Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon
17 Aralık 2019
Burada sunulan enzimatik sindirim yoluyla tek bir hücre süspansiyon hazırlayarak makrofajlar ve diğer bağışıklık dışı hücrelerin çeşitli alt kümeleri insan ve fare miyokardiyum izole etmek için bir protokoldür. Akış sitometrisine dayalı tanımlama ve izole makrofajların karakterizasyonu için gating şemaları da sunulmuştur.
Kalp, kardiyak inflamasyonda ve onarımda önemli rol oynayan bağışıklık hücrelerinin heterojen popülasyonunu içerir. Bağışıklık hücrelerinin heterojenliğini anlamak ve işlevleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için, bu hücrelerin kalpten kurtarılmasına olanak sağlayacak bir yönteme sahip olmak önemlidir. Bu teknik, sağlıklı veya hastalıklı bir kalpte bulunan bağışıklık yanı sıra bağışıklık dışı hücre çeşitliliğini ortaya çıkarmak yardımcı olabilir.
Bu tekniğin üç ana avantajı vardır. İlk olarak, üç saat içinde çeşitli hücre türlerinin tek hücreli süspansiyon nesil yol açan basit bir tek iş akışı. İkincisi, canlı bağışıklık ve immün olmayan hücre popülasyonlarının yüksek iyileşme yol açar.
Ve üçüncü olarak, çok yönlü bir yöntemdir ve diğer türlerdeki kalp dokularına da uygulanabilir. Tek bir sindirim reaksiyonu için kullanılan doku miktarına dikkat önemlidir. Soğuk tuzlu veya HBSS sol ventrikül apikal veya lateral duvardan steril makas, diseksiyon doku örneği kullanın.
Dikkatle epikardiyal yağ ve kordatenin tendineae örnekten dışarı incelemek. Steril bir bıçak veya makas yardımıyla, yaklaşık 200 miligram ağırlığında parçalar halinde doku parçaları incelemek. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, keskin makas yardımıyla göğüs boşluğunu açın.
Kalbi yukarı kaldırmak için künt hemostatlar kullanın. Beş mililitrelik şırıngaya bağlı 25 kalibrelik bir iğne kullanarak kalbi soğuk PBS ile perfüzyon yapın. Kalp renkli görünene kadar perfuse.
Kalbi çıkarın ve buz üzerinde steril bir Petri kabına yerleştirin. Steril petri kabına 200 miligram insan kardiyak doku parçaları veya murin kalbi yerleştirin. Steril bir bıçak veya makas kullanarak dokuyu ince ince doğrama.
Sindirim kurmak için, bir 15 mililitre konik tüp, her insan kardiyak doku yığını veya enzimler kollajenaz I, DNase I ve hyaluronidaz ile üç mililitre son bir sindirim hacmi hazırlamak 450, 60, ve mililitre başına 60 birim konsantrasyonlarda. Tüpe 2,5 mililitre DMEM ekleyin. Temiz forceps yardımıyla, her reaksiyon tüpü içine ince kıyılmış doku yerleştirin.
Nazik girdap ile iyice karıştırın. Bir saat boyunca 37 santigrat derece bir sallayarak inkübatör düşük ve orta ajitasyon hızı ayarlayın sindirin. Sindirim bir saat sonra, kuvöz tüpleri almak ve buz üzerinde yerleştirin.
50 mililitrelik konik tüpler ilerler ve üzerinde 40 mikron hücreli süzgeç bulunur. Filtreleri iki mililitre enzim devre dışı tamponile ısla. Daha sonra, her sindirim tüpüne sekiz mililitre enzim devre dışı bırakarak sindirim enzimlerini etkisiz hale getirin.
Daha sonra 50 mililitrekonik tüpler içine 40 mikron hücreli süzgeç ile toplam karışımın elde edilen 13 mililitre dökün. Filtrelenmiş numuneleri taze 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Örnekleri 400 kez g'de dört santigrat derecede altı dakika döndürün.
0,5 mililitre ortam bırakarak supernatant atın. Hücre peletini nazik pipetleme ile yeniden askıya alın ve bir mililitre ACK lysis tamponu ekleyin. Nazik tüp girdap ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübate kırmızı kan hücre lisis gerçekleştirmek için.
ACK arabelleğibeş dakika sonra, örnek için DMEM dokuz mililitre ekleyin. Tüplerin kapağını geri koyun ve tüpleri yavaşça karıştırın. Filtre 40 mikron hücreli süzgeç ile ve 15 mililitre konik tüpler filtrat toplamak.
Tüpleri 400 kez g'de altı dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Bir mililitre FACS arabelleği ekleyin ve peleti yeniden askıya alın. Sonra 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Santrifüj tekrar 400 kez g beş dakika için. Supernatant atın ve FACS tampon 100 mikrolitre pelet resuspend. Tek hücreli süspansiyon antikor boyama için hazır.
Kalp örneklerine 1 ila 50 seyreltme de tipik bir insan antikor paneli ekleyin. Stromal hücreler ve murin kalp makrofajları için farklı antikorlar kullanın. Karanlıkta 4 santigrat derecede 30-40 dakika kuluçkaya yat.
Beş dakika boyunca 400 kez g facs tampon, hafifçe girdap ve santrifüj bir mililitre ekleyin. Bu yıkama adımLarını ikinci kez tekrarlayın. Daha sonra FACS tampon 350 mikrolitre örnek resuspend ve bir mikromolar son konsantrasyonulaşmak için DAPI ekleyin.
Numuneler artık FACS analizi için hazır. Bu protokolde makrofajların fare ve insan miyokardiyumundan izolasyonu sağlanmıştır. Bu rakam işlenmemiş ve işlenmiş insan LVAD çekirdeğini göstermektedir.
Insan miyokardiyumundan CCR2 negatif ve CCR2 pozitif insan makrofajlarının yanı sıra insan iskemik kardiyomiyopatisinden CD45 negatif stromal hücrelerin inakış sıralaması için gating şeması sunuldu. Wright lekeli FACS görüntüleri CD45 pozitif ve CD45 negatif hücrelerin canlılık gösteren bozulmamış hücre zarı göstermektedir. Makrofajları fare kalbinden sıralamak için gating şeması da başarılı oldu.
Enzimatik reaksiyon için kullanılan dokunun ağırlığı verimli sindirim için çok önemlidir. Protokolde belirtilen enzim konsantrasyonları için en fazla 200 miligram doku kullanın. Bu yöntemden sonra, hücreler in vitro stimülasyon tahlilleri için kültürlenebilir.
Hücreler toplu RNA sıralaması veya tek hücre sıralaması için sıralanabilir. Bu yöntem, sağlıklı veya hastalıklı insan kalbinde mevcut olan daha önce tanınmayan makrofaj heterojenliğini keşfetmede paha biçilmez bir teknik olarak hizmet vermiştir. Bu yöntemi kullanarak tek hücre dizilimi takip, çalışmalar çeşitli bağışıklık ve immün olmayan hücrelerin hastalıklı kalp karşı sağlıklı kalp nasıl değiştiğini ortaya çıkarmak için devam etmektedir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, insan ve fare miyokardından çeşitli makrofaj alt kümelerinin ve immün olmayan hücrelerin izole edilmesi için bir yöntemi özetlemektedir. Enzimatik sindirim yoluyla tek hücre süspansiyonu hazırlayarak araştırmacılar, kardiyak inflamasyon ve onarımdaki immün hücre heterojenliğini daha iyi anlayabilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kardiyovasküler Biyoloji
- İmmünoloji
Arka Plan
- Kalp, çeşitli bir immün hücre popülasyonu içerir.
- Bu hücreler, kardiyak inflamasyon ve onarımda kritik roller oynarlar.
- Bu hücrelerin heterojenliğini anlamak, kalp sağlığını çalışmak için gereklidir.
- Bu teknik, kalpten hem immün hem de immün olmayan hücrelerin geri kazanılmasına yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Miyokarddan makrofajları ve diğer hücre tiplerini izole etmek ve karakterize etmek.
- Sağlıklı ve hastalıklı kalplerdeki immün ve non-immün hücre çeşitliliğini ortaya çıkarmak.
- Kardiyak immün yanıtların incelenmesi için güvenilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tek hücre süspansiyonları hazırlamak için enzimatik sindirim.
- Hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu için akış sitometrisi.
- İnsan ve fare miyokardiumundan çeşitli hücre tiplerinin izolasyonu.
- Üç saat içinde tamamlanan basit bir iş akışı.
Ana Sonuçlar
- Canlı immün ve non-immün hücre popülasyonlarının yüksek geri kazanımı.
- Makrofaj alt kümelerinin etkili izolasyonu.
- Kardiyak dokudaki immün hücrelerin heterojenliğinin kanıtlanması.
- Kardiyak inflamasyon ve onarım mekanizmaları üzerine yapılacak ileri araştırmaların kolaylaştırılması.
Sonuçlar
- Bu teknik, kardiyak araştırmalar için değerli bir araç sunmaktadır.
- Kalp sağlığında bağışıklık hücresi rollerinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, kardiyak hastalıkları araştırmak için bu yöntemden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Kardiyak dokudaki makrofaj heterojenliğini anlamak, kardiyovasküler ilaç keşfinde hedef doğrulamanın risklerini azaltmak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, insan ve fare miyokardiyumundan immün ve stromal alt kümelerin tekrarlanabilir şekilde izole edilmesini sağlayarak, hedef güvenini ve portföy önceliklendirmesini bilgilendiren mekanistik çalışmaları destekler. Yöntemin basitliği ve türler arası uygulanabilirliği, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel sürekliliği artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Kardiyak inflamasyon ve onarım yollarında makrofaj alt küme fonksiyonlarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Günlük varyasyonları minimuma indirerek canlı immün ve immün olmayan hücrelerin izole edilmesi için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlar.
- Stratejik Değer: Hastalık fenotiplerine katkıda bulunan hücreleri netleştirerek hipotez odaklı hedef doğrulamayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel analizler ve alt omik uygulamaları için uygun, saflaştırılmış hücre popülasyonları oluşturur.
- Operasyonel Değer: Üç saatlik bir iş akışı içerisinde canlı hücrelerin yüksek geri kazanımını sağlayarak analizlerin standardizasyonuna imkan tanır.
- Stratejik Değer: Bileşik taramaları ve hedef etkileşim çalışmaları için hastalıkla ilgili sistemlerin ölçeklenebilir hazırlığını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Sağlıklı ve hastalıklı insan kalpleri arasındaki immün ve stromal hücre profillerinin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Biomarker keşfi ve mekanistik risk azaltma için bulk ve tek hücreli RNA dizileme ile uyumludur.
- Stratejik Değer: Hücresel fenotipleri türler arası hastalık durumlarıyla ilişkilendirerek riskle uyarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamasından preklinik araştırmalara kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, fonksiyonel ve genomik analizler için mekanistik olarak ilgili hücre tiplerinin izole edilmesine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Tanımlanmış makrofaj ve stromal alt kümeleri izole ederek hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Assay geliştirme ve bileşik taraması için uygun, standardize edilmiş ve canlı hücre süspansiyonları üretir.
- Analitik: Karşılaştırmalı durum analizine olanak tanıyan akış sitometrisi, dizileme ve fonksiyonel okumalar için kantitatif girdiler oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Türler arası uygulanabilirlik ve hastalıkla ilgili spesimen kullanımı yoluyla keşif bulgularını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kardiyovasküler hastalık modelleri ve terapötik alanlar genelinde immün profilleme için yeniden kullanılabilir bir platform kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İmmün aracılı kardiyak patolojideki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Basit ve zaman açısından verimli bir iş akışı ile tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Kardiyovasküler hedeflerin erken biyolojik risk azaltmasını sağlayarak karar verme süreçlerini (go/no-go) iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İnsan ve fare hastalık modellerinde doğrulanmış hücresel mekanizmalara dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeye olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Enzimatik doku disosyasyonu, akış sitometrisi ve steril hücre işlemleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kollajenaz I, DNase I, hyaluronidaz, ACK lizis tamponu ve FACS uyumlu cihazlara erişime bağlıdır.
- Sindirimin verimliliğini sağlamak için standartlaştırılmış doku diseksiyon protokollerini (örneğin, 200 mg apikal/lateral sol ventrikül parçaları) gerektirir.
- Antikor panellerinin türe özgü makrofaj ve stromal hücre belirteçleri (örneğin, insanlar için CCR2, fareler için CD45) için uyarlanmasını gerektirir.
- Giriş dokusunun kalitesi ve miktarı ile sınırlıdır; fibrotik veya kalsifiye örneklerde suboptimal verimler oluşabilir.
