Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile
29 Haziran 2020
Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.
Bu protokol, hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tarladaki diksiyonun ilk görünümünden merkezi bir aktivite düzeyinde moleküler konformasyona kadar kullanılabilir. Hızlı immünokromtografik tanı testi, kuduz tanısı için referans materyallerin bulunmadığı Afrika ve Asya'daki kırsal ve kırsal özellikler için yararlı bir alternatiftir. Prosedürü gösteren simon Bonas benim laboratuvarımdan bir teknisyen olacak.
Prosedürün ilk bölümünü gösteren İbrahima Dicko, Bamako Laboratoire Merkez Veteriner bir teknik olacak, Mali. Foramen magnum erişmek için, ilk servikal vertebra önce hayvan kafası kaldırmak için bir bıçak kullanın. Ve bir beyin sapı örneği toplamak için uygun bir araç kullanın.
Tek kullanımlık pipet, saman içme, kelepçe veya damlalık gibi burada gösterildiği gibi. Beyin sapı daha sonra açıkça burada bu pipet ucu ile gösterildiği gibi görülebilir. Bu beyin sapı bir içme saman gibi bir kısmını toplamak için uygun bir araç kullanın.
Dikkatlice yerleştirin ve beyin dokusunu toplamak için yavaşça açın. Biyopsiyi toplamak için pipeti çıkarmadan önce parmağınızla takmayı unutmayın. Bir kelepçe kullanımı da mümkündür.
Foramen magnum düzeyinde beyin sapı daha büyük parçaları toplamak için. Alternatif olarak, beyin sapını toplamak için kitisağlanan damlalık doğrudan kullanmak mümkündür. İçme saman benzer şekilde, dikkatlice bastırırken damlalık takın ve beyin dokusunu toplamak için yavaşça açın.
Sonra beyin dokusu aspire ve bir tüp stoper gibi bir kap içine yerleştirin. Doğru bir tanı için örnek toplama sırasında medulla ablongata içeren beyin sapı toplamak için önemlidir. Homojen bir süspansiyon elde edilene kadar, tamponu içeren beyin malzemesini bez veya damlalıkla yaklaşık 30 saniye boyunca doğrudan tüpte dikkatlice ezin.
Damlalık kullanarak, test cihazındaki numune girişine süspansiyonun yaklaşık 100 mikrolitresini dört damla yatırın. Yüksek viskozite süspansiyonu nedeniyle gecikme veya göçün başlamasını hızlandırma durumunda, damlalıklı cihazın depozito alanının alt kısmını hafifçe kazıyın. Test aygıtını okumadan bir ila beş dakika önce tam örnek geçişi bekleyin.
İki satır görünür olduğunda kuduz için pozitif olarak kabul edilir. Negatif, yalnızca kontrol satırı varsa. Yalnızca test satırı veya hiçbir satır görünürse geçersizdir.
RNA'yı bir aygıt örneğinden çıkarmak için cihazı dikkatlice açın ve filtre kağıdını çıkarın. Numunenin depozito alanını toplayın ve numuneyi bir mililitre trireaktif LS'e yerleştirin. Düzenli nazik manuel ajitasyon ile oda sıcaklığında bir saat sonra, standart RNA ekstraksiyon protokollerine göre supernatant tüplerden RNA ayıklayın. Üreticilerin tavsiyelerine göre RNA çökeci kolaylaştırmak için glikojen iki mikrolitre ekleme.
RNA resuspension'ın son hacmini nükleaz içermeyen suyla 50 mikrolitreye ayarlayın. Ve tabloya göre üç farklı ters transkriptaz kantitatif PCR tahlilleri için ana karışım reaksiyon çözeltisi çözümünü hazırlayın. Tabloda belirtildiği gibi astar ve probları kullanma.
Seyreltilmiş RNA örneklerinin beş mikrolitresi. Ve uygun 96 iyi reaksiyon plakaları çoğaltılır üç farklı tahlillerin her biri için ana karışımı 15 mikrolitre. Yinelenen her plakaya her bir titreşme için uygun pozitif ve negatif denetimleri ekleyin.
Daha sonra tabloda belirtildiği gibi termal bisiklet koşullarını takip eden farklı tahlilleri çalıştırın. Sonuçlar tabloda belirtildiği gibi analiz edilebilir. Bir beyin biyopsisi toplama yüksek kaliteli örneklerin toplama garanti etmek mümkün olduğunca basittir.
Referans tekniği ile karşılaştırıldığında hızlı immünokromatografik tanı testinin duyarlılığı ve özgüllüğü bu protokolleri kullanan tüm laboratuvarlarda yüksekti. Test edilen örneklerin kümülatif sayısına göre genel duyarlılık ve özgüllük %95'in üzerindeydi Hızlı immünokromatografik tanı testi enfekte hayvanların beyin biyopsilerinde lisavirüs saptanması için uygundur. Lisavirus antijenlerinin düzeyi kuduz tanısı için önemli olduğundan, titre virüs süspansiyonları test ederken algılama sınırı yüksek kalır.
Bu temsili sonuçlarda, lisavirüs viral polimerazın çift kombine panlisavirüs ters transkripsiyonu ile RNA tespiti nden sonra elde edilen 51 pozitif hızlı immünokromtografik tanı testi nden oluşan bir panel uygulandı. Buna ek olarak, kısmi nükleoprotein geninin hemi iç içe PCR hedeflemesi kullanılarak 14 örnek için genotipleme yapılabilir. Tanılama ve RT PCR sonra dayalı genotipleme için test şeridi için ayıklama, ya da ek uzun dize analizi için.
Hızlı immünokromtografik tanı testi hızlı ve doğru kuduz tanısı sağlayabilir. Bu da sürekli dalga tabanlı gözetleme ve kontrol sistemlerinde dalga işlevini korumak için çok önemlidir. Ve humannnes en aza indirmek.
Genel Bakış
Bu makale, hızlı immünokromatografik tanı testi (RIDT) kullanılarak hayvan kuduzunun postmortem teşhisine yönelik bir protokol sunmaktadır. Prosedür, beyin biyopsisi örneklemesini ve yorumlanmasını içermekte olup, moleküler analiz ve viral genotipleme için ek uygulamalar da sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Veteriner tanı yöntemleri
- Viroloji
- Moleküler biyoloji
Arka Plan
- Kuduz, hayvanları ve insanları etkileyen kritik bir zoonotik hastalıktır.
- Geleneksel tanı yöntemleri kırsal bölgelerde sınırlı olabilir.
- RIDT, kuduz tanısı için hızlı ve etkili bir alternatif sunar.
- Saha koşullarında tanı için referans materyallere erişim genellikle yoktur.
Çalışmanın Amacı
- Hayvan kuduzunun ölüm sonrası teşhisi için güvenilir bir protokol sağlamak.
- RIDT'nin çeşitli ortamlardaki etkinliğini göstermek.
- Viral genotipleme gibi ek uygulamaları araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hayvanlardan beyin sapı örneklerinin toplanması.
- Hızlı tanı için RIDT kullanımı.
- RNA ekstraksiyonu ve ters transkriptaz kantitatif PCR analizleri.
- Kuduz virüsü örneklerinin genotiplendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- RIDT, %95'in üzerinde yüksek hassasiyet ve özgüllük göstermiştir.
- Basit araçlar kullanılarak beyin biyopsilerinin başarılı bir şekilde toplanması sağlanmıştır.
- Örneklerin bir alt kümesinde genotipleme gerçekleştirilmiştir.
- Protokol, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda saha kullanımı için uygundur.
Sonuçlar
- RIDT, kuduz teşhisi için hızlı ve doğru bir yöntem sunar.
- Bu protokol, kuduz sürveyans ve kontrol çalışmalarını geliştirebilir.
- Halk sağlığının ve güvenliğinin korunması için kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Hızlı immünokromatografik tanı testleri (RIDT'ler), kaynakların kısıtlı olduğu ortamlarda merkezi olmayan kuduz sürveyansına olanak tanıyarak zoonotik hastalık izlemedeki kritik boşlukları doldurur. Hasta başı antijen tespitini, inaktive edilmiş test şeritlerinden elde edilen alt moleküler genotipleme ile birleştiren bu protokol, hem anlık salgın yanıtını hem de boylamsal viral takibi destekler. Bu çift yetenekli yaklaşım, merkezi laboratuvar altyapısına olan bağımlılığı azaltırken, antiviral müdahaleler için erken aşama hedef doğrulamadaki öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Sinir dokusundaki kuduz antijeninin varlığının hızlıca doğrulanması yoluyla lizhostatik mekanizmaların fonksiyonel sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: In vivo hedef etkileşim hipotezleri üzerindeki riskleri azaltmak için saha koşullarında yüksek kapasiteli örnekleme imkanı sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Farklı örnek türleri genelinde analiz normalizasyonu için görsel okumalı, standartlaştırılmış, kalitatif antijen saptaması sağlar.
- Operasyonel Değer: Güvenli taşıma ve moleküler analiz için uygun, inaktive edilmiş test şeritleri oluşturarak taramadan genotiplemeye kadar iş akışının sürekliliğini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Test şeritlerinden RNA ekstraksiyonu yoluyla viral genotiplemeyi destekleyerek, fenotipik tanıyı suşa özgü moleküler karakterizasyonla ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: Saha sürveyansı ile merkezi laboratuvar analizi arasında bir köprü kurarak, zoonotik patojen çalışmalarındaki translasyonel sürekliliği artırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
RIDT protokolü, endemik bölgelerde ilk hipotez testlerini mümkün kılarak keşif iş akışlarına entegre olur ve elde edilen çıktılar, viral suş takibi yoluyla öncü bileşiklerin tanımlanmasına katkı sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Beyin biyopsilerinde kuduz antijen ekspresyonunu doğrulayarak hedef validasyonunu destekler ve nöral invazyon mekanizmalarının patofizyolojik ilgisini netleştirir.
- Tarama: Ölçeklendirilebilir örnek triyajı için tanımlanmış pozitiflik kriterleri (iki görünür çizgi) ile tekrarlanabilir, cihaz gerektirmeyen antijen deteksiyonu sağlar.
- Analitik: RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR aracılığıyla kantitatif alt analizlere olanak tanır; viral yük ve genotipleme korelasyonları için ölçülebilir çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Aşı veya terapötik değerlendirme için suş seçimini bilgilendiren genotipleme verileri aracılığıyla, saha bazlı tanıyı preklinik modellemeyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Diğer lyssaviruslere uyarlanabilen taşınabilir bir diyagnostik modül oluşturarak, platformun birden fazla Ar-Ge programı genelindeki faydasını maksimize eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef dokularda viral varlığın hızlıca doğrulanmasını sağlayarak zoonotik patogenezdeki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Soğuk zincir veya özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırarak, coğrafi olarak dağılmış bölgelerde örnek işlemenin standartlaştırılmasını sağlar.
- Stratejik Değer: in vivo hedef modülasyonuna dair erken ve güvenilir kanıtlar sunarak, antiviral programlardaki devam/durdur kararlarını hızlandırır.
- Portföy Etkisi: Coğrafi ve suşa özgü yatırım stratejilerini bilgilendiren erişilebilir sürveyans verileri aracılığıyla, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi iyileştirir.
Uygulama Hususları
- Tanısal doğruluk için medulla oblongata örneğinin toplandığından emin olmak adına uygun beyin sapı örnekleme tekniği konusunda eğitim gereklidir.
- Tutarlı sonuçlar için temel örnek hazırlama araçlarına (pipetler, tüpler, tampon çözelti) ve lateral akış okuyuculara erişime bağlıdır.
- Laboratuvarlar arası genotipleme güvenilirliğini korumak için test şeritlerinden RNA ekstraksiyon protokollerinin standardizasyonunu gerektirir.
- Antijen konsantrasyonundaki ve test hattı görünürlüğündeki potansiyel varyasyonlar nedeniyle kuduz dışı lyssaviruslar için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Ekstraksiyon sonrası yüksek analitik hassasiyete rağmen, düşük antijenli örneklerde konfirmasyon testi gerektirebilen analiz görsel tespit eşiği ile sınırlıdır.
