E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Membran taşıyıcılarını karakterize etmek için bu tekniğin en önemli avantajlarından biri, taşıyıcının belirli yüzeyler için göreceli yakınlığını belirlemenin yanı sıra taşıma mekanizması hakkında bilgi edinmenizdir. Substrat naklini sağlamak için protein gradyanlarını kullanan membran proteinlerinin karakterizasyonu, burada gösterdiğimiz bu iç-dış vezikül teşrisi için özellikle uygundur. Bu tahlil bir Fransız basın ve ultracentrifuge erişim gibi bazı özel ekipman gerektirir iken, biz membran taşıyıcıları yapay lipozomlar içine yeniden gerekli tahliller daha teknik olarak daha kolay olabileceğini düşünüyorum.

Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı yüzeylere ilişkin göreceli yakınlıkları ölçmemize ve rakip yüzeylerin taşıma ızgaraları üzerindeki etkisini test etmek için rekabet tahlilleri yapmamıza olanak sağlamasıdır. Bu titreyi göstermek için kullanılan BAT1 taşıyıcısı durumunda, biz de arginin tarafından taşıyıcı substrat aktivasyon göstermek başardık. Bu prosedüre başlamak için, kültür uygun antibiyotikler ile poliamin 3 medya beş mililitre tek bir koloni aşılama ve 37 santigrat derece bir gecede büyüyen hedef protein ifade hazırlanan E.coli mutant hücreleri.

Ertesi gün, hücre kültürü 0.6 ve 0.8 arasında bir OD600 ulaşana kadar 0.0002% arabinose ile desteklenen taze poliamin 3 medya 500 mililitre bu kültürü aktarın. Bundan sonra, santrifüj 2000 kez G ve dört derece santigrat hücre pelet toplamak için 15 dakika. Peleti yeniden askıya alın ve her seferinde 15 dakika boyunca 2000 kez G'de santrifüj ve dört santigrat derecede tampon bir ile üç kez yıkayın.

Üçüncü dönüşten sonra Tampon bir hücrelerin son hacmi 10 mililitre olmalıdır. 35 mililitrelik bir Fransız basınç hücresi ortaya koyve hücre süspansiyonu hücrenin gövdesine dökün. Ünitenin arka tarafındaki RHS anahtarıyla makineyi açın ve oran seçici anahtarını yükseklere ayarlayın.

Pompa düğmesini aç. Piston, odadaki havayı yerinden çıkarmak için üsten yükselmeye başlayacak. Gösterge 640 PSI'ya ulaşana kadar basınç artış valfi saat yönünde çevirerek basıncı artırın.

Bu 10.000 PSI bir iç basınç yaratacak. Hücre hedef basınca ulaştıktan sonra, akış valfi tertibatını saat yönünün tersine çevirerek hafifçe açın. Dakikada sadece yaklaşık 10 damla bir akış hızı sağlamak için vana nın açılmasını ayarlayın.

Piston gövdesindeki stop hattı akış hücresinin üst bölümüne ulaştığında pompa kapatın. Oran seçici anahtarını aşağıya yerleştirerek alt plakayı indirin ve pompa anahtarını açın. Alt plaka tamamen geri çekildiğinde, basınç artış valfini saat yönünün tersine çevirerek sistem basıncını sıfıra indirin.

Pompayı kapatın ve makineyi kapatın. Fransız basını 10, 000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca kırılmamış hücreleri ve hücre enkazını yok etmek için ekspertiz. Pelet atın ve ultracentrifuge tüpler için supernatant aktarın.

Ultracentrifuge membran veziküller pelet için bir saat için 150, 000 kez G ve dört derece santigrat elde supernatant. Membran vezikülleri tampon ikide yeniden süspansiyon olmadan bir kez yıkayın. Sonra, tampon iki membran vezikülleri yeniden askıya almak için bir Dounce doku öğütücü kullanın.

Membran preparatlarının 100 mikrolitrelik aliquotlarını 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerde hazırlayın ve eksi-80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, pH 7.8'de Tris'in 30 milimolar'ındaki vezikülleri yıkayın ve yeniden askıya alın, bu da 0.1 milimolar kobalt II klorür içerir. Her 100 mikrolitre lik numuneye sodyum klorür, Tris ve kobalt II klorür de bir mikrolitre karboksipeptidaz ekleyin.

20 derecede 20 dakika kuluçkaya yat. Sindirimi durdurmak için PH 7.5'te sodyum EDTA ve 2-Mercaptoetanol içeren bir çözeltinin beş mikrolitresini ekleyin. Enzimi tamamen inaktive etmek için çözeltiyi oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, sıvı dodecyl sülfat, gliserol, bromofenol mavisi ve Tris içeren bir çözeltinin beş ila 10 mikrolitresini ekleyin ve numunenin pH 7,5 ila 100 mikrolitresini elektroforez ile analiz edin. Amino blotting gerçekleştirmek için, poliakrilamid jel üzerine 25 milimolar sodyum hidrojen fosfat ile nemlendirilmiş bir nitroselüloz filtre yatıyordu. İki nemlendirilmiş selüloz filtreler arasında yerleştirin, ve son olarak, iki nemlendirilmiş plastik ovma pedleri arasında.

Bu derlemeyi 25 milimolar sodyum hidrojen fosfat içeren bir haznenin elektrotları arasına iki ila dört santigrat derece arasında bir sıcaklıkta yerleştirin. Proteinleri 20 voltta ve 2-3 amperde üç saat boyunca elektrotransfer edin. Nitroselüloz zarını bir gecede iki santigrat derecede tamponu bloke ederek kapatın.

Ertesi gün, anti-His C-terminal HRP antikor 20 mililitre de nitroselüloz kuluçka, Anti-His C-terminal HRP antikor ve iki saat boyunca tampon engelleme ve tampon ile iki kez yıkama 50 mililitre tampon toplam 60 dakika. Amino lekegörselleştirmek için, denatüre alkol 20 mililitre 4-Chloro-1-naphthol altı miligram eritmek ve 15 milimolar Tris 80 mililitre ve% 30 hidrojen peroksit 50 mikrolitre ekleyin. Bu substrat çözeltisindeki filtre kağıdını 20 dakika yıka.

Yeterli renk geliştiğinde, membranı suyla durulayın ve kurumasını bekleyin. Başlamak için, membran veziküllerin 100 mikrolitrelik aliquot'u 12 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Taşımabaşlatmak için membran veziküller için 50 mikromolar son konsantrasyonunda radyoetiketli poliaminler içeren tampon 3 ekleyin.

12 santigrat derecede bir dakika boyunca nakil titresini yap. Bundan sonra reaksiyon karışımlarını filtrasyon manifolduna aktarın ve 0,45 mikrometre nitroselüloz membran filtresinden filtreleyin. Etiketlenmemiş poliaminlerin on kat daha yüksek konsantrasyoniçeren buz gibi araştırma tamponüç mililitre ekleyin, non-spesifik bağlama azaltmak için poliaminler olmadan üç mililitre saymama tampon izledi.

Yıkanmış filtreleri 10 mililitre sintilasyon sıvısı içeren 20 mililitrelik tek kullanımlık sintilasyon şişelerine aktarın ve radyoaktiviteyi belirlemek için sıvı bir sintilasyon sayacı kullanın. Metin protokolünde belirtildiği gibi net poliamin alımını hesaplayın. Hedef proteini ifade eden veziküllere radyoetiketli substrat alımını ölçerek substrat için Km'yi belirleyin ve doğrusal olmayan bir regresyon yöntemi kullanarak Michaelis-Menten kinetiklerini hesaplayın.

Yarışma deneyleri için, 12 santigrat derecede 100 mikrolitre vezikül içeren santrifüj tüpüne, aynı anda radyoetiketli poliaminin 50 mikromolar eklerken, deneme tamponunda yapılan etiketsiz rekabetçi substratı ekleyin. Veziküllerin içinde sıkışıp kalan radyoaktiviteyi daha önce açıklandığı gibi ölçün. Radiolabeled poliaminlerin alımını ve 100 mikromolar veya daha yüksek etiketli olmayan substrat varlığını ölçerek rekabetçi yüzeyler için bir üst KM belirleyin ve eğriyi çizmek için doğrusal olmayan bir regresyon yöntemi kullanın.

Bu çalışmada, bir anti-hamal ilk E.coli protein ifade ile karakterizedir, ve daha sonra, heterologca ifade protein hücresiz bir sistemde titretilebilir böylece membran veziküller üreten. Batıda bir leke AtBAT1 vezikül e nakledilir doğrulamak için kullanılır. Bir Anti-His C-terminal antikor ile leke probing yaklaşık 72.3 kilodalton bir füzyon yapı proteini ortaya.

SDS-PAGE'den önce veziküllerin sindirimi azalmaya yol açtı, ancak sonda sinyalinin tam bir kaybı olmadı. 12 santigrat derecede, veziküller tarafından radyoetiketli spermidin alımı bir dakika en yüksek ve üç dakika boyunca doğrusal kaldı. Bu nedenle, taşıma tsanının kuluçka süresi bir dakika içinde sabitlenir.

Bir dakika sonra, vezikül membranı boyunca proton gradyanı olmadığı için pH 8.0'da hazırlanan ve depolanan membran vezikülleri ile izotopun net alımı yoktur. Yapay proton gradyanının dağılmasının etkisini göstermek için membran vezikülleri pH 8.0 tamponunda 10 dakika boyunca inkübiterek etiketli substrat ilave edilir ve radyoetiketli substratın minimum alımına yol açmaktadır. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar spermidin proton tahrikli alımı BAT1 proteini nedeniyle olduğunu göstermektedir.

Proteinin substrat özgüllüğünü belirlemek için, Km değerleri farklı konsantrasyonlarda radyoetiketli substrat alımı ölçülerek hesaplanır. Spermidin, putrescine ve arginin için Km değerleri bu proteinin yüksek afiniteli poliamin ve arginin değiştirici olduğunu göstermektedir. Belirli bir alt tabaka için taşıyıcının affinity da dolaylı olarak rekabet tahlilleri kullanılarak tespit edilebilir.

Bu tahliller GABA spermidin rekabetçi bir inhibitörü olduğunu ortaya koymaktadır. Ayrıca, farklı amino asitlerin değişen konsantrasyonlarda varlığında radyoetiketli spermidin 50 mikromolar alımının ölçülmesi AtBAT1 de milimoler konsantrasyonlarda glutamat ve alanin taşıma yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Bu işlemi gerçekleştirirken, membran taşıyıcısının bakteri zarına entegrasyonu, belli ki, kritiktir.

İlgi proteininin membrana entegre edildiğinin doğrulanması, C-terminal etiketlerine karşı yöneltilen antikorlar kullanılarak yapılabilir. İnsan ışınlayıcılarının genetik varyasyonu, hem metabolitlerin hem de belirli taşıyıcının alt tabakaları olan ilaçların taşınmasını etkileyebilir. Böylece, allelic varyasyon etkileyebilir, hem, alımı ve ilaçların atılımı.

Birçok allelik varyantları hızlı bir ifade vektörü taşıyıcı genin yan yönettiği mutagenezi tarafından yapılabilir. Bu varyantların fonksiyonel tahlilleri daha sonra içten dış vezikül tahlilleri kullanılarak çok kontrollü koşullar altında test edilebilir. Membran taşıyıcıları tüm proteinlerin 8-10'undan oluşan ve çoğunluğu model organizmaların hiçbirinde tam olarak karakterize edilmemiştir.

Organel membranlara lokalize olan taşıyıcılar, ökaryotik hücrelerde heterolog ifade ile karakterize etmek özellikle zordur. Değişim tipi veya proton aracılı taşıyıcılar bu E.coli membranlokalize edilebilir, bu taşıyıcılar fonksiyonel olarak bu in vitro tsay kullanılarak karakterize edilebilir. Veziküllerin kalitesi ve verimi Fransız basınından hücre parçalarının elüsasyon oranındaetkilenir.

Izotopları ile veziküllerin taşıma tahlilleri yaparken, deneysel çoğaltmalar yapmayı kolaylaştıran deneysel bir kurulum olması önemlidir. Bunu yapmanın birçok yolu vardır, ancak bunu nasıl yaptığımızı size göstermenin bize yardımcı olacağını düşünüyoruz.