Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi
October 3rd, 2019
Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.
Bu iyi tanımlanmış protokol memelilerde birincil nöral krest göçüne bakmaktadır. Nöral tepeyi etkileyen doğum kusurlarını incelemek için primer nöral krest göçlerini kullanıyoruz. Bu yaklaşım, nöral plakadan çıkan nöral krest hücrelerine daha yakından bakmamızı sağlar.
Mutant genler cazibesi taşıyan dokularda veya farmasötik tedavi sonrası hücre davranışlarının test edilmesi, embriyonik gelişim sırasında ilaç tedavisinin veya çevresel değişikliklerin etkileri için sağlık taraması yapılmasına olanak tanır. Benzer bir yaklaşım kalbe veya bağırsak göç nöral krest hücreleri incelemek veya metastatik tümör hücreleri çalışma için kullanılabilir. Embriyonun anatomisi doğru tahmin etmek zor.
Dokuları erken gelişim sırasında çok hızlı bir şekilde değişir. Büyük bir deney yapmadan önce mikrodiseksiyon uygulamanızı öneririz. Embriyolar canlı ve üç boyutlu olduğu için hız ve hassasiyet çok önemlidir.
Embriyonik gün 8.5, buz gibi PBS bir kap içine rahim hasat steril araçlar ve çözümler kullanın. Her embriyoyu ayırmak için mesometrium'u kesin. Rahimi dikkatlice inceleyin, her desidual şişliği ayırın.
Embriyonun doğru gelişim aşamasında toplanması, değişkenliğin azaltılması ve ekstrüzyonun matrise yapışmasının yanı sıra hücre göçünün artırılması açısından kritik öneme sahip. Kas tabakası ve embriyo desidual doku arasında slayt forceps ve kas tabakası kaldırmak için forceps ikinci bir çift kullanın. Mesometrial çekme kenarlarında yaprak delmek için forceps kullanın ve çekme dik doku açık doku yırtmak için forceps ikinci çifti kullanın.
Membranı dikkatlice çıkarmadan önce ricarts membranını görselleştirmek için forsepslerle desidual dokuyu soyun. Visseral sarısı sak görünür hale gelecek ve embriyo içinde gözlenecek. Visseral sarısı sak ve anion çıkarın ve baş kıvrım görselleştirme sağlamak için embriyo konumlandırın.
Kalbin üzerinde baş kıvrım kesin ve temiz bir nöral plaka elde etmek için altta yatan mezoderm kazımak. Nöral plaka kenarlıkları daha sonra kesilmelidir. Cam pasteur pipetkullanarak, incelenmiş nöral plakayı şartlı nöral tepe cikortaile dolu hidrojel kaplı bir tabağa aktarın ve kabı yavaşça kuyunun ortasındaki nöral plakayı konumlandırmak için döndürün.
Daha sonra uygun deneysel zaman dilimi için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nöral plaka kuluçka. Ekstrasyondan sonra 24 saat sonra, doku kültürü çanasını yüz kontrastmikroskobunun numune tutucusu içine yerleştirin ve çok kuyulu satın alma sırasında titremeyi önlemek için plaka kapağını ve karbondioksit iğnesini bantlayın. Daha sonra seçilen kondansatöreşleşen bir faz halkası ile 10 kat büyütme kranial nöral krest hücreleri odaklanmak.
Nöral krest hücre göç kapasitesini ölçmek için, mikroskobu her beş dakikada bir 10 kat büyütme de bir kare elde etmek için ayarlayın. Hücre morfolojisini ölçmek için mikroskobu dakikada bir kare elde etmek için 40 kat büyütme ayarlayın. Lamellipodia dinamiklerini ölçmek için mikroskobu, 40 kat büyütmede 10 dakika boyunca her 10 saniyede bir kare elde edecek şekilde ayarlayın.
Çok iyi görüntüleme için, seçilen X, Y ilgi pozisyonları arasında hareket etmek için mekanik sahne ayarlamak ve kranial nöral krest hücreleri odak olduğunu onaylamak ve sahne pozisyonları doğru olduğunu. Ardından, zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmak için edinme'yi tıklatın. Tek hücre izleme için, resim J'yi açın ve verileri tiff yığın dosyaları olarak aktarın.
Yön ve parlaklık ve kontrast düzeylerini değiştirin ve nokta stk dosyalarını piksel mikrometrelerindeki mikrometrelerdeki mikroskop ayarlarına göre kalibre etmek için analiz ve ayar ölçeğini tıklatın. Görüntüyü Açmak için eklentiler, izleme ve manuel izleme seçeneğini tıklatın J manuel hücre izleme eklentisini açın ve hücre takibine başlamak için parça ekle'yi seçin. Ardından, çekirdeği referans noktası olarak kullanarak hücreleri tüm hızlandırılmış filmlerin karelerinde izleyin.
Nöral tepe göç kapasitesini değerlendirmek için uygun bir geçiş analizi yazılım programı açın ve hücre izleme verilerini nokta txt dosyası olarak almak için alma veri sekmesini tıklatın. Veri kümeleri ve başlatma altında, çözümlenecek dilim veya çerçeve sayısını seçin ve Çerçeveler arasındaki X Y kalibrasyonunu ve zaman aralığını ayarlayın. Ayarları kaydetmek için uygula ayarlarını seçin.
Ardından, yörünge çizimlerini oluşturmak için çizim veri sembolünü seçin ve mesafe ve hız ölçülerini ölçmek için istatistik simgesini seçin. Nöral krest hücre alanı ve dairesellik ölçmek için, açık görüntü J ve analiz ve ölçümleri ayarlamak altında, hücre şekli parametreleri, hücre alanı, çevre ve şekil tanımlayıcı seçmek için tıklatın. Kılavuz olarak hücre zarı sınırlarını kullanarak her hücrenin etrafına el ile bir anahat çizmek için ücretsiz el seçim aracını kullanın.
Görüntüdeki hücre anahattı kaplamasını korumak için klavyedeki Denetim+B tuşlarına basın ve her zaman atlamalı çerçevede her hücre için tekrarlayın. Resim bindirme ve ilgi yöneticisi ulaşmak ve ilgi hücreleri seçmek için tıklatın. Ardından, seçili hücre şekli parametreleri için ilgi değerlerini elde etmek için ölçü'ye tıklayın.
Ekstrbitki ve kültürden sonraki 24 saat içinde, göçmen öncesi epitel kranial nöral tepecik bölgesinin nöral plaka ekstronu çevreleyen bir bölge açıkça görülebilir. Ayrıca, nöral krest hücrelerinin bir alt popülasyon mezenkimal geçiş epitel geçirmiş olacak ve tam mezenkimal görünür. Hücre dışı matriks bazlı hidrojel veya fibronektin üzerine kurulu eksplant kültürleri, nöral plaka premigratory nöral krest ve göçmen nöral krest hücre popülasyonlarından oluşan benzer eksplant yapıları oluştururlar.
Ancak fibronektin kaplama eksektifler hücre nin önde gelen kenarında daha belirgin lamellipodia hücreleri üretmek görünüşte daha göç yönünde polarize. Zaman atlamalı mikroskopi, tek tek hücrelerin X, Y koordinatlarının izlenmesini ve nöral krest hücre göçünün analizini ve zamanla kraniyal nöral krest hücre morfolojisi dinamiğinin analizini sağlar. Hücre zarlarının tek tek ana hatlarıyla, hücre alanı ve çevre ölçümleri, hücre alanının sonraki nicelikselleştirilmesive bireysel ve hücre gruplarının daireselliği için filmlerin tüm çerçevelerinden hesaplanabilir.
Hücreler ekstrandan uzaklaştıkça hücre alanının önemli ölçüde arttığını, hücrelerin daireselliği nispeten sabit kalırken, hücrelerin epitel kenarından ayrılıp hücreyi hücre temaslarına kaptırdıkça, hücre yayılma alanının arttığını gösterdiğini unutmayın. Temiz bir nöral plaka elde etmek için altta yatan mezoderm uzak kazıma özellikle dikkat, Bu doku uzak nöral krest hücrelerinin göç teşvik gibi. Immunostaining, RTPCR veya tek hücre analizi gibi diğer birçok teknik kültür hücrelerinin farklı popülasyonları arasında farklı proteinler veya ilgi genleri analiz etmek için yapılabilir.
Nöral krest hücre göçünde yer alabilecek bazı önemli nöroblastom genlerinin gelişimsel ruloları ve bu yaklaşımın insan hastalığı genlerini incelemek için kullanılması yla ilgileniyoruz.
Genel Bakış
Bu protokol, fare modellerinden kranial sinir krest hücrelerinin diseksiyonunu ve kültürünü, hücre göçü ve canlı görüntüleme tekniklerine odaklanan şekilde açıklamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Nöral krest hücreleri embriyonik gelişimde kritik bir rol oynar.
- Bunların göçünü anlamak doğum kusurlarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Canlı görüntüleme teknikleri hücre davranışlarının gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
- Bu hücrelerin doğru bir şekilde diseksiyonu ve kültürü konusunda zorluklar mevcuttur.
Çalışmanın Amacı
- Memelilerde birincil nöralkan krest göçünü incelemek.
- Genetik mutasyonların ve farmasötik tedavilerin hücre davranışı üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Kranialnöralkan krest hücre göçü ve morfolojisinin dinamiklerini analiz etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyolar 8.5. günde mikrodiseksiyonu.
- Nöralkan krest hücrelerinin koşullandırılmış ortamda kültürü.
- Hücre göçünü izlemek için zaman sınırlı mikroskopi.
- Hücre morfolojisi ve göç kabiliyetini ölçmek için görüntü analizi.
Ana Sonuçlar
- Nöralkan krest hücreleri epitelyal-mezenşimal geçişe uğrar.
- Farklı alt tabakalar hücre morfolojisi ve göç dinamiklerini etkiler.
- Zaman sınırlı görüntüleme, bireysel hücre hareketlerinin detaylı şekilde izlenmesini sağlar.
- Nicel analiz, çeşitli koşullar altında hücre davranışları hakkında içgörüler sağlar.
Sonuçlar
- Bu protokol, nöralkan krest hücre göçünü incelemek için bir çerçeve sunar.
- Bulgular gelişimsel süreçlerin ve olası doğum kusurlarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki çalışmalar bu yöntemler üzerinde gelişerek nöralkan krest biyolojisinin diğer yönlerini araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct observation of neural crest cell delamination and migration, providing a reductionist system to interrogate mechanisms underlying neurocristopathies. By isolating cranial neural crest cells from mouse embryos, researchers can assess the impact of genetic or pharmacological perturbations on epithelial-mesenchymal transition and motility. The approach supports early-stage target validation by linking molecular changes to phenotypic outputs in a disease-relevant developmental context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by linking genetic mutants to EMT and migration phenotypes.
- Operational Value: Establish causal relationships between gene function and neural crest cell behaviors.
- Strategic Value: De-risk targets by confirming functional relevance in a primary cell model of developmental pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare standardized explant cultures for consistent assessment of compound effects on cell migration.
- Operational Value: Enable quantitative, time-resolved readouts of lamellipodia dynamics and cell morphology.
- Strategic Value: Support assay scalability for screening libraries against migratory phenotypes in a primary system.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Model human neurocristopathy mechanisms using patient-derived mutations in a murine primary cell context.
- Operational Value: Bridge in vitro findings to in vivo relevance through conserved EMT and migration pathways.
- Strategic Value: Inform preclinical candidate selection by predicting effects on developmental signaling networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery, supporting target validation through phenotypic screening of cranial neural crest cell behaviors prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in neural crest induction, EMT, and migration.
- Screening: Delivers assay-ready primary cultures with quantifiable outputs for compound or genetic perturbation analysis.
- Analytics: Generates trajectory, speed, distance, area, and circularity measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental mechanisms to disease models via conserved migratory and morphological phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying neural crest-related targets across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into target function through direct observation of EMT and migration.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized explant culture and live imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in target phenotype relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on developmental pathway modulation.
Implementation Considerations
- Expertise in embryonic dissection and microsurgery at E8.5.
- Access to phase-contrast and fluorescence microscopy with environmental control.
- Standardized hydrogel or fibronectin coating for consistent explant adhesion.
- Adaptability to genetic mutants and pharmacological treatments via culture medium supplementation.
- Limitations include embryo availability, dissection variability, and the need for live-cell imaging infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Early Somite Stage Embryo Dissection (Day 1)
3:12
Live Cell Imaging of Murine Cranial Neural Crest Cells (Day 2)
4:36
Neural Crest Single Cell Tracking
5:22
Quantification of Neural Crest Cell Migratory Capacity
6:04
Quantification of Neural Crest Cell Area and Circularity
7:00
Results: Representative Cranial Neural Crest Cell Migration and Cell Shape Dynamics Analyses
8:43
Conclusion
