Name: Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Öğrenin dorsal kök ganglion makrofajlarının enzim içermeyen mekanik dissosiasyon protokolüyle hızlı izolasyonunu. Bu yöntem, nöropatik ağrı ve sinir yaralanmasındaki nöroimmün yanıtları incelemek için yüksek canlılık oranları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çalışma şu şekilde desteklenmiştir: Anestezi Eğitim ve Araştırma Vakfı (XY); UCSF Anestezi ve Perioperatif Bakım Bölümü (XY); ve 1R01NS100801-01(GZ). Bu çalışma kısmen HDFCCC Laboratuvar Hücre Analizi Paylaşılan Kaynaklar Tesisi tarafından NIH (P30CA082103) hibe si ile desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri California San Francisco Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Deneysel farelerden lomber DRG toplamak
<ol><li>Deneye başlamadan önce, 9 ciltlik ortayı 1 birim Ca++ /Mg++-free 10x HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının (örneğin, Percoll) çalışma çözümünün hazırlanın. Buzda tut.</li>
	<li>% 2.5 Avertin ile fare anestezik. Hayvanın arka pençe kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle tamamen anestezi yediğini doğrulayın. NOT: 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanıldı.</li>
	<li>Fareyi 10 mL önceden soğutulmuş 1x PBS ile transkardiolarak aşındırın.<ol>
<li>Fareyi, bant la birlikte kimyasal bir duman kaputunun içine sabitlenmiş dört pençesi ile supine pozisyonuna yerleştirin. Forseps tarafından göğüs kafesi altında deri kaldırın ve karaciğer ve diyafram ortaya çıkarmak için cerrahi makas ile küçük bir kesi yapmak.</li>
		<li>Diyafram ve göğüs kafesi kesmek için makas kullanmaya devam, atan kalp ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde iris makas ile sağ atriyal uzantını kesti. Kanama fark edildikten sonra, sol ventrikülün arka ucuna 30 G iğne yerleştirin ve hayvanA nüfuz etmek için yavaş yavaş 10 mL önceden soğutulmuş 1x PBS enjekte edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yatkın pozisyonda yerleştirilen fare üzerinde dorsal laminektomi15 gerçekleştirin. NOT: Hücre kültürü planlanıyorsa, kesiden önce fareye %70 etanol püskürtün ve diseksiyon için önceden sterilize edilmiş cerrahi aletler kullanın.<ol>
<li>Torasik bölgeden sakral bölgeye kadar bir boylamsal lateral derin kesiler yapmak için bir boyut 11 neşter kullanın. Dorsal kas tabakası ortaya çıkarmak için makas ile cilt çıkarın.</li>
		<li>Lumbosacral omurga süreçleri ve bilateral enine süreçler ortaya çıkana kadar bağ dokuları ve kasları soymak için Friedman-Pearson Rongeur kullanın.</li>
		<li>Dikkatle dorsal spinal kolon açmak için bir Noyes Bahar Makas kullanın, sonra sağlam spinal sinirler bağlı omurilik ortaya çıkarmak için vertebral kemikleri kaldırmak için bir Friedman-Pearson Rongeur geçmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İpsilateral ve kontralateral lomber DRG'yi (çalışmamızda L4/L5 DRG) dikkatlice inceleyin ve 1 mL buz gibi Ca++/Mg++-serbest 1x HBSS'ye yerleştirin. Şimdi dokular 2. NOT: Mümkünse DRG'ye bağlı spinal siniri kırpın.</li>
</ol>2. Fare lomber DRG tek hücreleri yalıtma
<ol><li>Dounce homogenizer 20-25 kez gevşek bir pestisit ile DRG doku homojenize.</li>
	<li>Steril 70 m naylon hücreli süzgeci steril 50 mL konik tüpe yerleştirin. Hücre süzgecini 800 μL buz gibi 1x HBSS ile ıslayın ve akış konik tüpte toplanır.</li>
	<li>Homojenize doku süspansiyonundan bir pipet kullanarak alın ve ıslak 70 μm naylon hücresüzden 50 mL konik tüpe geçirin.</li>
	<li>Homogenizer'i 800 μL buz gibi 1x HBSS ile iki kez durulayın ve verimi artırmak için hücre süzgeci ile aynı 50 mL konik tüpe ayırın.</li>
	<li>Steril 5 mL polistiren FACS tüpüne 1,5 mL'lik dengelenmiş buz gibi izotonik yoğunluk gradyan ortamı (adım 1.1'de hazırlanmış) ekleyin.</li>
	<li>50 mL konik tüpten (adım 2.4) homojen hücreyi FACS tüpüne aktarın, yukarı ve aşağı borular oluşturarak yoğunluk gradyan ortamıyla iyice karıştırın. Üst ünü kapatmak için 500 μL 1x HBSS ek bir ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 20 dk için 800 x g'da santrifüj ile hücreleri pelet.</li>
	<li>FACS tüpünün altındaki hücre peletini rahatsız etmeden orta ortamda miyelin içeren süpernatantı dikkatlice aspire edin.</li>
	<li>FACS analizi için %5 Fetal sığır serumu (FBS) içeren PBS veya FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın. NOT: Bir farenin L4 /L5 DRG'sinden en az 50.000 ila 100.000 hücre beklenir.<ol>
<li>%5 Fetal Sığır Serumu içeren 100 μL PBS'deki mekanik olarak izole edilmiş DRG hücrelerini (L4/L5) yeniden askıya alın ve daha sonra karanlıkta 4 °C'de α-fare CX3CR1-APC antikor (1:2,000) ile kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Hücreleri 5 mL PBS ile bir kez yıkayın; 4 °C'de 8 dk için 360 x g hücreleri santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant aspire, sonra FCAS analizi için PBS 300 μL hücre pelet resuspend. Hücre sıralaması planlanıyorsa, bunun yerine FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+regulation+by+non-neuronal+cells+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation.</a> Science. 354 (6312), 572-577 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+types+of+macrophage+in+dorsal+root+ganglia+and+spinal+nerves+proximal+to+sciatic+and+spinal+nerve+transections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat.</a> Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).</li>
<li>Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+cargo+including+microRNA+regulates+sensory+neuron+to+macrophage+communication+after+nerve+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma.</a> Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).</li>
<li>Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+differences+in+neuropathic+pain+modalities+revealed+by+correlating+behavior+with+global+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling.</a> Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglion+Infiltration+by+Macrophages+Contributes+to+Paclitaxel+Chemotherapy-Induced+Peripheral+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy.</a> The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).</li>
<li>Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+macrophages+reduces+axonal+degeneration+and+hyperalgesia+following+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury.</a> Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).</li>
<li>Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocytes+synergistically+promote+the+transition+from+acute+to+chronic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury.</a> Nature Communication. 7, 12029(2016).</li>
<li>Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cysteine+protease+cathepsin+S+in+neuropathic+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia.</a> Pain. 130 (3), 225-234 (2007).</li>
<li>Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK%2FNF-kappaB-dependent+satellite+glia+activation+induces+spinal+cord+microglia+activation+and+neuropathic+pain+after+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury.</a> Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).</li>
<li>Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+role+of+macrophages+in+generation+of+nerve+injury-induced+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia.</a> Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).</li>
<li>Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Mediates+Neuron-Macrophage+Interactions+to+Drive+Proregenerative+Macrophage+Activation+Following+Preconditioning+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury.</a> Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).</li>
<li>Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+the+peripheral+nervous+system+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury.</a> Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).</li>
<li>Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy6G-+myeloid+cells+mediate+mechanical+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Isolation+and+Primary+Culture+to+Study+Neurotransmitter+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).</li>
<li>Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+in+transgenic+mice+expressing+a+Fas-based+suicide+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).</li>
<li>Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+peripheral+not+central+immune+responses+to+pain-inducing+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury.</a> Science Reports. 7 (1), 16460(2017).</li>
<li>Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine+protease+inhibitor+SerpinA3N+attenuates+neuropathic+pain+by+inhibiting+T+cell-derived+leukocyte+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase.</a> Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar bu el yazması ile ilgili hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Burada etkili fare DRG izole makrofajlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanıtmak. DRG bağışıklık hücrelerini izole etmek için geleneksel yaklaşım enzimatik sindirim gerektirir15,18, şimdi istenmeyen hücre hasarı sınırlamak ve verimi artırmak için protokolümüzde mekanik homojenizasyon ile değiştirilir. Bu nedenle, yeni protokol çok daha az zaman alıcıdır. Daha da önemlisi, enzim sindirim makrofajlar uyarabilir ve moleküler imzayı değiştirmek. Buna karşılık, ...

Bağışıklık hücrelerinin periferik sinir hasarı sonrası nöropatik ağrıkatkıda önemli kanıtlar var1,2. Olgun makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına ve sistemik enfeksiyona yanıt verebildiği bilinmektedir. Spinal dorsal boynuz sinir yaralanması kaynaklı mikroglia aktivasyonu paralel, dorsal kök gangliyonu makrofajlar (DRG) ayrıca sinir yaralanması sonra önemli ölçüde genişletmek3,4. Özellikle, makrofajlar DRG duyusal nöronlar ile etkileşime girerek periferik sinir yaralanması sonrası nöropatik ağrı gelişimine katkıda olup olmadığını belirlemek için büyüyen ilgi vardır5,6,7, 8.000 , 9.000 , 10.000 , 11. Ayrıca, son çalışmalar da sinir yaralanması12sonra aksonal onarım DRG makrofajların katkısı ima12 ,13. Başka bir çalışmada ayrıca makrofaj alt popülasyonlarının (cd11b+Ly6Chi ve CD11b+Ly6Cdüşük/- hücreler) mekanik aşırı duyarlılıkta farklı bir rol oynayabileceğini öne sürer14. Bu nedenle, sinir hasarı bağlamında DRG makrofajların yanıtını hızla fenotipleme bize nöropatik ağrıya katkıda nöroimmün faktörleri belirlemenize yardımcı olabilir.
Geleneksel olarak, DRG makrofajlar izole etmek için protokol enzimatik sindirim 15 ,16dahil olmak üzere birden fazla adım içerir. Teknik genellikle zaman alıcıdır ve büyük ölçekli deneyler için maliyetli olabilir. Kollajenaz tip II (4 mg/mL) ve dispase tip II (4.7 mg/mL) ile hafif sindirim daha önce tavsiye edilse de15dakika , bu enzime maruz kaldıktan sonra hücrelerin hücre hasarına veya hücre ölümüne yatkın olması akla yatkındır, bu da düşük hücre hasarına veya hücre ölümüne yol açabilir Verim. Buna ek olarak, seriden toplu ait enzimlerin kalitesindeki fark bu sürecin verimliliğini daha da etkileyebilir. Daha da önemlisi, enzim sindirimine maruz kalan makrofajlar istenmeyen bir şekilde uyarılabilir ve böylece in-vivo durumundan çok farklı olabilir. Değişiklikler, fonksiyonel çalışmanın sonucunu karmaşık hale getirebilir.
Burada 4 °C'de DRG makrofajlarını mekanik ayrışma kullanarak hızla izole etmek için enzimsiz bir protokol uyguluyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için buzüzerinde tutulur. Sonuç olarak, bizim yaklaşım izolasyon tutarlılığını korumak için bir avantaj sağlar, ve izole hücreler muhtemelen sağlıklı ve daha az uyarılmış. Ayrıca Floresan aktive Hücre Sıralama (FACS) analizi ile izole hücrelerin kalitesini doğrulamak için kanıt salıyoruz.

<table><tbody><tr><td>AP20187</td><td>Clontech</td><td>635058</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-fare CX3CR1-APC antikoru</td><td>Biolegend</td><td>149007</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci (70 mm naylon)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dounce doku homojenizatörü</td><td>Wheaton</td><td>357538 ( 1ml)</td><td></td></tr><tr><td>FACS tüpleri (5ml)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x, Ca++/Mg++-ücretsiz)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Yaylı Makas</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4864-10ml</td><td></td></tr></tbody></table>

dorsal kök ganglion makrofajlarının hızlı İzolasyon

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Periferik sinir hasarı sonrası dorsal kök gangliyonunda bağışıklık hücreleri ve duyusal nöronlar arasındaki moleküler ve hücresel etkileşimleri incelemek için artan ilgi alanları vardır. Makrofajlar da dahil olmak üzere periferik monositik hücrelerin fagositoz, antijen sunumu ve sitokin salınımı yoluyla doku hasarına yanıt verebildiği bilinmektedir. Ortaya çıkan kanıtlar sinir hasarı bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök gangliyon makrofajlar katkısı ima etmiştir. Hızla fenotipleme (veya "hızlı izolasyon") sinir yaralanması bağlamında dorsal kök ganglia makrofajlarının yanıtı bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz. Örnekler hücresel stresi sınırlamak için boyunca buz üzerinde tutulur. Bu protokol standart enzimatik protokole göre çok daha az zaman alır ve floresan tarafından aktive edilen Hücre Sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullanılmaktadır.

İzole hücreleri doğrulamak için, ilk Macrofaj Fas kaynaklı Apoptosis seçti (MAFIA) transgenik fareler17. Bu çizgi, özellikle makrofajlar ve mikroglia ile ifade edilen BOS1 reseptörünün (BOS1R) promotörü kontrolü altında ilaç lainebilir fk506 bağlayıcı protein (FKBP)-Fas intihar füzyon geni ve yeşil floresan proteini (eGFP) ifade eder. FK bağlayıcı protein dimerizer sistemik enjeksiyon, AP20187 (AP), transgeni ifade eden hücrelerin apoptosis indükler. EGFP ifadesi de bize DRG makrofajlar izlemek iç...

Burada, fenotitipleme ve fonksiyonel analiz için dorsal kök ganglion'undaki makrofajları hızla izole etmek için mekanik bir ayrışma protokolü salıyoruz.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Ortaya çıkan kanıtlar sinir yaralanması bağlamında nöropatik ağrı gelişimi ve aksonal onarım dorsal kök ganglion makrofajlar katkısı ima etmiştir. Dorsal kök ganglion makrofajlarının yanıtı hızla fenotipleme bilinmeyen nöroimmün faktörleri belirlemek için istenir. Burada laboratuvarımızın enzimsiz mekanik ayrışma protokolü kullanarak dorsal kök ganglinden makrofajları nasıl hızlı ve etkili bir şekilde izole ettiğimizi gösteriyoruz.Bu protokol standart enzimatik protokollere kıyasla çok daha az zaman alır ve biz bunu floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama analizlerimiz için rutin olarak kullandık. Deneye başlamadan önce, dokuz ciltlik orta yı kalsiyum ve magnezyumsuz 10X HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının çalışma çözümlerini hazırlayın ve buzda tutun. Farenin arka pençe kıskacına yanıt verilmemesi nedeniyle tamamen anestezi yediğini doğrulayın.Bant ile sabitlenmiş dört pençeleri ile supine pozisyonda bir kimyasal duman kaput içinde bir anestezili fare yerleştirerek başlayın. Göğüs kafesinin altındaki deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Ve sonra cerrahi makas ile, karaciğer ve diyafram ortaya çıkarmak için küçük bir kesi yapmak.Aynı makas kullanarak, diya

rapid-isolation-of-dorsal-root-ganglion-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, mekanik bir ayrıştırma tekniği kullanarak fare dorsal kök ganglionundan (DRG) makrofajları izole etmek için enzim içermeyen bir protokol gösterilmektedir. Yeni toplanan DRG dokusunun homojenizasyonu üzerine, makrofajlar üzerindeki hücre yüzeyi reseptörlerine karşı antikorlar, hücreleri floresan olarak etiketlemek için kullanılır, ardından numunedeki makrofajların varlığını doğrulamak için akış sitometrisi yapılır.

Fare Dorsal Kök Ganglionundan Makrofajların Mekanik Dissosiyasyon Kullanılarak İzolasyonu

Bu video, dorsal kök gangliyonlarından (DRG) nöronları toplamak için bir yöntem gösterir. Bir sıçanın omurgasından DRG izole edilir, enzimlerle muamele edilir ve daha sonra tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Nöronlar, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak glial hücrelerden ayrılır ve bir büyüme ortamında kültürlenir.

Nöronal Kültürler için Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması ve Ayrıştırılması için Bir Teknik

Bu video, dorsal kök gangliyonlarından nöronal kültürleri immünopanning yoluyla zenginleştirmek ve böylece saflıklarını ve nörolojik araştırmalar için faydalarını geliştirmek için bir protokol göstermektedir.

Dorsal Kök Gangliyonlarının İmmünopanning ile Nöronal Zenginleştirilmesi

Bu videoda, sıçan omurgasından dorsal kök gangliyon (DRG) hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Omurgadan eksize edilen DRG'ler enzimlerle muamele edilir ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mekanik olarak ayrıştırılır. Hücreler, sırasıyla glial hücre proliferasyonunu sınırlayan ve nöronal büyümeyi destekleyen inhibitörler ve büyüme faktörleri içeren bir ortamda kültürlenir.

Bir Sıçan Omurgasından Primer Dorsal Kök Gangliyon Hücre Kültürü Oluşturulması

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Bu protokol, sıçanlardan izole edilen dorsal kök ganglion (DRG) nöronlarının izolasyonunu ve akson hizalamasını geliştirmek için statik önceden gerilmiş bir hücre kültürü sistemi üzerinde DRG nöronlarının kültürünü ve ardından miyelinasyonu teşvik etmek için Schwann Hücrelerinin (SC'ler) ko-kültürünü tanımlar.

Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Burada, omuriliğin hidrolik ekstrüzyonunun yanı sıra aynı kemirgende spesifik dorsal kök gangliyonlarının (DRG'ler) tanımlanması ve izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Standart omurilik izolasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yöntem önemli ölçüde daha hızlıdır ve doku hasarı riskini azaltır.

Kemirgenler dorsal kök gangliyon Omurilik ve İzolasyon hidrolik eldesi

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Dorsal kök gangliyon (DRG) birincil kültürler sık fizyolojik fonksiyonları veya patoloji ile ilgili olayların duyusal sinir hücreleri incelemek için kullanılır. Burada, peptit FF reseptör yazdıktan sonra 2 stimülasyon ile seçici bir agonist nörotransmitter sürümü algılamak için bel DRG kültürler kullanımını göstermektedir.

Dorsal kök gangliyon yalıtım ve birincil kültür nörotransmitter yayın çalışmaya

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Dorsal kök ganglionları (DRG), birincil duyusal nöron hücre gövdelerini içerir ve çevresel duyusal sinyalleri omuriliğe iletir. Bu protokol, yapısal olarak sağlam gangliyonların standartlaştırılmış izolasyonunu, anatomik segmental tanımlamayı, yeni başlayanlar için sezgisel rehberliği ve prosedürel doku hasarını azaltmayı destekleyen fare DRG diseksiyon yöntemini tanımlar.

Fare Dorsal Kök Gangliyonlarının Diseksiyonu ve İzolasyonu

Öğrenin dorsal kök ganglion makrofajlarının enzim içermeyen mekanik dissosiasyon protokolüyle hızlı izolasyonunu. Bu yöntem, nöropatik ağrı ve sinir yaralanmasındaki nöroimmün yanıtları incelemek için yüksek canlılık oranları sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Makrofajlarının Hızlı İzolasyon

Daha fazla video keşfet