Name: Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin endotel biyomekaniğinde gap junction connexin 43'ün mekanik bozulması yöntemini. Hücre çekiş kuvvetleri ve hücreler arası gerilimleri ölçerek kanser metastazı ve yara iyileşmesi gibi patofizyolojik süreçleri araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Merkezi Florida Üniversitesi start-up fonları ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüsü ödül K25HL132098 altında desteklenmiştir.

1. Poliakrilamid (PA) jelleri yapma
<ol><li>
Petri kabının hazırlanması
	<ol>
<li>200 mL ultrasaf suyu 80 μL asetik asit ve 50 μL 3-(trimethoxysilyl)propil metakrilat ile karıştırarak bağlama silane çözeltisini hazırlayın. Bind silane hidrojel eki için cam alt Petri çanak yüzeyini işlevselleştirmek için kullanılan bir çözümdür.</li>
		<li>En az 1 saat boyunca bir karıştırma plakası üzerinde bağlayıcı silane çözeltisi karıştırın.</li>
		<li>45 dakika boyunca bind silane çözeltisi ile Petri kabının merkezini iyi tedavi edin.</li>
		<li>Bağlama silane çözeltisini çıkarın ve Petri kabını ultra saf su 2x-3x ile durulayın.</li>
		<li>Petri çanak yüzeyini kurulayın ve ileride kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hidrojel çözeltisinin hazırlanması
	<ol>
<li>Tablo 1'egöre 15 mL'lik bir santrifüj tüpte ultra saf su, %40 akrilamid ve %2 bis-akrilamid ikar.</li>
		<li>Hidrojel çözeltisine 80°L floresan boncuk ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça jel çözeltisi ile boncuk karıştırmak için tüp sallayın.</li>
		<li>Hafifçe santrifüj tüp üzerinde tüp kapağı sıkın ve bir vakum odasına yerleştirin.</li>
		<li>Vakum odasında en az 45 dk jel çözeltisi degas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hidrojel polimerizasyonu
	<ol>
<li>İlk olarak hidrojel çözeltisine %10 amonyum persülfat (ultra saf suda çözünmüş) 75°L'lik amonyum persülfat ekleyin ve ardından 8 μL TEMED (N,N,N', N'-tetramethylethane-1,2-diamin) ekleyin.</li>
		<li>Petri kabının ortasına 24 μL hidrojel çözeltisi yerleştirin (Bkz. Tablo 2).</li>
		<li>Hidrojeli düzleştirmek için 18 mm'lik bir kapak kaydırma kullanın. Bu ~ 100 μm bir yükseklik verecektir.</li>
		<li>Jel polimerizasyonu için en az 30-40 dk bekleyin.</li>
		<li>Jel dehidratasyon önlemek için ultra saf su polimerize hidrojel batırın.</li>
		<li>Floresan boncukların fotobeyazmasını önlemek için Petri kabını alüminyum folyo ile kaplayın ve 4 °C'de saklayın. NOT: Hidrojeller 3 aya kadar bir süre saklanabilir, ancak bu jellerin en iyi sonuçları elde etmek için imalattan en fazla 1 hafta sonra kullanılması önerilmektedir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hücre kültürü
<ol><li>Kültür insan göbek ven endotel hücreleri (HUVECs) hücre kültürü orta 200 (Malzemeler Tablosubakınız) ile desteklenmektedir 1% penisilin-streptomisin ile desteklenmektedir 0.1% jelatin kaplı şişeler üzerinde 37 ° C ve 5% CO2.</li>
</ol>3. Mikro desen şablon hazırlama
<ol><li>Silikon tabanı silikon kür maddesi ile 20:1 (baz: kür leme maddesi) oranında karıştırarak 100 mm Petri kabında ince bir polidimethylsiloxane (PDMS) tabakasını tedavi edin. NOT: Madde oranlarının kavisi için başka bir taban kullanmak mümkündür (ör. 10:1 veya 30:1). Ancak, kür ajan oranı için daha düşük bir taban daha sert bir desen verecektir, kür ajan oranı daha yüksek bir taban daha yumuşak bir desen üretecek.</li>
	<li>20:1 (baz:kürleme ajanı) PDMS çözeltisi hazırlayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde dikkatlice karıştırın. Tekdüze olmayan karıştırma eksik polimerizasyona neden olacağından, PDMS çözeltisinin doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü ters çevirin ve birden fazla kez sallayın.</li>
	<li>1 90 x g1 dk için PDMS çözüm santrifüj tarafından yukarıdaki adımdan tanıtılan kabarcıklar kaldırın.</li>
	<li>100 mm Petri kabının ortasına 5-6 mL PDMS çözeltisi dökün ve PDMS çözeltisi tüm Petri kabı yüzeyini kaplayana kadar kabı çalkalayın.</li>
	<li>PDMS çözeltisini bir gecede 50-60 °C'de tedavi edin. PDMS oda sıcaklığında da tedavi edilebilir.</li>
	<li>Bir delik zımba ile dairesel, 16 mm çapında PDMS şablon u çıkarın.</li>
	<li>PDMS şablonküçük delikler oluşturmak için bir biyopsi yumruk kullanın. Bu protokolde 1.25 mm çapında biyopsi yumruğu kullanılmıştır.</li>
	<li>PDMS şablonlarını ilk olarak 2-3 dakika boyunca %70 etanol le batırarak, aşırı etanolün sinpire edilerek ve 5 dakika uv ışığı altına yerleştirerek sterilize edin.</li>
</ol>4. Kollajen-I hidrojel kaplama
<ol><li>Hidrojelden kapak kaymasını çıkarın ve fazla sıvıyı aspire edin.</li>
	<li>PDMS şablonunu hidrojel yüzeyine yerleştirin. NOT: Cımbız, PDMS şablonu ile hidrojel yüzeyi arasında su geçirmez bir conta sağlamak için PDMS şablonuna Hafif basınç uygulamak için kullanılabilir. PDMS şablonlarımız su geçirmezdir ve böylece jel üst yüzeyi ile PDMS şablon alt yüzeyi arasında su girişini engeller. Ayrıca, hidrojel sertliği PDMS sertliği açısından ayarlanması gerekmez.</li>
	<li>Hidrojel yüzeyini sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrofenilmino) hekzanomuat (sulfo-SANPAH) 0,1 M HEPES (4-(2-hidroksitil)-1-piperazineeesulfonic asit) tampon çözeltisi ile kaplayın 1 : 1000 ve uv altında yer lamba (güç 36 W) için 8 dk.</li>
	<li>Aşırı sulfo-SANPAH ve HEPES çözeltisini aspire edin ve hidrojeli 0,1 M HEPES ile iki kez durulayın ve ardından ultra saf suile iki durulama daha.</li>
	<li>4 °C'de bir gecede 0,1 mg/mL kollajen-I ile aşırı ultra saf su ve kat hidrojelleri aspire edin.</li>
	<li>Bulaşıkları kapatın ve floresan boncukları fotobeyazlamalardan koruyun. NOT: PDMS şablonları mikro desenli monolayers oluşturmak için kullanılır. Mikro desenli monolayers her deney sırasında aynı geometri ve boyutlarda birden fazla monolayers için izin olarak kullanılır. Ancak, mikro desenler istenmiyorsa, 4.2.</li>
</ol>5. Hidrojeller üzerinde HUVEC monolayers oluşturma
<ol><li>Kuvözde 3-5 dakika boyunca hücreleri doku kültürü şişelerinden ayırmak için 1x tripsin kullanın.</li>
	<li>Tripsinizasyondan sonra, hücre kültürü ortamını tripsin çözeltisine ekleyin ve 15 mL santrifüj tüpüne ekleyin.</li>
	<li>1710 x g3 dk için hücre çözeltisi santrifüj . Santrifüj tüpünün altında küçük, beyaz bir hücre peleti görülmelidir.</li>
	<li>Medyadaki süpernatant hücreleri 50 x 104 hücre/mL konsantrasyonuna aspire edin.</li>
	<li>Kollajen-I'yi hidrojelden çıkarın ve PBS ile 1x durula.</li>
	<li>PDMS şablonunun üstüne 75 x 103 hücre ekleyin ve hücrelerin 37 °C ve %5 CO2'dekuvözde en az 1 saat hidrojel yüzeyine bağlanmasını bekleyin.</li>
	<li>PDMS şablonunu çıkarın ve Petri kabına en az 2 mL ortam ekleyin. Herhangi bir bağlı hücreleri kaldırmak ve% 70 etanol ile püskürtme ve daha sonra 5 dakika uv ışığı altına yerleştirerek sterilize etmek için 10x trypsin PDMS şablon batırın.</li>
	<li>Petri kabını kuvöze yerleştirin ve en az 36 saat bekleyin veya enfluent bir monolayer gözlemlenene kadar bekleyin.</li>
</ol>6. Cx43 bozulması için 2,5 dihidroksikalklon tedavisi
<ol><li>0,1875 mg/mL stok çözeltisi yapmak için dimethylsulfoxide (DMSO) içinde 2,5 dihidroksikalon (kalkson) çözün.</li>
	<li>Düşük kalkon konsantrasyonu (0.2 g/mL) aliquot ve yüksek kalkon konsantrasyonu (2 μg/mL) aliquot yapmak için hücre kültürü ortamı ile stok çözeltisini seyreltin.</li>
</ol>7. Veri toplama
<ol><li>Bir mikroskop ile hücre adaları bulmak.</li>
	<li>Görüntü hücre morfolojisi ve hidrojel deplasmanları için faz kontrastı ve boncuk görüntüleri elde edin. NOT: Bu protokol veri toplama için 10x hedefi kullandı.</li>
	<li>Deneyin sonunda, hücreleri 10x tripsin ile ayırın ve hücre olmadan jel yüzeyinin görüntüsünü elde edin (referans görüntü).</li>
</ol>8. İmmünoboyama
<ol><li>Monolayers% 4 formaldehit ve inkübat ile 37 °C 15 dakika için düzeltin.</li>
	<li>Hücreleri permeabilize etmek için %4 formaldehit çıkarın ve 37 °C'de 5 dakika için %0,2 Triton X-100 ekleyin.</li>
	<li>% 0.2 Triton X-100 çıkarın ve PBS 2x-3x ile monolayers durulamak.</li>
	<li>37 °C'de 45 dk için %2 büyükbaş serum albumin (BSA) çözeltisi ile tek kat örtün.</li>
	<li>%2'lik BSA çözeltisini çıkarın ve PBS 2x-3x ile monokatmanları durulayın.</li>
	<li>Numuneye 1:400 konsantrasyonda birincil Cx43 antikorekleyin ve gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS 2x-3x ile primer antikor ve durulama örneğini çıkarın.</li>
	<li>3:200 konsantrasyonunda sekonder antikor ekleyin ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Örnekler fotobeyazlama önlemek için kaplı olmalıdır.</li>
	<li>Sekonder antikor çıkarın ve PBS 2x-3x ile durula.</li>
	<li>Montaj ortamı (Fluromount-G DAPI) ile kapak numunesi ve 18 mm'lik kapak lı sızdırmazlık.</li>
</ol>9. Çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) ve monolayer stres mikroskobu (MSM) uygulanması
<ol><li>
Hidrojel deformasyon hesaplama NOT: MATLAB kullanılarak adım adım yer değiştirme hesaplama yordamı aşağıda verilmiştir.<ol>
<li>Ana traction.m dosyasını MATLAB'da açın (tüm MATLAB yordamları için Ek Malzemeler'e bakın). NOT: MATLAB dizinini ayarlamak için kodda verilen yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki değişkenleri tanımlayın: görüntü biçimi, pikselden mikrona dönüştürme, Young modülü, Poisson oranı ve mikroskop hedefi.</li>
		<li>OpenFiles alt yordamını kullanarak boncuk, tripsin görüntüsünü ve faz görüntüsünü bulun. NOT: Büyük veri kümeleri için dosyaları sırayla adlandırmak en iyisidir. Örneğin, dosyalar "filename1.tif", "filename2.tif" vb. olarak adlandırılmalıdır.</li>
		<li>Hücre monokatmanı nın etrafında bir kare Yatırım Getirisi (ilgi alanı) tanımlayın ve orijinal görüntüyü kırpmak için cell_cropper alt yordamını çalıştırın.</li>
		<li>Yer değiştirmeleri hesaplamak için displacement_finder alt yordamını çalıştırın.</li>
		<li>Mikroskop evre kaymasınedeniyle olabilecek hücresel olmayan ek yer değiştirmeleri kaldırmak için Dedrift alt yordamını çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çekişlerin hesaplanması NOT: Burada, özel olarak yazılmış MATLAB rutinimiz kullanılarak sınırlandırılmamış çekişler hesaplanır. Daha önce bahsedilen MATLAB rutini kullanılarak adım adım çekiş hesaplaması aşağıda verilmiştir.<ol>
<li>Çekiş.m rutini içinde aşağıdaki değişkenleri tanımlayın: sınır durumu, jel kalınlığı, jel yüksekliği ve dedrift.</li>
		<li>Çekişleri hesaplamak ve çekişleri çizmek için plot_traction alt yordamını yürütmek için traction_finder alt yordamını çalıştırın. X yönünde (Tx) ve y yönünde (Ty) tüm çekişler ve karşılık gelen piksel konumları kod tarafından oluşturulacak bir traction.dat dosyasında bulunabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücreler arası gerilimlerin hesaplanması NOT: Daha önce bahsedilen MATLAB rutinini kullanarak hücreler arası stres hesaplaması için adım adım talimatlar aşağıda verilmiştir.<ol>
<li>Tek katmanlı sınırı belirtmek için mark_circular_domain alt yordamını çalıştırın. Bu yordam, kullanıcının tek katmanlı etrafında el ile bir sınır çizmesi için sırayla kırpılan tüm faz görüntülerini ister. Komut penceresinde oluşturulan nXPts bir not tutun ve FEM analizi için hem X ekseni ve Y ekseninde ızgara parametreleri olarak daha sonra kullanabilirsiniz (adım 9.3.2 bakınız).</li>
		<li>Hücreler arası gerilimleri hesaplamak için Run_StressCode'u çalıştırın. Bu alt yordam doğrudan "model.in" dosyasından parametreleri okur ve FEM çözümlemesi gerçekleştirmek için "island.exe" yürütür. Bu rutinçalıştırmadan önce, model.in dosyasındaki tüm parametrelerin, yani X ve Y'deki ızgara parametrelerinin, pikselden mikron dönüştürmeye, Young'ın jel modülünden, Poisson'un oranına, tek katmanlı yüksekliğine ve tek katmanlı desenin (şerit veya delik) düzenlendiğinden emin olun Doğru.</li>
		<li>Plot_FEM_results alt yordamını kullanarak tüm FEM sonuçlarını çizin. NOT: Oluşturulan tüm sonuçlar otomatik olarak MATLAB dizinindeki Sonuçlar klasöründe depolanır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+%28STFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li>
<li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal+of+Science+%26+Technical+Research%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).</li>
<li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear%2C+intercellular+stress%2C+and+endothelial+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+forces%3A+a+useful+parameter+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li>
<li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706(2018).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172(2013).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li>
<li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li>
<li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li>
<li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327(2019).</li>
<li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li>
<li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li>
<li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+phosphorylation+in+brain%2C+cardiac%2C+endothelial+and+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li>
<li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C5%27-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li>
<li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+cytotoxicity+of+2%2C5-dihydroxychalcones+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Grubumuz, yanı sıra diğerleri, başarıyla çeşitli patolojik ve fizyolojik hücresel süreçlerde hücre-hücre kavşaklarının etkisini araştırmak için TFM ve MSM kullanarak olmuştur in vitro7,15,18,27 . Örneğin, Hardin ve ark. endotel hücrelerinde hücreiçi stres iletimkılavuzları15. Burada bildirdiğimiz Cx43 ile ilgili değişiklikleri Hardin ve ark.'nın bildirdiği değişikliklerl...

Fiziksel kuvvetlerin ve mekanik özelliklerin hücresel ve doku fizyolojisi ve patolojisi üzerindeki etkilerinin incelenmesine atıfta bulunan alan mekobiyoloji1olarak bilinir. Mekanobiyolojide kullanılan birkaç yararlı teknik monolayer stres mikroskobu ve traksiyon kuvveti mikroskobutur. Çekiş kuvveti mikroskopisi hücre-substrat arabiriminde üretilen çekişlerin hesaplanmasına olanak sağlarken, monokatmanlı stres mikroskobu, tek katmanlı hücreler arasında oluşan hücreler arası gerilimlerin tek katmanlı olarak hesaplanmasına olanak sağlar2 ,3,4,5,6. Önceki yöntemlerden elde edilen sonuçlar hücre kaynaklı mekanik gerilmeler hücresel süreçlerin bir dizi kaderi belirlemede önemli bir rol oynadığını ileri sürmüşlerdir3,4,5. Örneğin, harici bir mekanik kuvvete maruz kaldıktan sonra, kolektif olarak göç eden bir grup hücre morfolojilerini değiştirebilir ve şekillerini polarize ederek, kısmen çekiş ler üreterek, uygulanan kuvvet inisi boyunca hizalayabilir ve göç edebilir. 8 . Çekişler hücre kontraksiyonu değerlendirmek için kullanılabilecek ve çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) kullanılarak hesaplanan bir metrik sağlar. Traksiyon kuvveti mikroskobu (TFM), matematiksel olarak titiz, mekanik tabanlı hesaplamalı bir yaklaşımla çekiş alanının hesaplanmasının ardından hücre kaynaklı substrat deformasyonlarının belirlenmesiyle başlar. Çekiş hesaplama yeteneği oldukça uzun bir süre için yaklaşık olduğundan, araştırmacılar tfm etkileri çekişler bir dizi süreçler üzerinde ortaya çıkarmak için kullandık9, yara iyileşmesi10 ve mühendislik kardiyak değerlendirilmesi doku11.
TFM ve MSM'nin birlikte uygulanması aşağıdaki sırayla yürütülmesi gereken üç temel adıma ayrılabilir: birincisi, hücreler tarafından üretilen hidrojel deformasyonları belirlenir; ikincisi, çekişler hidrojel deformasyonlarından kurtarılır; ve üçüncüsü, sonlu elemanlar yaklaşımı tüm monolayer içinde normal ve makas hücreler arası gerilmeleri hesaplamak için kullanılır. Jel yer değiştirmelerini hesaplamak için, hücrelerle floresan boncuk görüntüleri, özel olarak yazılmış parçacık görüntüsü velocimetry (PIV) rutini kullanılarak referans boncuk görüntüsü (hücresiz) ile karşılaştırıldı. PIV analizi için çapraz korelasyon pencere boyutu ve çakışması sırasıyla 32 x 32 piksel ve 0,5 olarak seçilmiştir. Şu anda, piksel kaymaları bir piksel-mikron dönüştürme faktörü ile çarpılarak mikronlara dönüştürüldü (mikroskobumuz için, bu dönüşüm faktörü 0,65'tir) düzlem içi yer değiştirmeleri elde etmek için. Düzlem dışı yer değiştirmeleri yoksayma ile ilişkili hatalar ihmal edilebilir12,13. Jel deplasmanları hesaplandıktan sonra, kullanılabilir çekiş ölçümleri iki türü vardır, kısıtlı çekiş ler ve sınırlandırılmamış çekişler8,14. Sınırlandırılmamış çekişler tüm görüş alanı için çekiş alanı sağlarken (hücreleri olan ve olmayan bölgeler dahil), kısıtlı çekişler ise yalnızca hücreleri içeren bölgeler için çekiş alanını sağlar14. Daha sonra, hücreler arası gerilmeler çekiş kuvveti mikroskobu bir uzantısı olan monolayer stres mikroskobu (MSM) kullanılarak hesaplanır. MSM'nin uygulanması, hücre-substrat arabiriminde tek hücre katmanı tarafından uygulanan yerel çekişlerin Newton yasalarının gerektirdiği hücre-hücre arabirimindeki hücreler arasında iletilen mekanik kuvvetler tarafından dengelenmesi gerektiği varsayımına dayanır7 ,12,13. Burada önemli bir varsayım hücre monolayer ince bir elastik levha olarak tedavi edilebilir, çünkü monolayer çekiş dağılımı bilinen ve kuvvet dengesi hücre malzeme özelliklerine bağlı değildir. Başka bir önemli varsayım çekiş kuvvetleri görüş optik alan içinde yerel hücreler arası stresler tarafından dengeli olduğunu (monolayer içinde) ve bu kuvvet dengesinin etkisi distal bölgede en az (monolayer dışında)13. Bu nedenle, hücreler arası gerilmeler, yer değiştirmeler veya her ikisinin tek katmanlı sınırdaki bir kombinasyonu tarafından tanımlanan sınır koşulları MSM13'ügerçekleştirmek için çok önemlidir. Yukarıdaki bilgileri dikkate alarak, msm'yi sonlu elemanlar analizi (FEM) yaparak maksimum ana gerilimi (σmax)ve minimum ana gerilimi (σmin)içinde her noktada döndürerek geri alabiliriz. tek katmanlı. Bu temel gerilmeler daha sonra 2B ortalama normal hücreler arası gerilimi [(σmax + σmin) ve 2D maksimum kesme hücre içi gerilimi [(σmax - σmin) /2] tüm monolayer içinde hesaplamak için kullanılır 12,13. Bu prosedür Tambe ve ark.12,13 tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır
Monolayer stres mikroskobu (MSM) bir monolayeriçindeoluşturulan hücre-hücre içi gerilmelerin hesaplanması için izin verir 6,7,8,12,13. Bu hücreler arası stresler doku büyüme ve onarım, yara iyileşmesi ve kanser metastazı için önemli olduğu ileri sürülmüşlerdir12,15,16,17. Buna ek olarak, intersellüler stresler de endotel hücre göçü ve endotel bariyer fonksiyonu önemli olduğu ileri sürülmüştür17,18. Sıkı kavşaklar ve yapışık kavşaklar gibi hücre-hücre kavşaklarının hem endotel hücreiçi stres oluşumunda ve iletiminde kritik bir rol oynadığı öne sürülürken, boşluk bağlantılarının rolü hala belirsizdir. Gap kavşakları fiziksel olarak komşu hücreleri bağlamak ve elektrik akımı ve moleküller (<1 KDa) komşu hücreler arasında geçmek için bir yol sağlamak19,20,21. Endotel hücreleri Cx37 ifade rağmen, Cx40, ve Cx43 boşluk kavşaklar19,22, Cx43 muhtemelen hastalığın ilerlemesi açısından en önemli23. Cx43'ün önemine dair kanıtlar, farelerde Cx43'ün genetik olarak silinmesi hipotansiyon24 ile sonuçlanır ve anjiyogenez üzerinde yan etkileri vardır25. Buna ek olarak, Cx43 hücre göçü ve çoğalması için önemli olduğu belgelenmiştir ve aterosklerozilerlemesi 18,22,23,24,25 .
Bu protokolde, endotelsel boşluk kavşak Cx43 bozulmasından etkilenecek confluent, endotel yaltekerlik içinde çekiş ve hücreler arası stres oluşumunu araştırmak için TFM ve MSM'yi kullandık. Biz 2,5-dihidroksikalson (chalcone), cx43 ifade26inhibe belgelenmiş bir molekül ile Cx43 bozdu. Chalcone cx43 ifade26bozmak için Lee ve ark. tarafından daha önce bildirilmiştir olarak siRNA yerine Cx43 bozmak için kullanılmıştır . Buna ek olarak, biz özellikle endotel üzerinde chalcone etkisi de potansiyel olarak çeşitli vasküler önlenmesi ve tedavisi için kullanılabilecek bir anti-inflamatuar ve anti-trombosit bileşik olduğu bildirilmiştir ilgilendi patolojiler26. Chalcone tedavileri deney başlangıcından bir saat sonra yapıldı, chalcone ile tedavi edilen monolayers toplam altı saat boyunca görüntülendi ve görüntü işleme çekiş belirlemek için özel olarak yazılmış mATLAB kodu ile yapıldı ve daha sonra hücreler arası strese neden olabilir. Sonuçlarımız çekişlerde ve hücreler arası streslerde genel bir düşüş olduğunu göstererek, Cx43'ün endotel biyomekaniğinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.

<table><tbody><tr><td>18 mm lamel</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Poliakrilamid jelleri düzleştirmek için gerekli</td></tr><tr><td>%2 bis-akrilamid</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Poliakrilamid jel</td></tr><tr><td>bileşeni 2 & prime;, 5 & prime; -Dihidroksikalkon</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Cx43 yapısını bozmak için</td></tr><tr><td>3- (Trimetoksisilil) propil metakrilat</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Asetik asit ve ultra saf su ile silan karışımını bağlamak için stok çözeltisi</td></tr><tr><td>%40 Akrilamid</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>Poliakrilamid jel bileşeni</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Bağlama tuzlu su çözeltisi yapmak için gerekli</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 keçi fare önleyici IgG;</td><td>ThermoFisher</td><td>Katalog # A-11001</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Poliakrilamid jel polimerize edici ajan</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Engelleme çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>Sığır Tip I Atelo-Kollajen Çözeltisi, 3 mg / mL, 100 mL</td><td>İleri Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Hücre dışı matris</td></tr> <tr><td>olarak kullanınCorning Hücre Kültürü Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Hücre kültürü için gerekli Tampon Salin</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit, Fisher BioReagents</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Kalkonu çözmek ve stok çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>DAPI ile Fluoromount-G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52</td><td>DAPI</td></tr> <tr><td>için lekelenmek için kullanılan immünostaz için montaj ortamıFluroscent mikroküre Karboksilat modifiyeli boncuklar</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>0,5 mikron karboksilat modifiyeli boncuklar (kırmızı), %2 katı</td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>için Temel HUEVC ortamı 200 takviyesi</td></tr><tr><td>Orta 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>HUVEC hücre kültürü</td></tr> <tr><td>için temel ortamFare monoklonal Cx43 antikoru (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Katalog #13-8300</td><td>Cx43</td></tr><tr><td>Petri kabı için birincil antikor (35 mm çap)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H</td><td>20 mm merkez kuyulu 35 mm petri kabı</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Çapraz bağlayıcı 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Poliakrilamid jel yüzeyini işlevselleştirmek için gereklidir</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td> PDMS TEMED BIO-RAD 1610801 yapmak <td>için kürleme ajanlı silikon elastomer</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Poliakrilamid jel polimerize edici ajan</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Hücrelere nüfuz etmek için</td></tr><tr><td>Tripsin -EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Hücreleri ayırmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

connexin 43 yapısal bozulma ile perturbing endotel biyomekanik

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Endotel hücreleri hücreler arası gerilmeler ve çekişler oluşturmak için kurulmuştur, ancak endotel selüloz ve çekiş üretiminde rol boşluğu kavşakları oynamak şu anda bilinmemektedir. Bu nedenle, burada gap junction connexin 43 (Cx43) endotel biyomekanik üzerinde bilinen bir Cx43 inhibitörü 2,5-dihidroksichalcone (chalcone) ve confluent endotel monolayers maruz kalarak etkisini araştırmak için mekanik tabanlı bir protokol sasürdeyiz bu inhibitörün çekişler ve hücreler arası gerilmeler üzerindeki etkisini ölçmek. Kontrole kıyasla yüksek bir chalcone dozu (2 μg/mL) altında hem çekişlerde hem de hücreler arası streslerde azalma gösteren temsili sonuçlar salıyoruz. Bu protokol sadece Cx43'e değil, uygun inhibitörün kullanıldığı varsayarak diğer boşluk kavşaklarına da uygulanabilir. Bu protokolün kardiyovasküler ve mekanobiyoloji araştırma alanlarında yararlı olacağına inanıyoruz.

Kontrol faz kontrast görüntüleri, 0.2 μg/mL, ve 2 μg/mL tedavi monokatları chalcone tedavisinden 30 dakika önce alındı(Şekil 1A-C) ve 2 saat sonra kalkon tedavisi (Şekil 1D-F). Hücre kaynaklı boncuk yer değiştirmelerinin (μm) huvec monolayers kontrol karşılaştırıldığında hem düşük doz kalkon ve yüksek doz kalkon koşullarında azalma gözlenmiştir(Şekil 2E,F</st...

Burada, connexin 43 arasındaki boşluk kavşağını bozacak ve bunun endotel biyomekaniği üzerindeki etkisini çekişler ve hücreler arası gerilimlerin gözlemi yoluyla ölçmek için mekanik tabanlı bir protokol salıyoruz.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Bu protokol, örneğin yara iyileşmesi ve kanser metastazları gibi birçok fizyolojik ve patolojik süreçte hücresel güçlerin oynadığı rolün açıklanmasına olanak sağladığı ndan önemlidir. Bu mekanik tabanlı tekniğin en büyük avantajı aynı anda hücre-hücre kavşakları bozmak ve hücre tarafından oluşturulan mekanik kuvvetler üzerindeki etkisini ölçmek için yeteneğidir, özellikle çekiş ve hücreler arası stres. Protokolümüz, örneğin kanser metastazları, ateroskrozlar ve hipertansiyon gibi çok çeşitli patofizyolojik süreçler için geçerlidir.Yöntemlerimiz, hem biyokimyasal hem de biyomekanik analizleri organ-çip modelleri, biyo-mühendislik doku yapıları, in vitro ilaç dağıtım sistemleri ve doku ortak kültür sistemleri ile entegre edilebilir. Protokolümüzü gerçekleştirmek oldukça basittir. Ancak bu protokolü ilk defa yapanlara sabır göstermelerini ve bu protokolün adımlarını aceleye getirmemelerini öneriyoruz.Protokolümüz, ilk kez kullananlar için açık olmayan benzersiz adımlara sahiptir. Bu nedenle, kullanıcıları yazılı adım adım prosedürlerimizi takip etmeye ve görsel gösterileri rehberlik olarak kullanmaya teşvik ediyoruz. Başlamak için, 200 mililitre ultra saf suyu 80 mikrolitre asetik asit ve 50 mikrolitre silane metakrilat ile karıştırarak Blind-silane çözeltisini hazırlayın.Bind-silane çözeltisini en az bir saat karıştırın. Bind-silane solüsyonu ile petri kabının merkezini 45 dakika iyi şımartın. Bind-silane çözeltisini çıkarın ve Petri kabını ultra saf suyla 2-3 kez durulayın.Petri çanak yüzeyini kurulayın ve ileride kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın. Hidrojel çözeltisini hazırlamak için, 12,49 mililitre ultra saf suyu 2,062 mililitre %40 akrilamid ve 375 mikrolitre %2 bisacrylamid 15 mililitrelik bir santrifüj tüpte karıştırın. Hidrojel çözeltisine 80 mikrolitre floresan boncuk ekleyin.Yavaşça jel çözeltisi ile boncuk karıştırmak için tüp sallayın. Kapağı santrifüj tüpünde gevşek tutun ve bir vakum odasına yerleştirin. Jel çözeltisini vakum odasında en az 45 dakika gazlayın.Hidrojeli polimerize etmek için önce %10 amonyum persülfat75 mikrolitre ekleyin ve hidrojel çözeltisine sekiz mikrolitre TEMED ekleyin. Petri kabının ortasına 24 mikrolitre hidrojel çözeltisi yerleştirin. Hidrojeli düzleştirmek ve yaklaşık 100 mikrometre yükseklikte yapmak için 18 milimetrelik kapak lı hidrojelüzerine basın.Jel polimerizasyonu için en az 30-40 dakika bekleyin. Jel dehidratasyon önlemek için ultra saf suya polimerize hidrojel batırın. Floresan boncukların fotobeyazmasını önlemek için Petri kabını alüminyum folyo ile kaplayın ve dört santigrat derecede saklayın.İlk olarak, 50 mililitrelik bir santrifüj tüp 20'ye bir oranında silikon kür maddesi ile PDMS silikon tabanı karıştırın. PDMS çözeltisinin doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü ters çevirin ve birden fazla kez sallayın. 190 kez G.Pour 100 milimetrelik Petri kabının ortasında PDMS çözeltisi beş ila altı mililitre dökün bir dakika için santrifüj ederek PDMS çözümündeki kabarcıkları çıkarın ve PDMS çözeltisi tüm Petri çanak yüzeyini kaplayana kadar kabı boşaltın.PDMS çözeltisini bir gecede 50 ila 60 santigrat derecede tedavi edin. Ardından, 16 milimetre çapındaki pdms şablonunu delik li zımba ile çıkarın. PDMS şablonunda küçük delikler oluşturmak için 1,25 milimetre çapında biyopsi yumruğu kullanın.PDMS şablonlarını 2-3 dakika boyunca %70 etanol le batırarak, aşırı etanolün aspire edilerek ve uv ışığının altına beş dakika yerleştirerek sterilize edin. Herhangi bir fazla sıvı aspire ve hidrojel kapak kayma kaldırın. PDMS şablonunu hidrojel yüzeyine yerleştirin ve PDMS şablonu ile hidrojel yüzeyi arasında su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için PDMS şablonuna Hafif basınç uygulamak için cımbız kullanın.Hidrojelyüzeyini Sulfo-SAMPA ile kaplayın 0,1 molar HEPES tampon çözeltisi içinde 1'e 1,000 konsantrasyonda çözünmüş ve hidrojeli 8 dakika boyunca 36 watt gücünde bir UV lambasının altına yerleştirin. Aşırı Sulfo-SAMPA ve HEPES çözeltisini aspire edin ve hidrojeli 0,1 molar HEPES ile iki kez durulayın ve ardından ultra saf suile iki durulama daha. Aşırı ultra saf su aspire ve Kollajen-1 mililitre başına 0,1 miligram ile hidrojel kaplamak için 200 mikrolitrelik pipet kullanın.Floresan boncukları fotobeyazrlamadan korumak için yemeğin üzerini kapatın ve hidrojeli bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Şimdi, şişeye üç mililitre 1X Tripsin ekleyin ve hücreleri doku kültürü şişesinden ayırmak için 37 santigrat derecede 37 santigrat derecede kuvöze yerleştirin. Tripsinizasyondan sonra, şişeye üç mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin, karıştırmak için girdap ve karışımı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Hücre çözeltisini 1 dakika için santrifüj edin, 710 kez G.Aspire süpernatant ve mililitre başına dört hücre ye 50 kez 10 konsantrasyoniçin medya hücreleri yeniden askıya. Hidrojel kabını buzdolabından çıkar. Kollajen-1'i hidrojelden çıkarın ve PBS ile bir kez durula.PDMS şablonunun üstüne üçüncü hücrelere 75 kat 10 ekleyin ve hücrelerin 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuvözde en az bir saat hidrojel yüzeyine bağlanmasını bekleyin. PDMS şablonunu çıkarın ve bağlı hücreleri kaldırmak için 10X Trypsin'de 10x Trypsin'e 10 ila 15 saniye daldırın. Petri kabına en az iki mililitre ortam ekleyin ve şablonu %70 etanol püskürterek ve uv ışığının altına beş dakika süreyle yerleştirerek sterilize edin.Petri kabını en az 36 saat veya enfluent bir monolayer gözlemlenene kadar kuvözde yerleştirin. Chalcone tedavisinden 30 dakika önce ve kalkon tedavisinden iki saat sonra faz kontrast görüntüleri karşılaştırıldı. Hücre kaynaklı boncuk yer değiştirmelerinin huvec monolayers kontrolüile karşılaştırıldığında hem düşük doz kalkon hem de yüksek doz kalkson koşullarında azaldığı gözlenmiştir.Chalcone tedavisinden önce, RMS çekişleri tüm koşullar için 51 Pascal civarındaydı. Chalcone tedavisinden sonra, düşük doz alkklon tedavi monokatmanlarında 59 Pascal'a rms çekişlerinde küçük bir artış ve kontrole göre yüksek doz alkklon tedavi edilen monokatmanlarda 18 Pascal'a kadar RMS çekişlerinde neredeyse iki kat azalma görüldü. Chalcone tedavisi düşük doz ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü arttı, ama önemli ölçüde kontrol ile karşılaştırıldığında yüksek doz ile ortalama normal hücreler arası stres büyüklüğü azaldı.Chalcone tedavisi de kontrol ile karşılaştırıldığında düşük ve yüksek chalcone konsantrasyonu hem de maksimum katıksız hücreler arası gerilmeleri azalttı. Kalkon tedavisinin etkisi hem T-testlerine hem de tek faktörlü ANOVA testine dayalı olarak istatistiksel olarak anlamlıdır. Jelüstüne PDMS şablon uyup, jelin PDMS şablonu ile jel arasında su geçirmez bir conta oluşturacak kadar kuru olduğundan emin olun.Bu protokol aynı zamanda hücre-hücre kavşakları, sitoskeletal proteinler, hücre matris adezyon molekülleri veya canlı görüntüleme ile hücre dışı moleküllerin biyomekanik katkısını araştırmak için de uygulanabilir. Bu in vitro protokolü ile, araştırmacılar artık başarıyla biyomekanik bir dizi araştırabilirsiniz, yanı sıra doku onarımı sırasında biyokimyasal özellikleri, yara iyileşmesi, veya hayvan modeli olmadan kanser metastazları. İzleyicilerimize, bu ilaçların solunması zararlı olduğu bildirildiğinden, chalcone ve DMSO'yu ele alırken çok dikkatli olmalarını tavsiye ederiz.

perturbing-endothelial-biomechanics-via-connexin-43-structural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

GFP-aktin ifade canlı endotel hücreleri mikroskobik görüntüleme iskelet yapıları dinamik değişimlere karakterizasyonu sağlar. Sabit örneklerinde kullanan teknolojilerden farklı olarak, bu yöntem önce aynı hücrelerde aktin hücre iskeletinin temporal değişikliklerin ayrıntılı bir değerlendirme sırasında, çeşitli fiziksel, farmakolojik veya inflamatuvar uyaranlara sonra sağlar.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Farklı seviyelerde ve sıvı kesme paternlerinin endotelyal gen ekspresyonu, fenotipi ve hastalığa yatkınlığı modüle ettiği bilinmektedir. 'Kesme halkalarının' montajını ve kullanımını tartışıyoruz: tek yönlü, periyodik kesme gerilimi modelleri üreten bir model. Kesme halkalarının montajı kolaydır, ekonomiktir ve yüksek hücre verimi sağlayabilir.

Montaj ve &#39;Kayma Rings&#39; Uygulama: Orbital tek yönlü ve Periyodik Akışkan Akışının ve Kayma Stres için Yeni Bir Endotel Modeli

Hücre kültür manken direnç arter yollar endotel, düz kas, veya endotel ve düz kas (myoendothelial junction) arasında sinyal diseksiyon için izin açıklanmıştır. Bu hücre kültür model kullanarak agonistler veya protein yalıtım, elektron mikroskopi veya ayirt seçici uygulama yararlı olabilir.

Hücre kültür manken direnç arter

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Burada, yük taşıyan tendon çekirdek dokusu ile hastalık ve yaralanma ile aktive olan hücre popülasyonlarını içeren bir dışsal bölme arasındaki tendon hücresel karışmasını taklit etmek için bir asambloid model sistemi sunuyoruz. Önemli bir kullanım durumu olarak, sistemin dışsal endotel hücrelerinin hastalıkla ilgili aktivasyonunu araştırmak için nasıl konuşlandırılabileceğini gösteriyoruz.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Keşfedin endotel biyomekaniğinde gap junction connexin 43'ün mekanik bozulması yöntemini. Hücre çekiş kuvvetleri ve hücreler arası gerilimleri ölçerek kanser metastazı ve yara iyileşmesi gibi patofizyolojik süreçleri araştırın.

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Daha fazla video keşfet