Name: Tıklanabilir Kafesli Bileşiklerin Tasarımı, Sentezi ve Fotokimyasal Özellikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin, tıklanabilir kafesli bileşiklerin sentezi ve fotokimyasal özelliklerini. Bu yöntem, su çözünürlüğü ve hücre hedefleme yeteneği ekleyerek nörobilim araştırmalarında kullanımı genişletir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma JSPS KAKENHI hibe numarası JP16H01282 (TF), Yenilikçi Alanlar "Bellek Dinamizm bilimsel araştırma için hibe-in-Aid" ve JP19H05778 (TF), "MolMovies tarafından desteklenmiştir."

1. Tıklanabilir kafesli bileşikler için modüler caging paBhc grubunun sentezi28,41
<ol><li>
(6-bromo-7-hidroksicoumarin-4-yl)metil klorür (Bhc-CH2Cl) hazırlanması
	<ol>
<li>4-bromoresorcinol (9.742 g, 51.5 mmol) bir karıştırıcı çubuğu ile donatılmış 100 mL yuvarlak dipli şişe yerleştirin.</li>
		<li>Şişeye Conc. H2SO4 (%98, 30 mL) ekleyin ve karışımı eritmek için karıştırın.</li>
		<li>Etil 4-kloroasetasetat (10 mL, 74 mmol) damla ekleyin.</li>
		<li>Karışımı ortam sıcaklığında 5 gün karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Ayrıca, ezilmiş buz küplerini (~200 mL) 500 mL Erlenmeyer şişesine yerleştirin.</li>
		<li>Buz içine reaksiyon karışımı dökün ve ince toz çökelti elde edilene kadar 30 dakika boyunca şiddetle karıştırın.</li>
		<li>Vakum filtrasyon yoluyla çökelti toplamak. Açık kahverengi çökeltiyi beş kez suyla yıkayın.</li>
		<li>BhcCH2Cl'yi açık kahverengi toz (13,57 g, 46,9 mmol) olarak vermek için bir gecede vakum altında çökeltiyi kurulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(6-bromo-7-hidroksicoumarin-4-yl)metanol (BhcCH2OH)
	<ol>
<li>Hazırlanan BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) ve 1 M HCl (300 mL) bir Dimroth kondansatör ile donatılmış 1 L yuvarlak dipli şişe yerleştirin. Karışımı 140 °C'de 5 gün karıştırın. Bu süre sonunda karışımı ortam sıcaklığına kadar soğutun.</li>
		<li>BhcCH2OH(1) açık kahverengi toz (1.0359 g, 3.82 mmol, % 97 verim) olarak verim vakum altında döner buharlaşma ile reaksiyon dan su çıkarın. NOT: BhcCH2Cl'nin 1 g'ı başına 250 mL 1 M HCl kullanılması tatmin edici bir sonuç verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mannich reaksiyonu ile paBhcCH2OH (2) hazırlanması
	<ol>
<li>Paraformaldehit (446.4 mg, 14.9 mmol) 50 mL yuvarlak dipli bir şişeye yerleştirin. Şişeye susuz etanol (5 mL) ve N-metilpropargylamine (1,25 mL, 14,8 mmol) ekleyin.</li>
		<li>Ar atmosferi altında 1 saat ortam sıcaklığında karışımı karıştırın.</li>
		<li>BhcCH2OH(1)(1,367 g, 5,04 mmol) şişeye ekleyin. Karışımı bir blok ısıtıcı aparatı ile 80 °C'ye ısıtın ve ar atmosferi altında 80 °C'de 2 saat boyunca karışımı karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Blok ısıtıcıyı durdurun ve reaksiyon karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun.</li>
		<li>Vakum filtrasyon ile ortaya çıkan açık kahverengi-sarı çökelti toplayın. Çökeltiyi az miktarda susuz etanol (her seferinde 1 mL) ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>PaBhcCH2OH (2) (1,393 g, 3,96 mmol) verim için vakum altında aşırı etanol çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tıklanabilir kafesli bileşiklerin hazırlanması
NOT: Hidroksil, amino ve karboksil fonksiyonel gruplar içeren diğer tıklanabilir kafesli bileşiklerin hazırlanmasında aşağıdaki işlemler uygulanabilir.
<ol><li>
Genel Prosedür 1: Tıklanabilir kafesli amin hazırlanması
	<ol>
<li>Yer paBhcCH2OH (2) (709.6 mg, 2.02 mmol) ve N,N'-karbonil diimidazol (CDI, 397.6 mg, 2.45 mmol) bir 30 mL yuvarlak dipli şişe. Kuru CH2Cl2 (6 mL) ekleyin ve çözeltiyi ortam sıcaklığında 1 saat karıştırın.</li>
		<li>4-dimethylaminopyridine (4-DMAP, 324.8 mg, 2.66 mmol) ve tert-butil (6-aminoheksil)karbamate (533.1 mg, 2.46 mmol) ekleyin. Çözeltiyi ortam sıcaklığında 3 saat karıştırın.</li>
		<li>Vakum altında bir döner evaporatör kullanarak çözücü ve diğer uçucu malzemeleri çıkarın. Doğrudan silika jel flaş sütun kromatografisi kullanarak kalıntı arındırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genel Prosedür 2: Tıklanabilir kafesli alkol hazırlanması
	<ol>
<li>Paclitaxel yerleştirin (PTX, 48.7 mg, 0.057 mmol) üç yönlü stopcock ve Ar balonu ile donatılmış bir 30 mL yuvarlak dipli şişe. Kuru CH2Cl2 (1 mL), 4-DMAP (17.1 mg, 0.14 mmol) ve 4-nitrofenil kloroformate (26.0 mg, 0.13 mmol) ekleyin.</li>
		<li>Ar atmosferi altında 2,5 saat ortam sıcaklığında çözeltiyi karıştırın.</li>
		<li>Çözeltiye 4-DMAP (15.7 mg, 0.13 mmol) ve paBhcCH2OH(2) (39.1 mg, 0.111 mmol) ekleyin. 17 saat ortam sıcaklığında karışımı karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Karışıma CHCl3 (10 mL) ve %15 sulu NaHCO3 (5 mL) ekleyin. Karışımı yaklaşık 3 dk kadar şiddetle karıştırın. Sulu katmanı pipetle çıkarın.</li>
		<li>Organik tabaka içeren şişeye 0,5 M sitrik asit (5 mL) ekleyin. Karışımı karıştırın ve yukarıdaki gibi sulu tabaka kaldırın.</li>
		<li>Faz ayırma sütunu kullanarak organik katmanı ayırın. Vakum altında bir döner evaporatör ile çözücüler çıkarın. Ürünü standart silika jel flash kolon kromatografisi kullanarak arındırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genel Prosedür 3: Tıklanabilir kafesli karboksilik asit hazırlanması
	<ol>
<li>Kuru CH2Cl2 (2 mL) araşidonik asit (33.0 μL, 0.100 mmol), paBhcCH2OH(2) (39.6 mg, 0.112 mmol) ve 4-DMAP (14.1 mg, 0.115 mmol) eritin. N,Nt-diisopropilkarbodiimide (DIPC, 17.0 μL, 0.110 mmol) ekleyin ve 140 dk boyunca ortam sıcaklığında çözeltiyi karıştırın.</li>
		<li>Vakum altında çözücü çıkarın. Doğrudan silika jel flaş sütun kromatografisi kullanarak kalıntı arındırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Tıklanabilir kafesli bileşikler içine fonksiyonel bir birim kurulumu
<ol><li>0.1 M CuSO4 çözeltisi vermek için iyon değişimi (IEW, 10 mL) içinde bakır(II) sülfat pentahidrat (249 mg) çözün.</li>
	<li>20-paBhcmoc-PTX (8.0 mg, 6.5 μmol), tris (3-hidroksipropilrinolylmethyl)amin (THPTA, 17.5 mg, 40.3 μmol), sodyum l-askorbat (162.4 mg, 0.825 mmol) ve 15-kloro-3,6,9-triksapentadecyl azid (3.1 mg, 11 μmol) 0.1 M fosfat karışık çözücü tampon (2,5 mL, pH 7.2) ve dimetil sülfoksit (DMSO, 0.5 mL).</li>
	<li>Reaksiyon karışımına 0,1 M CuSO4 çözeltisini (81,2 μL, 8,1 μmol) ekleyin. Karışımı 80 dakika ortam sıcaklığında karıştırın. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanarak reaksiyonun ilerlemesini izleyin.</li>
	<li>%75 asetonitril/su çözeltisi (3,5 mL) ekleyerek çökeltileri çözün. Elde edilen çözümü, istenilen ürünü arındırmak için doğrudan yarı preparative HPLC sistemine uygulayın. NOT: Reaksiyon karışımının tert-butanol ilavesi ile çözünürasyonu reaksiyonun ilerlemesini hızlandırabilir.</li>
</ol>4. Kafesli bileşiklerin fotolitik uncaging reaksiyonu
<ol><li>Stok çözümlerinin hazırlanması
	<ol>
<li>10 mM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için istenilen kafesli bileşiği (5 μmol) DMSO'da (500 μL) çözün. Her çözeltinin (10 μL) bir aliquot'u 1,5 mL'lik mikrosentrifuge tüpüne dağıtın ve kullanmadan hemen öncesine kadar dondurucuda (−20 °C) saklayın.</li>
		<li>6 mM K3[Fe(C2O4)3] ( 100 mL): 80 mL suda yeniden kristalize potasyum ferrioksalat (0,295 g, 0,675 mmol) çözünür. Hacmi 100 mL'ye çıkarmak için 0,5 M H2SO4 (10 mL) ve uygun miktarda IEW ekleyin. NOT: Potasyum ferrioksalat sıcak sudan rekristalizasyon yoluyla arıtılmalı ve karanlıkta depolanmalıdır. Rekristalize potasyum ferrioksalat trihidrat olarak elde edilir; bu nedenle formülü K3[Fe(C2O4)3]·3H2O'dur ve stok çözeltisinin hazırlanması sırasında 491,24 formül ağırlığı düşünülmelidir. 510 nm'de emilimini ölçerek 6 mM çözeltinin saflığını kontrol edin. Emicilik <0.02 ise, deneyde kullanıma uygundur.</li>
		<li>%0.1 Tampon-phen (30 mL): Çözün NaOAc·3H2O (7.35 g), 1,10-fenanthroline (fen)· H2O (30 mg) ve conc. H2SO4 (0.9 mL) IEW (20 mL). Hacmi 30 mL'ye çıkarmak için IEW ekleyin. NOT: Çözelti 1.8 M NaOAc, 0.54 M H2SO4ve %0.1 1,10-fenantropin içerir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ferrioksalat aktinometrisi kullanan fotonların sayısının ölçülmesi
	<ol>
<li>6 mM K3[Fe(C2O4)3](V1 L) bir kuvars cuvette yerleştirin. Çözeltiyi 5 s için 350 nm ışıkla ışınlayın.</li>
		<li>Işınlanmış çözeltiyi l [cm] yol uzunluğuna sahip bir Pyrex cuvette'ye aktarın.</li>
		<li>Işınlanmış numune çözeltisine %0,1 Tampon-phen(V2 L) ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. Numunenin emiciliğini 510 nm olarak ölçün. Birim zaman başına ortalama soğurma değişimini hesaplayın (ΔA510 [s−1]).</li>
		<li>Oluşturulan Fe2+ iyonlarının birim zaman başına mol sayısını aşağıdaki denkleme göre hesaplayın: nFe2+ [mol s−1] = ((V1 + V2) [L] × ΔA510 [s−1])/( l [cm] × ε510 [L mol−1 cm−1 ]), nerede (V1 + V2) emme ölçümü için numunenin hacmi, l cuvette optik yol uzunluğu ve ε510 Fe 2+molar absorptivity olduğunu - 510 nm fen kompleksi. NOT: Tipik deneysel koşullarda V1 = 2,0 × 10−3 L, V2 = 0,33 × 10−3 L, l = 1,0 cm ve ε510 = 1,1 × 104 L mol−1 değerleri cm−1 kullanılmıştır.</li>
		<li>Aşağıdaki formülü kullanarak örneğe ulaşan fotonların mol sayısını(I0)hesaplayın: I0 [einstein cm−2 s−1] = nFe2+/Φ350 Φ 350 350 nm ferrioksilin fotonüksiyon kuantum verimliliği nerede. NOT: Potasyum ferrioksalat aktinometrenin 350 nm'deki kuantum verimi bildirilmemiş olsa da, 358 nm'de 1.2542'lik bildirilen değer kullanıldı.</li>
	</ol></li>
	<li>Kuantum verimliliği ölçümleri 350 nm
	<ol>
<li>K-MOPS'de %0,1 DMSO içeren 10 μM çözeltisi vermek için numune stok çözeltisini (DMSO, 10 μL'de) K-MOPS tamponu (pH 7.2, 10 mL) ile seyreltin. NOT: K-MOPS tamponu 100 mM KCl ve 10mM 3-(N -morfolino)propansülfonik asit (Paspaslar) koh ile pH 7.2 titrated oluşuyordu.</li>
		<li>Çözeltinin(V1 L) bir aliquot'unun kimyasal aktinometrenin fotoreaksiyonunda kullanılan aynı cuvette aktarılması. Adım 4.2.1'de açıklandığı gibi aynı kurulumu kullanarak örnek çözümünü ışınlayın.</li>
		<li>Radyasyonlu çözeltiden periyodik olarak bir aliquot (50 μL) çıkarın ve HPLC kullanarak analiz edin.</li>
		<li>Başlangıç materyalinin %90'ının(t%90)başlangıç materyalinin zamana bağlı kayboluşunun çizimlerini takarak tepki verdiği ışınlama süresini saniyecinsinden belirleyin. NOT: Radyasyonun iç filtrelemesi ihmal edilebilsin diye ışınlanan numunenin absorbesi <0.1'de muhafaza edilmelidir. Başlangıç materyalinin fotolitik tüketiminin tek üstel bozunma ile yaklaşık olarak tahmin edilebildiği, böylece fotolyzin işlemini engelleyen istenmeyen ikincil etki olmaması istenir.</li>
		<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak kaybolma kuantum verimi hesaplamak (Φdis)28: Φdis = 1/(t%90 × I0 × σ350) t%90 [s] başlangıç materyalinin% 90 tüketilen ışınlama süresi ise, I0 [einstein cm−2 s−1] foton benlerinin sayısı ve σ350 [cm 2 mol−1] 350 nm'deki numunenin dekadik yok olma katsayısıdır. NOT: σ350 [cm2 mol−1] = 103ε350 [M−1 cm−1].</li>
	</ol></li>
</ol>5. HaloTag ligand ile tıklanabilir kafesli bir bileşiğin hedeflemi
NOT: Kullanmadan önce, Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamda (DMEM, düşük glikoz, sodyum pirüuvat, l-glutamin) %10 oranında fetal sığır serumu (FBS) içeren hela hücrelerini %1 antibiyotik (streptomisin sülfat, penisilin G ve amfetamin) 37 °C ve %5 CO2.
<ol><li>Orta yı çıkarın ve 37 °C'de tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA, 1 mL) ile 1 dk. Hücrelere DMEM (4 mL) ekleyin ve yavaşça borular atarak hücreleri yeniden askıya alın. Tohum yaklaşık 5 × 105 hücre dmem içinde 35 mm cam alt yemekleri içine (2 mL) 24 saat transfection önce.</li>
	<li>Dört tabak için, 1,5 mL mikrosantrifüj tüp, plazmid DNA seyreltmek (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) azaltılmış serum ortamda (700 μL). Ayrıca, indirgenmiş serum ortamındaki (150 μL) lipofection reaktifini (5 μL) dört tüpün her birine seyreltin ve 5 dakika ortam sıcaklığında durmalarını bekleyin.</li>
	<li>Seyreltilmiş plazmid DNA'sının (150 μL) bir kısmını seyreltilmiş lipofection reaktif örneklerinin her birine ekleyin. 5 dakika ortam sıcaklığında kuluçka.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 24 saat boyunca koruduktan sonra DMEM'i aspire edin ve fosfat tamponlu salin (PBS, 2 mL) ile hücreleri durulayın. Azaltılmış serum ortamını (1,5 mL) ekleyin.</li>
	<li>Her çanağa plazmid-lipofection reaktifi (150°L) kompleksi ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 48 saat boyunca koruyun.</li>
	<li>Ortamı aspire edin, 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo içeren taze hazırlanmış DMEM'in (1 mL) bir kısmını ekleyin ve hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kafesli bileşiği içeren ortamı aspire edin ve hücreleri iki kez PBS+ (durulama başına 1 mL) ile durulayıp bağlanmamış bileşikleri temize çıkarın. Azaltılmış serum ortamını (500 μL) ekleyin ve hücrelere giren bileşikleri çıkarmak için hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: PBS+ 2 mM CaCl2 ve 1 mM MgCl2ile takviye fosfat tamponlu salindir.</li>
	<li>Ortamı çıkarın ve PBS+ (1 mL) ile hücreleri iki kez durula. Fenol kırmızısı içermeyen bir orta (1 mL) bölümünü ekleyin. Lazer tarama confocal floresan mikroskopi ile floresan görüntüleri kaydedin.</li>
</ol>6. Tıklanabilir kafesli bileşik kullanarak kinaz lokalizasyonunun fotoaracımodülasyonu
NOT: Kullanmadan önce Ham'ın F-12 ortamındaki CHO-K1 hücrelerini 37 °C'de %10 FBS ve %5 CO2ile desteklenerek muhafaza edin.
<ol><li>DMSO'da 100× çalışma çözeltisi (1 mM)paBhc-AA(5)hazırlayın. NOT: Bileşiğin 10 mM'lik stok çözeltisi hazırlanır ve dondurucuda (-20 °C) saklanır.</li>
	<li>Tohum yaklaşık 5 × 105 hücre dmem içinde 35 mm cam alt yemekleri içine (2 mL) 24 saat transfection önce.</li>
	<li>Transfect CHO-K1 hücreleri gfp-DGKγ için bir plazmid kodlama ile 48 h uncaging deneyler önce. NOT: Transfeksiyon 5.2-5.5 adımlarına göre yapılır.</li>
	<li>Orta ortamı azaltılmış bir serum ortamı (2 mL) ile değiştirin. 100× paBhc-AA çalışma çözeltisini (20 μL) ekleyin ve hücreleri 37 °C ve %5 CO2'de 5 dakika ile 1 saat arasında kuluçkaya yatırın. NOT: Yükleme süresi kullanılan bileşiğe bağlıdır.</li>
	<li>Hücreleri, çift ışık kaynağı floresan aydınlatıcı ile donatılmış ters floresan mikroskobun nesnel aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Floresan görüntü alın her 10 s. Uygun bir süre için bir mikroskop hedefi ile 330-385 nm ışık ile hücreleri ışın. Alternatif olarak, esnek kuvars lifleri ile xe lamba kullanarak 405 nm ışık ile hücreleri ışın.</li>
	<li>10 dakika boyunca floresan görüntüleri kaydetmeye devam edin.</li>
</ol>

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Daha önce yüksek fotolitik verimlilik28,45,46,47sergileyen çeşitli biyolojik olarak aktif moleküllerin Bhc kafesli bileşikler geliştirdi. Bhc caging gruplarının repertoire genişletilmesi amacı ile, biz de çeşitli fonksiyonel birimlerin tanıtımı ile kolayca değiştirilebilir modüler kafesli bileşiklerin platformları bildirdi32,40,41. Bu nedenle bu protokol, bakır(I)-katalize Huisgen siklizasyonu ile değiştirilebilen Bhc caging gruplarının tıklanabilir bir öncüsünün sentezi için bir yöntem temsil eder. Tıklanabilir öncül sentezi, paBhcCH2OH (2), ticari olarak kullanılabilir 4-bromoresorcinol başlayan dört adımlı reaksiyon dizisi ile elde edildi (Şekil 1A). Mevcut protokolün avantajı, zahmetli arınma adımlarının (örneğin, sütun kromatografik ayrımları) gerekli olmamasıdır.
Tıklanabilir öncül paBhcCH2OH (2) çeşitli fonksiyonel grupları maskelemek için kullanılabilir gibi, aminlerin tıklanabilir kafesli bileşikler, alkoller, ve karboksilik asitler öncüsü olarak 2 kullanılarak sentezlendi (Şekil 1B). Aminler karbamates olarak modifiye edildi, alkoller ise karbonat olarak modifiye edildi. Genel prosedürler 1 ve 2'de tıklanabilir karbamatelerin hazırlanmasında CDI, karbonatların hazırlanmasında ise 4-nitrofenil kloroformate kullanılmıştır. Reaksiyon mekanizmasından da anlaşılarak, her iki reaktif de karbatür ve karbonat ların hazırlanmasında kullanılabilir. Ayrıca istenilen kafesli bileşiğin verimi kafesli edilecek molekülün kimyasal yapısına bağlıdır unutulmamalıdır. Diğer örnekler önceki raporlarımızda görülebilir28,30,33,48.
Tıklama modifikasyonu daha sonra bildirilen yordamın küçük bir değişiklik kullanılarak yapıldı49. Tris (triazolylmethyl)amin bazlı ligands eklenmesi yüksek verim iyi istenilen ürünleri elde etmek için gereklidir. Çeşitli azideler hem ticari kaynaklardan hem de literatür prosedürlerinden kolayca elde edilebildiği için, su çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özelliklere sahip çeşitli modüler kafesli bileşikler hazırlayabiliriz(Şekil 2).
Fotolik kuantum verimi daha sonra bildirilenprosedür28,50göre ölçüldü . Şekil 3, 20-glc-paBhcmoc-PTX'in fotolitik tüketimi ve PTX salınımının sırasıyla tek üstel bozunma ve yükselme ile yaklaşık olarak, radyasyonun iç filtreleme veya istenmeyen ikincil etkilere işaret ettiğini göstermektedir. Geliştirilmiş fotolik kuantum verimleri(Φ) ve fotolik isbik verimlilikleri(εΦ)daha önce bildirilen Bhc kafesli bileşikler(Tablo 1)41 ile karşılaştırıldığında tıklanabilir paBhc kafesli bileşikler için gözlendi , 43- Bhc kafesli bileşiklerin fotolik verimi(εΦ)2-nitrobenzil tipi kafeslibileşikler48'denyüz kat daha yüksek olduğundan, paBhc caging gruplarının varlığından kaynaklanan belirgin iyileşme açıkça bu sistem için bir avantaj.
Kavram kanıtı deneyi olarak 20-paBhcmoc-PTX(4)içine hidrofilik moiety, bileşik 3'e hücresel hedefleme ligandı(Şekil 2)getirilmiştir. 20-glc-paBhcmoc-PTX'in su çözünürlüğü ana PTX'ten 650 kat daha yüksekti (Tablo 1). Selektif hücresel hedefleme bir etiket-prob sistemi kullanılarak elde edildi ve HaloTag ligand'ı taşıyan paBhcmoc-hex-FITC/Halo(8)HaloTag/EGFR füzyon proteinini ifade eden kültürlü memeli hücrelerinin hücre zarına başarıyla hedeflenmiştir ( Şekil 4). Bir kizazın hücre altı lokalizasyonunun foto-aracılı modülasyonu da tıklanabilir kafesli bileşik 5 kullanılarak elde edilmiştir(Şekil 5).
Sonuç olarak, biyolojik olarak ilginç moleküllerin foto kafesli bileşikleri için tıklanabilir platformların hazırlanması için bir yöntem başarıyla gösterdik. hedefleme yeteneği. PaBhc caging grubu değiştirilebilir fonksiyonel gruplara sahip molekülleri hazırlamak için kullanılabildiğinden, mevcut protokolün uygulanması burada tanımlanan moleküllerle sınırlı değildir. Modüler bir platform kullanarak, yani paBhc caging grubu, istenilen kafesli bileşikler kolayca hazırlanabilir, ve fiziksel ve kimyasal özellikleri tıklama modifikasyonu ile modüle edilebilir.

Kafesli bileşikler, orijinal işlevleri kovalent olarak bağlı foto çıkarılabilir koruma grupları tarafından zamansal olarak maskelenen sentetik moleküller olarak tasarlanmıştır. İlginçtir, biyolojik olarak ilgili moleküllerin kafesli bileşikler hücresel fizyoloji1,2,3,4,5 spatiotemporal kontrolü için vazgeçilmez bir yöntem sağlar ,6. 1977 yılında, Engels ve Schlaeger cAMP bir membran geçirgen ve fotolabile türevi cAMP72-nitrobenzyl ester bildirdi. Ertesi yıl Kaplan, ATP'nin (NPE-ATP) 1-(2-nitrofenil)etil esterini rapor etti ve bu bileşiği "kafesli" ATP8olarak adlandırdı. O zamandan beri, fotokimyasal olarak çıkarılabilir koruma grupları 2-nitrobenzyls, p-hidroksifenil9, 2-(2-nitrofenil)ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, ve (coumarin-4-yl)metiller14,15,16 kafesli bileşiklerin hazırlanması için kullanılmıştır.
Membran geçirgenliği, suda çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi arzu edilen ek özelliklere sahip kafesli bileşiklerin sentezinin hücre biyolojik uygulamalarını kolaylaştırması beklenmektedir. Bu moleküllerin fiziksel ve fotokimyasal özellikleri öncelikle onları hazırlamak için kullanılan fotokimyasal çıkarılabilir koruma gruplarının kimyasal yapısına bağlı olduğundan, foto-caging gruplarının farklı bir repertoire gereklidir. Ancak, yüksek fotolik verimliliği sergileyen mevcut caging gruplarının yapısal çeşitliliği sınırlıdır. Bu kafesli bileşiklerin kullanımını artırmak için bir engel olabilir.
Bu sorunu gidermek için, foto-caging grupların repertuarı mevcut fotoremovable koruma gruplarının kimyasal modifikasyonu veya üstün fotofizik ve fotokimyasal özelliklere sahip yeni fotolabile kromoforların tasarımı ile genişletildi. Örnekler nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenil)-2-butil] (DMNPB)18,19, kalsiyumduyarlı 2-nitrobenzyl fotocage20, yerine komarinylmeethyls (DEAC45021 , DEAdcCM22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, ve styryl coumarins24), siyanür türevleri (CyEt-pan)25, ve BODIPY türevleri26,27.
Buna ek olarak, daha önce (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)metil (Bhc) grubu geliştirdik ve başarılı nörotransmitterlerin çeşitli kafesli bileşikler sentezlenmiş28, ikinci haberciler29,30, ve oligonükleotidler31,32,33 büyük bir ve iki foton uyarma kesitleri sergileyen. Ek özellikler onların Fotosensitivite ödün vermeden caging gruplarına kolayca kurulabilir, o zaman kafesli bileşiklerin repertoiregenişletilebilir 34,35,36, 37,38,39. Bu nedenle üç bölümden oluşan modüler kafesli bileşikler tasarladık, yani bir fotoğraf duyarlı çekirdek olarak Bhc grubu, ek işlevlerin kurulumu için kimyasal kolları, ve maskelenecek moleküller40, 41. yıl.
Böylece, bu makalede biyolojik olarak ilgili moleküllerin kafesli bileşiklerin hazırlanması için pratik bir yöntem sağlar. Bu protokol, foto-caging grupları için tıklanabilir bir platform hazırlanması için yöntemler açıklar, kafesli bileşiklerin repertuarGenişletmek için ek işlevlerin giriş, fiziksel ve fotokimyasal ölçümü özellikleri ve daha fazla hücresel uygulama için tıklanabilir kafesli bileşiğin hücre tipi seçici hedefleme.

<table><tbody><tr><td>asetonitril, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>asetonitril, süper susuz</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-bromoresorsinol</td><td>TCI Kimyasalları</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N, N'-karbonildiimidazol</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Kanto</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>Bakır (II) Sülfat Pentahidrat, %99,9</td> <td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>diklorometan, susuz</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N, N'-Diizopropilkarbodiimid (DIPC)</td> <td>TCI Kimyasalları</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetilaminopiridin</td><td>TCI Kimyasalları</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsülfoksit, susuz -süper-Kanto</td><td></td> <td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>çift ışık kaynaklı floresan aydınlatıcısı, IX2-RFAW</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>Etil 4-Kloroasetoasetat</td><td>TCI Kimyasalları</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin ve Fenol Kırmızısı ile Jambon F-12</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>hidroklorik asit</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>ters floresan mikroskop IX-71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOLUTE Faz Ayırıcı, 15 mL</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Askorbik Asit Sodyum Tuzu</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>lazer taramalı floresan konfokal mikroskopi, FLUOVIEW FV1200 / IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>lipofeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>3- (N-morfolino) propansülfonik asit</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-nitrofenilkloroformat (4-NPC)</td> <td>TCI Kimyasalları</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, fenol kırmızısı içermez</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>azaltılmış serum ortamı fenol kırmızısı içermez</td></tr><tr><td>1,10-Feantrolin Monohidrat</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>RPR 350 nm lambalı fotokimyasal reaktör</td><td>Rayonet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Trioksalatoferrat (III) trihidrat</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat Trihidrat</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik Asit, %96-98</td> <td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amin (THPTA)</td><td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>tri-Sodyum Sitrat Dihidrat</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>Ksenon ışığı kaynak, MAX-303</td><td>Asahi Spektrumu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tıklanabilir kafesli bileşiklerin tasarımı, sentezi ve fotokimyasal Özellikleri

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Kafesli bileşikler yüksek spatiotemporal çözünürlük ile hücre fizyolojisinin fotoğraf aracılı manipülasyon sağlar. Ancak, şu anda mevcut caging gruplarının sınırlı yapısal çeşitliliği ve fotolik verimliliklerinden ödün vermeden sentetik modifikasyondaki zorluklar, canlı hücre için kafesli bileşiklerin repertifesini genişletmenin önündeki engellerdir. Uygulama. Coumarin tipi foto-caging gruplarının kimyasal modifikasyonu, çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip kafesli bileşiklerin hazırlanması için umut verici bir yaklaşım olduğundan, değiştirilebilir tıklanabilir kafesli bileşiklerin sentezi için bir yöntem rapor ediyoruz. bakır(I)-katalize Huisgen siklizasyon yoluyla çeşitli fonksiyonel birimleri ile kolayca. Modüler platform molekülü bir (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)metil (Bhc) grubu bir foto-caging grubu olarak içerir, hangi geleneksel 2-nitrobenzyls göre yüksek fotoliz verimliliği sergiler. Amin, alkol ve karboksilat içeren tıklanabilir kafesli bileşiklerin hazırlanması için genel prosedürler sunulmaktadır. Su çözünürlüğü ve hücre hedefleme yeteneği gibi ek özellikler kolayca tıklanabilir kafesli bileşikler dahil edilebilir. Ayrıca, fotolik kuantum verimi de dahil olmak üzere fiziksel ve fotokimyasal özellikleri ölçüldü ve ilgili Bhc kafesli bileşiklerin daha üstün olduğu bulunmuştur. Bu nedenle açıklanan protokol, mevcut kafesli bileşiklerdeki yapısal çeşitliliğin olmaması için potansiyel bir çözüm olarak düşünülebilir.

Araşidonik asit ve paklitaksel gibi biyolojik olarak ilginç moleküllerin tıklanabilir kafesli bileşikleri başarıyla sentezlendi (Şekil 1)28,41. Su çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özellikler bakır(I)-katalize Huisgen siklizasyon ("Click" reaksiyonu)(Şekil 2)ile paBhcmoc-PTX'e girmiştir. Bu tıklanabilir kafesli PTX'ler daha sonra 350 nm(Şekil 3)ışınlama üzerine ana PTX'lerini üretmek için fotoize edildi ve tıklanabilir kafesli bileşiklerin fiziksel ve fotokimyasal özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Tıklanabilir kafesli bileşiklerin kuantum verimleri 20-glc-paBhcmoc-PTX (Φdis 0.14) ve paBhc-AA(Φdis 0.083) iki katından fazla geleneksel Bhc kafesli bileşikler 20-Bhcmoc-PTX (Φdis 0.040) ve Bhc-AA (Φdis 0.038)43. Buna ek olarak, bir glikoz moiety içeren 20 glc-paBhcmoc-PTX için geliştirilmiş bir su çözünürlüğü gözlenmiştir.
Canlı hücre deneylerinde, halotag proteininin füzyon proteinini ve epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) geçici olarak ifade ettiği kültürlü memeli hücrelerine paBhc-hex-FITC/Halo'nun hedefleştirilmesi başarıyla sağlanmıştır. Hücre zarında paBhc-hex-FITC/Halo floresanının yeşil floresansı gözlendi (Şekil 4). Bir kininin hücre altı lokalizasyonunun foto-aracılı modülasyonu paBhc kafesli bir bileşik kullanılarak elde edilmiştir. Diacylglycerol kigaz γ translokasyonu (DGKγ) araşidonik asit varlığında aktive olduğu bildirilmiştir (AA)44. GFP-DGKγ'i geçici olarak ifade eden CHO-K1 hücreleri AA veya paBhc-AA(5)ile tedavi edildi. AA eklenmesi DGKγ alt hücreli lokalizasyonumodülasyonu neden oldu (Şekil 5A,B). UV ışığına maruz kaldıktan sonra paBhc-AA ile tedavi edilen hücrelerde DGKγ lokalizasyonunda benzer değişiklikler gözlenmiştir(Şekil 5C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg"> Şekil 1: Tıklanabilir kafesli bileşiklerin hazırlanması. (A) Reaktifler ve koşullar: a. etil 4-kloroasetasetat/conc. H2SO4/rt/7 gün/91% verim, b. 1 M HCl/reflü/3 gün/97% verim. c. N-metilpropargylamin /HCHO/EtOH, sonra ekleyin (1) ve reflü ısı 17 h/79% verim için. (B) Tıklanabilir kafesli amin, PTX ve araşidonik asit sentezleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg"> Şekil 2: Fonksiyonel ünitelerin tıklanabilir kafesli bileşiklere yerleştirilmesi. (A) Bakır(I)-katalize Huisgen siklizasyon yoluyla suda çözünen kafesli PTX sentezi. (B) Hücresel hedefleme için HaloTag ligand içeren tıklanabilir kafesli bileşiklerin yapıları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg"> Şekil 3: 20-glc-paBhcmoc-PTX fotolisisi (6). K-MOPS çözeltisindeki (pH 7.2) numuneler (10 μM) 350 nm'de ışınlandı. (A) 6 fotoliz için tipik HPLC izleri (254 nm olarak ölçülür). Numuneler belirtilen ışınlama zamanında analiz edildi. (B) Fotolilyz için zaman kursu 6. Mavi daireler tüketimini gösterir 6. Düz çizgi, basitbir çürüyen üstel 6 için uygun en az kareler eğrisi gösterir. Kırmızı kareler PTX'in verimini gösterir. Hata çubukları standart sapmayı (±SD) temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg"> Şekil 4: PaBhc-hex-FITC/Halo ile kuluçkaya yatan kültürlü memeli hücrelerinin floresan görüntüleri (8). PCDNA3-Halo-EGFR ile transfeced hücreler 30 dakika boyunca 37 °C'de 8 mm bileşik 8'in 2 μM çözeltisi ile inküküle edildi. Görüntüler PBS+ ile tekrar tekrar yıkandıktan sonra elde edilmiştir. Mock-treated HEK293T hücreleri (A: diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntü ve D: floresan görüntü). HEK293T hücreleri(B ve E) ve HeLa hücreleri (C ve F) geçici olarak Halo-EGFR(B ve C: DIC görüntüleri ve E ve F: floresan görüntüleri) ifade eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg"> Şekil 5: BHC kafesli araşidonik asit ile inkübe CHO-K1 hücrelerinin UV ışınlama sonra Floresan görüntüleri. CHO-K1 hücreleri bir füzyon proteini DGKγ-EGFP ile transfekslendi. (A) Transfected hücrelerin floresan görüntüsü. (B) 100 s araşidonik asit 10 μM çözeltisi ilave sonra. (C) Hücreler, 20'li UV ışınlamadan (330-385 nm)sonra 37 °C'de 10 μM'lik paBhc-AA çözeltisi ile(D) 100 s'lik bir tüp altında kuvedilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşik</td>
			<td>λmax (nm)a
</td>
			<td>εmax (M-1 cm-1)b
</td>
			<td>φdisc
</td>
			<td>εφdisd
</td>
			<td>Çözünürlük (μM)e
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptx</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0.040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0.059</td>
			<td>670</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2'-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0.14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0.038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0.083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tıklanabilir kafesli bileşiklerin fiziksel ve fotokimyasal özellikleri. a. Absorpsiyon maksimum (nm), b. Λmax (M−1 cm−1), c. Başlangıç malzemelerinin 350 nm'de kaybolmasının kuantum verimi, d. Molar absorptivity ürünü ve 350 nm, e de kaybolma kuantum verimi. K-MOPS'deki doymuş çözeltinin konsantrasyonu (pH 7.2) (μg mL−1).

Modüler kafesli bileşiklerin tıklanabilir moieties ile fotokimyasal özelliklerinin sentezi ve ölçümü için bir protokol sunulmuştur.

Tıklanabilir Kafesli Bileşiklerin Tasarımı, Sentezi ve Fotokimyasal Özellikleri

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Bu prosedürün genel amacı, su çözünürlüğü veya hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özelliklere sahip fotokafesli bileşiklerin hazırlanması için pratik bir yöntem sağlamaktır. Basit bir sentetik prosedür kullanarak, bu teknik kafesli bileşikler üzerinde laboratuvar genişletmek ve onların Fotosensititi ödün vermeden ek özelliklere sahip kafesli bileşikler yapmak için kullanılabilir. Tıklanabilir kafesli bileşiklerimiz diklorometan veya dimetil sülfoksit gibi nükleofil olmayan organik çözücülerde çözündüğünde foto-ışınlamaya karşı kararlı olduğundan bu sentez standart bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir.Hirona Sasaki ile prosedürü gösteren Akinobu Suzuki, bir post-doc, Hanami Aoki ve Rei Watahiki, laboratuvardan yüksek lisans öğrencileri olacaktır. 30 mililitrelik yuvarlak dipli bir şişeye 709,6 miligram paBhc metanol ve 397,6 miligram n-karbonildiimidazol ekleyerek başlayın. Şişeye kuru altı mililitre diklorometan ekleyin ve çözeltiyi ortam sıcaklığında bir saat karıştırın.Kuluçka sonunda, 4-Dimethylaminopyridine 342.8 miligram ve tert-butyl altı-amino heksil karbamate 552 mikrolitre ekleyin ve ek bir üç saat için ortam sıcaklığında çözelti karıştırın. Daha sonra çözücü ve diğer uçucu maddeleri çıkarmak için vakum altında bir döner evaporatör kullanın ve doğrudan kalıntı arındırmak için silika jel flaş sütun kromatografisi kullanın. Tıklanabilir kafes bileşkesine fonksiyonel bir ünite yerleştirmek için, 0,1 molar bakır sülfat çözeltisi vermek için 10 mililitre iyon-exchanged su bakır iki sülfat pentahidrat 249 miligram çözünür.İki asal paBhc mock paklitaksel sekiz miligram çözün, tris 7.5 miligram (3-hidroksipropyltriazolylmethyl)amin, 162.4 miligram sodyum-l-askorbat ve 3.1 miligram 15-kloro-3, 6, 9-trioksipentyldecyl azit karışık bir çözücü içinde 2.5 mililitre 0.1 molar fosfat tampon ve dimetil sülfoksit 0.5 mililitre. Daha sonra reaksiyon karışımına 81,2 mikrolitre 0,1 molar bakır sülfat çözeltisi ekleyin ve karışımı 80 dakika ortam sıcaklığında karıştırın ve HPLC ile reaksiyonun ilerlemesini izleyin. Reaksiyonsonunda, %75 asetil nitryl su çözeltisinin 3,5 mililitresi ile çökelticileri çözün ve elde edilen çözeltiyi istenilen ürünü arındırmak için doğrudan yarı preparative HPLC sistemine uygulayın.Kuantum verimliliği ölçümleri için, UV ışık kesme filtresi ile kaplanmış floresan lambalar altında, 10 mililitre KMOPS tamponu ile 10 mikrolitre dimetil sülfoksit numune stok çözeltisini seyreltin. Çözeltinin bir aliquot'ünü kimyasal aktinometrenin fotoğraf reaksiyonunda kullanılan aynı test tüpüne aktarın. HPLC tarafından analiz edilmek üzere düzenli olarak ışınlanmış çözeltiden 50 mikrolitre aliquots kaldırarak, beş saniye boyunca 350 nanometre ışık ile örnek çözelti ışınlama.Daha sonra, başlangıç malzemesinin %90'ının, başlangıç materyalinin zamana bağlı kayboluşunun çizimlerini takarak tepki verdiği ışınlama süresini saniyeler içinde belirleyin. HaloTag ligand tıklanabilir kafesli bileşik hedefleme için, uygun bir hücre bölünmesi reaktifi ile ilgi hedef hücre popülasyonu hasat ve dMEM konsantrasyonu mililitre başına beşinci hücrelere 2,5 kat 10 hücreleri yeniden askıya. Sonra 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir gecede kuluçka için 35 mililitre cam alt yemekleri içine çanak başına beşinci hücrelere yaklaşık 10 tohum.Ertesi sabah, 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde 700 mikrolitre azaltılmış serum ortamı içeren bir pc DNA üç halo epidermal büyüme faktörü reseptör plazma DNA seyreltmek 14 mikrogram. Daha sonra, dört tüpün her birine 150 mikrolitre azaltılmış serum ortamına beş mikrolitre lipofection reaktifi ekleyin ve tüplerin ortam sıcaklığında beş dakika bekletin. Kuluçka sonunda, seyreltilmiş lipofection reaktif örneklerinin her birine 150 mikrolitre seyreltilmiş plazma DNA'sı ekleyin ve numuneleri beş dakika daha ortam sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, çanak başına pbs iki mililitre ile hücreleri durulayın ve her kültüre azaltılmış serum orta 1.5 mililitre ekleyin. Her çanağa 150 mikrolitre plazmid lipofection reaktif kompleksi ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda, supernatants aspire ve her çanağa iki mikromolar paBhc hex fitzi halesi ile takviye taze hazırlanmış DMEM bir mililitre ekleyin.37 santigrat derecede 30 dakika sonra, kafesli bileşiği içeren ortamı aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS artı ile iki kez durulayın ve herhangi bir bağlanmamış bileşikleri çıkarın. Her çanağa 500 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin ve hücrelere giren bileşikleri çıkarmak için hücreleri 30 dakika daha hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin. Kuluçka sonunda, hücreleri her çanak başına bir mililitre PBS artı ile iki kez durulayın ve her kültüre fenol kırmızısı olmadan bir mililitre orta ekleyin.Daha sonra lazer tarama confocal florescence mikroskopi ile floresan görüntüleri kaydedin. Tıklanabilir kafesli bir bileşik kullanarak kizaz lokalizasyonufotoğraf aracılı modülasyonu için, tohum yaklaşık beş kez 10 ham F12 orta iki mililitre beşinci TOC-A-bir hücreleri için 35 mililitre cam alt çanak. Ertesi gün, sadece gösterildiği gibi 48 saat boyunca GFP diacylglycerol kigaz gama için plazmid kodlama ile hücreleri transfect.Transfeksiyonun bitiminden sonra transfeksiyon supernatantını iki mililitre azaltılmış serum ortasıyla değiştirin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir beş ila 60 dakikalık kuluçka için hücrelere 100 kez paBhcAA çalışma çözümü 20 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, çift ışık kaynağı floresan aydınlatıcı ile donatılmış bir ters floresan mikroskop nesnel sahne üzerinde çanak yerleştirin.Hücreleri 10 saniyede bir, hücreleri deneysel protokole göre uygun deneysel zaman noktalarında ve dalga uzunluklarında ışınlayarak 10 dakikada bir görüntüleyin. Gösterildiği gibi bu yöntem kullanılarak, paklitaksel ve araşidonik asit de dahil olmak üzere bazı biyolojik olarak ilginç moleküllerin tıklanabilir kafesli bileşikler, başarıyla sentezlenebilir. Su çözünürlüğü ve hücresel hedefleme yeteneği gibi ek özellikler bakır bir katalize siklizasyon tıklama reaksiyonu ile paBhc mock paklisel içine tanıtılabilir.Bu tıklanabilir kafesli paclitaxels sonra 350 nanometre ışınlama üzerine ana bileşikleri üretmek için fotoize edilebilir. Tıklanabilir kafesli bileşiklerin fiziksel ve fotokimyasal özellikleri tabloda özetlenmiştir. Canlı hücre deneylerinde, paBhc hex fitzi halo'nun kültürlü memeli hücrelerine hedefleştirilmesi geçici olarak HaloTagged proteinve epidermal büyüme faktörü reseptörünün hücre zarındaki floresan moiety PAHBHC hex fitzi halodan gelen yeşil floresan sinyaline neden olur.Ayrıca, cho-K1 hücrelerinin tedavisi geçici araşidonik asit ile GFP diacyl gliserol kinaz gama ifade diacyl gliserol kinay gama subsellüler lokalizasyonu modülasyonu neden olur gedmislik gliserol kinazg gama. UV ışık maruziyetinden sonra paBhc-AA tedavi edilen hücrelerde de diacyl gliserol kiaz gama lokalizasyonunda benzer değişiklikler gözlenmektedir. Kültür ortamını artıran sulu çözeltilerde caging deneyleri yaparken, kısa dalga boyuna kapaklı filtreli floresan lamba altında her zaman çalıştığınızdan emin olun.Bu prosedürü takiben, su çözünürlüğü, membran geçirgenliği veya hücresel hedefleme yeteneği eksikliği nedeniyle biyolojik deneylerde kullanılmak üzere bol olan kafesli bileşikler inceleyebilirsiniz.

design-synthesis-photochemical-properties-clickable-caged

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Organik boya molekülleri ve oleik asit kaplı yukarı dönüştürücü nanopartiküller suda çözünür değildir. Bu protokol, organik boya moleküllerinin transferini ve partiküllerin başlangıçtaki hidrofobik çözücülerinden suya yukarı dönüştürülmesini sağlayan bir 'tak ve çalıştır' yöntemini tanımlar.

A &#39;Tak ve&#39; Yöntem, bir Amfifilik Polimer, Organik maddeler ve upconverting Nanopartiküller İçeren Su dağılabilir Nanoassemblies oluşturma

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Bu protokol, reaktif saflaştırma, reaksiyon koşulları, Bioconjugate saflaştırma ve Bioconjugate karakterizasyonu dahil olmak üzere, bir maleimid proteini ihtiva eden bir sisteinin bioconjugation için gerekli olan önemli adımlar göstermektedir.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Bu protokol için Kafesli protein kinaz A (PKA), hücresel sinyal iletim bioeffector bir nanopartikül yüzey üzerine immobilize sitozol microinjected ve upconverted UV yakın kızılötesi (Nur) ışınlama ışığı sayesinde inducing aşağı akım stres fiber dağılma sitozol içinde.

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Bu iletişim kuralı ışık tetiklemeli nükleer translocation kafesli moleküler tutkal Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici.

Spatiotemporally Photoactivatable etiketleri kafesli moleküler tutkallar kullanılarak canlı hücreler Konuk nükleer Translocation kontrollü

Keşfedin, tıklanabilir kafesli bileşiklerin sentezi ve fotokimyasal özelliklerini. Bu yöntem, su çözünürlüğü ve hücre hedefleme yeteneği ekleyerek nörobilim araştırmalarında kullanımı genişletir.

Tıklanabilir Kafesli Bileşiklerin Tasarımı, Sentezi ve Fotokimyasal Özellikleri

Daha fazla video keşfet