Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi
30 Temmuz 2019
Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Mitokondriyal fonksiyon hematopoetik kök hücre kendini yenileme için önemlidir. Mitokondriyal aktivite iç mitokondriyal membran potansiyelinin bir reflektörüdür, tmrm ile ölçülebilir, bir hücre floresan, hücre perkastesi katyonik boya. Ksenobiyotik efflux pompalar HSC'de son derece aktiftir ve TMRM ekstrüzyonuna neden olur.
Bu protokolün en büyük avantajı, efflux pompaların inhibitörü Olan Verapamil'i kullanarak bu etkinin düzeltilmesidir. Fare uyluk kemik iliği izole ederek başlayın. İki posterior pençeleri kesmek için forceps ve keskin makas bir çift kullanın.
Sonra farenin ventral deri küçük bir snip yapmak ve germek. Femur ve tibia ayıklayın, femur başları yerinden değil özen yaparken, ve altı kuyu plaka kemikleri yerleştirin, boyama tampon 1.5 mililitre ile dolu. Kemiklerden kasları çıkarın ve kemik iliği çıkmak için izin, kemiklerin uçlarını kesti.
Temizlenmiş kemikleri 1,5 mililitre boyama tamponuyla yeni kuyulara yerleştirin. Sonra, kemik üç mililitreşlik şırınga ve 25 gauge iğne ile kemik iliği dışarı floş, kemik beyaz olana kadar. 1.5 mililitrelik bir tüptüm hücreleri toplamak ve 180 kez G beş dakika santrifüj, sonra supernatant atın.
Dikkatle buz soğuk ACK lysing tampon 300 mikrolitre pelet resuspend ve bir dakika için buz hücreleri koymak. Daha sonra bir mililitre boyama tamponu ekleyerek lysis'i hemen devre dışı bırakın. Hücreleri 180 kez g.Resuspend hücre pelet, beyaz görünmesi gereken beş dakika santrifüj, boyama tampon bir mililitre içinde.
Hücreleri 35 mikrometre naylon kafesle hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreuygulayın ve mononükleer hücreler elde edin. Soyun kokteyli ve feorofore konjuge antikorlar hazırlayarak başlayın, el yazması talimatlara göre. Antikorları buzda tutun ve ışıktan koruyun.
Daha sonra, 180 kez G beş dakika için örnek santrifüj ve supernatant atın. Hücre peletine 400 mikrolitre silik kokteyl ve dört mikrolitre CD135 biyotinylated antikorlar ekleyin ve karışımı girdap. Sonra 30 dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, numuneyi üç mililitre boyama tamponu ekleyerek, 180 kez G'de beş dakika eğdirerek ve süpernatantı atarak yıkayın. Sonra antikor çözeltisi 400 mikrolitre ekleyin ve karışımı girdap. 30 dakika daha buzüzerinde kuluçkaya yatvere ve boyama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.
TMRM boyama çözeltisini hazırlamak için trombopoietin ve kök hücre faktörü ile 2,2 mikrolitre TMRM stok çözeltisi ve 1,1 mikrolitre Verapamil, 1,1 mililitre serumsuz hematopoetik kültür ortamı ekleyin. TMRM boyama çözeltisinin bir mililitresinde kemik iliğini yeniden askıya alın, girdap hızlıca ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Akış sitometresini tıkamamak için numuneyi 35 mikrometre naylon kafesle bir hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreleyin.
Sonra DAPI bir mikrolitre ekleyin ve akış sitometri ile devam edin. Kemik iliği örneğini çalıştırın ve en az bir milyon etkinlik elde edin. Daha sonra cd135 Lin-negatif ve Lin-pozitif fraksiyonları tanımlamak için, pasifik mavisi için bir komplo canlı kemik iliği mononükleer hücreleri görüntüleyin.
Çok güçlü ataveya MPP fraksiyonu tanımlamak için APC/Cy7 karşı PE/Cy7 için Lin-negatif fraksiyonu çizin. Sonra hematopoetik kök hücre veya HSC fraksiyonu tanımlamak için, PerCP/Cy5.5 karşı APC için MPP fraksiyonu çizin. CD34 negatif HSC ve CD34 pozitif HSC fraksiyonlarına bölmek için FITC veya CD34 için HSC fraksiyonu görüntüleyin.
Son olarak her popülasyonda TMRM yoğunluğu elde edin. TMRM boyamadoğru çalıştı emin olmak için, örnek için FCCP bir mikrolitre ekleyin, bir milimolar son konsantrasyon için, ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. O zaman bir milyon etkinlik kazan.
FCCP ilavesi sonrasında TMRM yoğunluğu önemli ölçüde artırılmalıdır. Bu protokol, TMRM boyası ile çeşitli hücre popülasyonlarında mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için başarıyla kullanılmıştır. PBS ve FBS'nin kültür ortamıiçinde bulunmasının TMRM sinyal yoğunluğunu etkilediği gösterilmiştir.
Bu nedenle serumsuz genleşme ortamda TMRM boyama yapmak önemlidir. Hematopoetik kök hücreler, TMRM boyasını ekstrüzyon yapan ksenobiyotik efflux pompaların yüksek aktivite düzeylerini ifade eder. Yani TMRM profilleri de Verapamil veya Siklosporin H, pompaları blok varlığında değişir.
TMRM boyama doğruluğunu doğrulamak için, FCCP mitokondri depolarize ve TMRM yoğunluğunu azaltmak olabilir. Bu protokol, TMRE veya JC-1 dahil olmak üzere farklı bir mitokondriyal membran potansiyel boya ile HSC eğitimi için kolayca uyarlanabilir. Yanı sıra MitoTracker veya MitoSOX gibi diğer mitokondriyal boyalar.
Kemik iliği popülasyonu arasında efflux pompaların farklı aktivitesi nden kaynaklanan kritik konular açıktı. Yani bu protokol, önceki bulgular arasındaki tutarsızlığı azaltmayı amaçlamaktadır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, floresan bir boya olan TMRM kullanarak hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) mitokondriyal membran potansiyelini ve xenobiyotik eflluks pompalarının etkisini incelemektedir. Bu pompaları inhibe ederek TMRM seviyelerinin doğru şekilde ölçülmesini ve mitokondriyal fonksiyonun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan, Verapamil içeren bir protokol sunulmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Kök hücrelerde mitokondriyal dinamikler
- Hücresel efleks mekanizmaları
- Membran potansiyeli ölçümü
Arka Plan
- Kök hücre yenilenmesinde mitokondriyal fonksiyonun önemi
- Eflüks pompalarının boya ölçümleri üzerinde yarattığı zorluklar
- Mitokondriyal potansiyel göstergesi olarak TMRM kullanımı
Kullanılan Yöntemler
- Farelerden kemik iliği izolasyonu
- Hücre popülasyon analizi için akış sitometrisi
- Verapamil kullanılarak eflluks pompalarının inhibisyonu
Temel Sonuçlar
- HSPC'lerde mitokondriyal membran potansiyelinin başarılı şekilde kantifikasyonu
- Verapamil'in TMRM tutulumu üzerindeki kanıtlanmış etkileri
- Protokolün alternatif mitokondriyal boyalar için uyarlanabilirliği
Sonuçlar
- Çalışma, kök hücrelerde mitokondriyal aktiviteyi değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, kök hücre biyolojisinin ve farmakolojik ajanların mitokondriyal fonksiyon üzerindeki etkilerinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin doğru değerlendirilmesi, kök hücre self-yenilenmesinin ve metabolik düzenlemenin anlaşılması için esastır. Bu hücrelerdeki eflluks pompası aktivitesi, floresan boya ölçümlerini saptırarak hedef doğrulamayı ve preklinik model güvenilirliğini etkileyen yanlı verilere yol açabilir. Bu protokol, akış sitometrisi tabanlı analizlerdeki temel bir teknik kısıtlamayı ele alarak, sonraki keşif ve translasyonel uygulamalar için veri tutarlılığını artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Boya çıkışı kaynaklı ölçüm artefaktlarını azaltarak, hematopoetik kök hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun terapötik bir hedef olarak sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Xenobiyotik taşıyıcı değişkenliğini düzelterek, farklı deneysel modellerde kök ve progenitör hücre popülasyonlarının tutarlı bir şekilde karşılaştırılmasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mitokondriyal potansiyel okumalarının eflluks aktivitesi yerine gerçek biyolojik durumu yansıtmasını sağlayarak, valide edilmiş hematopoetik sistemleri bileşik taramasına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Boyama protokollerinde Verapamil gibi eflluks pompası inhibitörlerinin kullanımı yoluyla analiz tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Kök hücre kendini yenileme yolaklarıyla bağlantılı güvenilir mitokondriyal aktivite verileri sağlayarak mekanistik risk azaltımını kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Model sistemler genelinde temel bir fonksiyonel çıktıyı standardize ederek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, kök hücre biyolojisinde hipotez testlerini destekleyerek ve lider bileşik belirleme çalışmaları öncesinde güvenilir fonksiyonel profilleme sağlayarak keşif sürekliliğine katkıda bulunur.
- Keşif Biyolojisi: Boya ekstrüzyonundan kaynaklanan yanlış düşük sinyalleri minimize ederek, hematopoetik sistemlerde mitokondriyal hedef doğrulamasını ve yolak aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Efüks inhibe edildiğinde kantitatif ve tekrarlanabilir mitokondriyal potansiyel ölçümleri sağlayarak bileşik etkisinin tespitini geliştirir.
- Analitik: Hücre fraksiyonları ve tedavi koşulları genelinde metabolik durumların karşılaştırılmasına olanak tanıyan akış sitometrisi tabanlı okumalar (TMRM yoğunluğu) oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Fonksiyonel sonuçlarla ilişkili, kök hücre uygunluğunun translasyonel bir metriğini sağlayarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projede kök hücre modellerinde mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir akış sitometrisi iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Analiz değişkenliğinin temel bir kaynağını ortadan kaldırarak, kök hücre mekanizması çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Hematopoetik araştırma ortamlarındaki mitokondriyal analizlerin standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Boya efluksuna bağlı yalancı negatifleri azaltarak, hedef doğrulamada daha iyi karar verme süreçlerini destekler.
- Portföy Etkisi: Daha doğru fonksiyonel verilere dayanarak, kök hücre hedeflerinin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Akış sitometrisi, kök hücre izolasyonu ve floresan boya kullanımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Verapamil'e veya alternatif efllüks pompası inhibitörlerine ve uyumlu boyama tamponlarına erişime bağımlıdır.
- İnhibitör zamanlaması ve konsantrasyonunda tutarlılığı sağlamak için ekipler arasında standardizasyon gerektirir.
- Uzun süreli kültürlerde Verapamil'in hücre canlılığı veya metabolizması üzerindeki potansiyel hedef dışı etkileri dikkate alınmalıdır.
- Mitokondriyal membran potansiyelinin ilgili bir fonksiyonel okuma olduğu ve efllüks aktivitesinin girişime neden olduğunun bilindiği uygulamalarla sınırlıdır.
