdominal aort profüzyonu antikor difüzyonu artırabilir. Bazı durumlarda, kötü antikor penetrasyonu yüzeysel bir sinyal ile sonuçlanır.Bu yüksek konsantrasyonlarda veya antikor ikmali ile düzeltilebilir. İlgi antijeni böbrek vaskülatürde ifade edilirse intravasküler doğum düşünülmelidir. Ancak tübül epitel hücrelerinin apikal zarındaki proteinleri hedef alan antikorlar glomerüler filtrasyon bariyerini geçmez ve spesifik olmayan sinyallere neden olmaz.Doku belirli bir hücre popülasyonunu tespit etmek veya tüm tübül segmentlerini görselleştirmek için antikorlarla etiketlenebilir. Ayrıca proteinlerin 3Boyutlu olarak kolokalizasyonu birden fazla antikor birleştirilerek elde edilebilir. Bu antikor etiketleme iyi böbrek profüzyonu ile geliştirilebilir hatırlamak önemlidir, antijen alma adımı kullanımı, ve yüksek antikor konsantrasyonu.Bazı güçlü muhabir proteinler bu protokolü izleyerek floresan sinyalin söndürülmelerine karşı koyabilirler. Bunu test etmek için, antijen alma ve antikor etiketleme adımlarını atlayın. Bu teknik yapıların üç boyutlu doğasına saygı duyar ve araştırma için birçok yeni alan açar.Geleneksel iki boyutlu analizle ilişkili gerekli varsayımları ve girişimleri ortadan kaldırır.

optical-clearing-and-imaging-of-immunolabeled-kidney-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Behera, R. K. ve diğerleri. Enfekte dokularda bakteriyel gen düzenlemesini incelemek için floresans tabanlı bir yöntem. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, enfekte fare böbrek dokusunun hazırlanması, DNA'nın boyalanması ve bakteriyel gen ekspresyonunun çift floresan muhabirler kullanılarak tespit edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Kırmızı tüm bakterileri işaretlerken, yeşil enfeksiyona duyarlı hücreleri vurgular.

Fare böbrek dokusunda bakteriyel kolonizasyonun floresans görüntülemesi

Bu video, CUBIC (şeffaf, engelsiz beyin/vücut görüntüleme kokteylleri ve hesaplamalı analiz) adı verilen bir doku temizleme yöntemi ve immünofloresan boyama kullanılarak murin böbreklerinin tam montajlı boyanması için bir testi göstermektedir. Böbrek, doku temizlemeye tabi tutulur, burada böbreğin yağı alınır, rengi giderilir ve optimum üç boyutlu görüntüleme için dokuyu şeffaf hale getirmek için bir kırılma indisi eşleştirme solüsyonu ile tedavi edilir. Doku, ışık tabakası mikroskobu altında...

Böbreğin üç boyutlu görüntülenmesi için tam montajlı organ boyama tekniği

ACT-PRESTO (organlara makromoleküllerin aktif netlik tekniği basınçlı ilgili verimli ve istikrarlı transfer) pasif difüzyon veya basınç destekli teslimat temizlenir dokulara hızlı, verimli, ama ucuz doku takas ve hızlı antikor penetrasyon sağlar. Bu yöntemi kullanarak, dokuların geniş bir yelpazede, temizlenmiş birden antikorlar tarafından immunolabeled ve hacim-görüntülü olabilir.

ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.

İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması

Bu protokolün amacı, vibratom kesitlerini kullanarak fare renal pelvisinin sağlam kalp pili bölgelerini izole etmektir. Bu bölümler daha sonra vibratom dilimlerinde kalp pili hücrelerinin ve diğer geçiş hücrelerinin Ca 2+ geçici özelliklerini aydınlatmak için in situCa 2+ görüntüleme için kullanılabilir.

Vibratom Kesitleme ile Fare Renal Pelvisin Canlı, Sağlam Kalp Pili Bölgelerini İzolasyon ve Görüntüleme

Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

Sitokinlerin salgılanmasından sorumlu hücre tipinin tanımlanması, böbrek hastalığının patobiyolojisini anlamak için gereklidir. Burada, bir sekresyon inhibitörü olan brefeldin A ve hücre tipine özgü belirteçler kullanılarak böbrek epitel veya interstisyel hücreler tarafından üretilen sitokinler için böbrek dokusunu kantitatif olarak boyamak için bir yöntem açıklıyoruz.

Böbrekte Salgılanan Proteinlerin Kaynağının Brefeldin A Enjeksiyonu ile Belirlenmesi

Burada, uzun süreli üreter tıkanıklığının glomerüler dinamikler ve fonksiyon üzerindeki etkilerini ölçmek için Münih Wistar Fromter sıçanlarında yüzey glomerüllü 2-foton mikroskobu kullanan bir protokol sunuyoruz.

Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Mevcut protokol, üç boyutlu (3D) böbrek görüntüleme için bir doku temizleme yöntemi ve tam montajlı immünofloresan boyama yöntemini tanımlamaktadır. Bu teknik, böbrek patolojisinde makroskopik perspektifler sunarak yeni biyolojik keşiflere yol açabilir.

KÜBİK ile Tüm Böbrek Üç Boyutlu Boyama

Bu çalışma, CUBIC temizlenmiş fare böbreklerinden glomerülleri etiketlemek ve analiz etmek için kullanımı kolay, eksiksiz ve basit bir dizi yöntem sunmaktadır. Glomerulus sayısı ve hacmi gibi veriler, floresein izotiyosiyanat (FITC)-Dekstran, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) veya yaygın konfokal mikroskopi ve Imaris gibi yazılımlar kullanılarak kolay ve güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Fare Glomerüllerini Etiketlemek ve Analiz Etmek için Etkili ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin, optik temizleme ve immünolabeling kullanarak böbrek dokusunun üç boyutlu görüntülenmesini. Bu yöntem, büyük çok hücreli yapıların nicelendirilmesini sağlar ve tanısal yetenekleri artırır.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Daha fazla video keşfet