Name: Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Keşfedin, akış sitometrisi ile hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin doğru ölçümü için Verapamil kullanımını. Bu yöntem, kök hücre biyolojisinde güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Ito laboratuar, özellikle K Ito ve H sato ve Einstein kök hücre Enstitüsü yorum ve Einstein Flow cytometry ve analitik görüntüleme çekirdek tesisleri (Ulusal Kanser Enstitüsü Grant P30 CA013330 tarafından finanse edilen) tüm üyelerine teşekkür deneyler yürütmek yardımcı olur. K.I. Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK98263, R01DK115577 ve R01DK100689) ve Einstein tek hücreli Genomics/Epigenomics (C029154) çekirdek Direktörü olarak sağlık New York Dışişleri Bakanlığı hibe tarafından desteklenir. K.I. Ito lösemi ve lenfoma toplumu araştırma bilimci olduğunu.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Albert Einstein Tıp Koleji 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) tarafından onaylanmıştır.
1. çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Boyama tampon (fosfat-tamponlu tuz (PBS) + 2% fetal sığır serumu (FBS)): steril PBS çözeltisi 500 mL 'de 10 mL FBS ekleyin. Not: Bu çözüm, steril durumda en az bir ay boyunca 4 °C ' de depolanabilir. Aşağıdaki yordamları başlatmadan önce, bu çözümün (50 ml) bir kısım buz üzerine koyun.</li>
	<li>ACK (amonyum-klorür-potasyum) parçalanması tampon: prosedürü başlatmadan önce buz üzerinde ACK parçalanması tampon (1 ml) bir kısım yerleştirin. Not: Aynı ticari olmayan tampon hazırlamak için, 8,02 g NH4CL, 1 g KHCO3 ve 37,2 mg na2EDTA 1 L, H2O. pH değerini 7.2-7.4 olarak ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Kültür ortamı: ekleme 50 ng/mL kök hücre faktörü (SCF) ve 50 ng/mL thrombopoetin (TPO) kültür ve hematopoetik hücrelerin genişlemesi için serum-ücretsiz Orta (bkz: ticari orta için malzeme tablosu önerilir).</li>
	<li>TMRM Stock çözümü: 10 mL etanol içinde 5 μg TMRM tozu çözünerek TMRM (1 μM) solüsyonu hazırlayın. Bu çözümü-20 °C ' de Işıkdan korunmuş olarak saklayın.</li>
	<li>Verapamil stok çözümü: 1 mL etanol içinde 24 mg verapamil seyreltilerek verapamil (50 mM) solüsyonu hazırlayın. Bu çözümü-20 °C ' de saklayın.</li>
	<li>FCCP stok çözümü: 1 mL etanol içinde 254 mg çözünerek carbonilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) solüsyonu hazırlayın. Bu çözümü-20 °C ' de Işıkdan korunmuş olarak saklayın.</li>
</ol>2. kemik Iliği yalıtımı
<ol><li>CO2 inhalasyon kurumsal kuralları takip ve 70% etanol ile fareler sprey tarafından fare euthanize. Not: Bu adım, deneysel sonuçlardan ödün vermeden ilgi hücrelerinin kontaminasyonunu önler.</li>
	<li>Bir çift forseps ve keskin makas kullanarak, fare ventral cilt küçük bir SNIP yapmak ve cilt streç.</li>
	<li>Femur ve Tibia özü onlar kemik iliği hücrelerinin büyük miktarda içeren olarak femur başkanları çıkarmak için değil bakım alırken. Kaldırılan kemikleri 1,5 mL 'Lik boyama tamponunu dolduran 6-kuyu plakasına yerleştirin. Not: Bu prosedür steril alan gerektirmez.</li>
	<li>Kemiklerin kasları çıkarın ve kemik iliği çıkış sağlayan Kemiklerin uçları kesilmiş (Şekil 1a). 1,5 mL 'Lik boyama tamponu ile temizlenmiş kemikleri yeni kuyulara yerleştirin. Not: Kaslar ve diğer dokularda bir sonraki adımda şırınga tıkanmasını önlemek için dikkatle kaldırılması gerekir.</li>
	<li>25 G iğne ile 3 mL şırıngayı kullanarak kemik iliğini çıkarın. Not: Kemik iliğinin kemiği beyazlaşıncaya kadar temizlenmeye devam edin (Şekil 1B).</li>
	<li>1,5 ml 'lik bir tüpteki tüm hücreleri toplayın, 180 x g 'de 5 dakika santrifüjten sonra süpernatant 'ı atın (Şekil 1C).</li>
	<li>300 μL buz soğuk ACK parçalanması tampon çok dikkatli bir şekilde Pelet resuspend, 1 dk ve hemen aktif lizis için buz koymak 1 ml boyama tampon ekleyerek. 180 x g'de 5 dakika Santrifüjü. Not: Hücreler Pelet beyaz görünür (Şekil 1D). Yalıtılmış hücrelerin toplam sayısı yaklaşık 2-4 x 107' dir.</li>
	<li>Mononükleer hücreler elde etmek için bir 35 μm naylon mesh ile bir hücre süzgeci kapağı (12 x 75 mm2,5ml kapasiteli) kullanarak 1 ml boyama tamponu ve filtresinde pelletleri resuspend. Engellemeden sonra, numuneyi buzda tutun.</li>
</ol>3. HSC 'nin tespiti için immünostam
<ol><li>Lineage (Lin) kokteyli hazırlayın. 400 yılında μL boyama tampon, CD3e, CD4, CD8, b220, CD11b, GR1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM ve Il7Ra karşı aşağıdaki biotinilated antikorların 4 μL ekleyin son seyreltme 1:100 elde etmek için.</li>
	<li>Conjuated fluorophores hazırlayın-antikorlar (ABS). 400 yılında μL boyama tamponu, son seyreltme 1:100 elde etmek için aşağıdaki ABS 4 μL ekleyin. Streptavidin-Pasifik mavisi, Sca1-PE/Cy7, c-Kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 ve CD34-FITC. Buz içinde tutun, ışıkta korunur.</li>
	<li>Numune Santrifüjü 5 dk 180 x g, sonra supernatant atın.</li>
	<li>400 Ekle μL Lin kokteyl solüsyonu hücrelerine Pellet. 4 μL CD135-biotinilated AB. Vortex hızlı mix ve buz 30 dakika için inküye ekleyin.</li>
	<li>3 mL boyama tamponu ekleyerek numuneyi yıkayın, 180 x g 'de 5 dakika aşağı döndürün ve supernatant 'ı atın.</li>
	<li>400 μL ABS solüsyonu ekleyin. Girdap hızlı mix ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inküsmek.</li>
	<li>Numuneleri 3 mL Boya tampon ile yıkayın, 180 x g 'de 5 dakika aşağı doğru döndürün ve süpernatant 'ı atın.</li>
</ol>4. TMRM boyama
<ol><li>TMRM boyama çözümünü hazırlayın. 2,2 μL TMRM hisse senedi çözeltisi ve 1,1 μL verapamil (sırasıyla 2 nM ve 50 μM son konsantrasyon olarak) ekleyin, 1,1 mL serum-serbest orta kültür ve hematopoetik hücrelerin genişlemesi için (bkz: ticari orta için malzeme tablosu önerilir) TPO ile ve SCF. Not: Bu, protokolün en önemli adımıdır. Verapamil ilavesi, HSCs 'de yüksek oranda ifade edilen ve TMRM ekstrüze edilebilir olan "effluks" pompaları engellemek için gereklidir.</li>
	<li>Kemik iliğini 1 mL TMRM boyama çözeltisi içinde resuspend, hızlı Vortex ve 37 °C ' de 1 h için inküser. Not: TMRM boyama yıkanır olmamalıdır. PE-adanmış tazminat kontrolü de 100 μL TMRM boyama çözeltisi resuspended ve hızlı Vortex sonra 37 °C ' de 1 h için inkübasyon tabi tutulur.</li>
	<li>Akış cytometer tıkanmasını önlemek için bir 35 μm naylon mesh ile bir hücre süzgeci kapağı (12 x 75 mm2,5ml kapasite) kullanarak örnek filtre. Not: TMRM boyama numunenin CLOG oluşumu olasılığını artırır. Numune filtrasyon sadece akış sayısı önce önerilir.</li>
	<li>Akış sitometrisi ile ölü hücreleri dışlamak için 1 μL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ekleyin.</li>
</ol>5. Flow Cytometer tarafından edinme
<ol><li>Kemik iliği örneğini çalıştırın ve en az 1 x 106 etkinlik kazanın.</li>
	<li>
Farklı hematopoetik nüfusu belirlemek için gating stratejisini ayarlayın (Şekil 2).
	<ol>
<li>Canlı kemik iliği mono-nükleer hücreleri (BM-MNCs), DAPI− FRAKSIYONU, CD135−Lin− (Lin−) ve Lin+ kesirleri tanımlamak için Pacific Blue için arsa içinde görüntüleyin.</li>
		<li>APC/Cy7 (c-Kit) ile PE/Cy7 (SCA-1) için Lin− fraksiyonu, c-Kit+ ve SCA-1+olarak MULTIPOTENT progenatörler (MPP) fraksiyonu tanımlamak için Plot.</li>
		<li>APC (CD48) ile PerCP/Cy 5.5 (CD150) için MPP kesirli kısmını CD150+ ve CD48−olarak HSC kesir tanımlamak için çizin.</li>
		<li>CD34−-HSC ve CD34+-HSC 'YI bölmek IÇIN FIC (CD34) için HSC kesir görüntüleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her popülasyonda TMRM yoğunluğunu (PE kanalı) edinin.</li>
	<li>Satın aldıktan sonra, 1 mM 'Lik son konsantrasyonu elde etmek ve 5 dakika boyunca 37 °C ' de inküye etmek için FCCP örnek 1 μL 'ye ekleyin, ardından 1 x 106 etkinlik kazanın. Not: FCCP, Δkr m 'yi dağıtmak için kullanılan bir mitokondriyal uncoupler. TMRM boyama düzgün çalıştığını onaylamak için deneysel kontrol olarak kullanılır. FCCP yönetiminin ardından TMRM yoğunluğu büyük ölçüde azalmalıdır (Şekil 3A).</li>
	<li>Her nüfusun PE 'nin ortalama yoğunluğunu, tüm BM-MNCs ' i p yoğunluğu ile normalleştiren verileri analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells%3A+origins%2C+phenotypes%2C+lineage+commitments%2C+and+transdifferentiations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell%3A+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li>
<li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+a+purified+Tie2%2B+hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li>
<li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li>
<li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125(2016).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+and+cyclosporin+A-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Mitokondriyal membran potansiyel ölçümü, hücrenin metabolik durumu için kritik olan mitokondri analizinin ve değerlendirmesinin temel taşıdır. Burada, TMRM staining tarafından Δkr m analizi için bir protokol açıklanmaktadır. TMRM, Δkr m nedeniyle aktif mitokondri içinde biriken ve ilgili seviyeleri, ekstrüler, sitoplazmik ve mitokondriyal bölmeleri10arasında denge içinde kalır bir hücre-perdemek floresan boya. Bu protokol tetrametilrhodamin, etil ester (TMRE) ve JC-1 gibi çeşitli boyalar için uyar...

Hematopoetik kök hücreler (HSCs) kendi kendini yenileyen, çok güçlü ve kan1,2tüm hücrelere artış veren yeteneğine sahiptir. Hücresel metabolizma HSC bakım, transkripsiyon faktörleri, içsel sinyaller ve mikroçevre3,4,5ile birlikte önemli bir düzenleyici olduğunu. Mitokondriyal fonksiyon ve kalitenin uygun kontrolü bu nedenle HSC bakım6,7için önemlidir.
Mitokondriyal membran potansiyeli (Δkr m), doğrudan işlevselliğini yansıtan mitokondri değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da elektron taşıma zincirindeki proton pompalama aktivitesinin dengesinden ve F üzerinden proton akışına göre türemiştir. 1/FO ATP synthase. Bu her ikisi de (gen ifadesi ve substrat kullanılabilirliği bağlı olarak) ADP, ATP için oksijen bağımlı fosforilasyon için8,9gereklidir. Mitokondriyal bölmesinin elektronik aletinden faydalanabilmek için Δkr m 'i ölçmek üzere çeşitli Potansiyometrik boyalar geliştirilmiştir. Bunlardan biri tetrametylrhodamine metil ester perklorat (TMRM), hangi yaygın hücreler çeşitli akış sitometri tarafından δkr m ölçmek için kullanılan10, hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil11.
Ancak, bu hücrelerin ksenobiyotik "effluks" pompaları yüksek aktivite boya ekstrüzyon12neden olabilir çünkü mitokondriyal boyalar, HSCs bazı dikkatli kullanılması gerekir. Nitekim, Rhodamine 123 gibi mitokondriyal boyaların ekstrüzyon araştırmacılar HSCs izole etmek için izin verdi13 veya HSC tanımlamak "yan nüfus" boya Hoechst mavi ve Hoechst kırmızı14diferansiyel ekstrüzyon sömürüyor tarafından, 15. aynı zamanda bu Fumitremorgin C, ATP-bağlayıcı kaset alt aile G üyesi 2 (ABCG2) taşıyıcı, belirli bir engelleyici, HSPCs16mitotracker boyama deseni etkilemez gösterildi. Bu sonuçların yayınlanması sonrasında, ksenobiyotik "effluks" pompa inhibitörlerinin yokluğunda mitokondrial boyalar kullanılarak birden fazla çalışma gerçekleştirildi, HSCs 'nin düşük δkr m16 ile sadece az sayıda mitokondri sahip olduğu yaygın izlenimi taşımaktadır. , 17 , 18 yaşınakadar.
Son zamanlarda, ancak, bu verapamil, "effluks" pompaları geniş bir spektrum inhibitörü, önemli ölçüde mitokondriyal boya mitotracker yeşil19boyama deseni değiştirir gösterildi. Bu tutarsızlık muhtemelen Fumitremorgin C 'nin Abcg2 için son derece seçici olması nedeniyle, HSCs Ayrıca Abcb1a gibi diğer taşıyıcıları da ifade ederken (sadece Fumitremorgin C 'ye zayıf hassastır)19. Ayrıca, TMRM, nonyl akridin Orange ve mitotracker Orange (MTO) gibi diğer mitokondrial boyaların mitotracker Green ile aynı desenleri sergilediğine dair rapor verdik. Daha da önemlisi, HSPCs 'in akış cytometrik desenlerinin, mitokondriyal kütle11' e ek olarak Δkr m 'lerini yansıttığını gözlemledik.
TMRM boya alımı kesinlikle mitokondri negatif şarj bağlıdır, ancak boya elde edilen birikim, alımı ve boşluğu arasında sürekli bir denge ile "effluks" pompalar20. HSCs ve olgun hücre nüfusu arasındaki ksenobiyotik "effluks" pompa ifadesinde fark bu dengeyi etkiler ve önyargılı sonuçlara yol açabilir. Verapamil gibi özel inhibitörlerinin kullanımı, Potansiyometrik boyalar ile Δkr m analizinde düşünülebilir. Burada, özel inhibitörler kullanılarak ksenobiyotik ışınlama aktivitesini düzeltir olan TMRM tabanlı Akış sitometrisi ile doğru δkr m ölçümü için değiştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>ACK parçalama tamponu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B220-biotin</td><td>BD Bioscience</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD3e-biotin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>13-0031-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-biotin</td><td>Life Technologies</td><td>13-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-biotin</td><td>BD Biyobilim</td><td>553309</td><td></td></tr><tr><td>CD19-biyotin</td><td>BD Biyobilim</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>CD48-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0481-82</td><td></td></tr><tr><td>CD135-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-PerCP / Cy5.5&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115922</td><td></td></tr><tr><td>c-kit-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Siklosporin H</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1575-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI çözeltisi (1 mg / mL)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gr1-biotin</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>IgM-biotin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>13-5790-85</td><td></td></tr><tr><td>Il7R & alpha; -biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td></td></tr><tr><td>Nk1.1-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553163</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1-PE / Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-81</td><td></td></tr><tr><td>SCF murin</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03-10UG</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM ortamı</td><td>STEMCELL teknolojileri</td><td>9605</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Pasifik Mavisi</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-biotin</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553672</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5428-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>315-14-10UG</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hidroklorür</td><td>Millipore Sigma</td><td>V4629-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

efflux pompaları inhibisyonu ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Hücresel metabolizma hematopoetik kök hücre (HSC) Self-yenileme, hematopoetik homeostaz mitokondri tarafından oynanan çeşitli roller önemli bir düzenleyici olduğu gibi kapsamlı HSC araştırmacılar tarafından incelendi. Mitokondriyal aktivite seviyeleri, TMRM (tetrametilrhodamin, metil ester) gibi hücre-perdemek kyonik boyalar ile ölçülecek olan membran potansiyelleri (Δkr m) ile yansıtılır. Bu boyalar hücrelerden ekstrüze etmek için "effluks" pompaları yeteneği, ancak kullanışlılığı sınırlandırabilirsiniz. Ksenobotik taşıyıcılar, HSCs 'de farklılaşmış hücrelerden daha yüksek ifade ve etkinlik sergileyen, HSCs 'yi değerlendirirken elde edilen ölçüm önyargı özellikle önemlidir. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü olan verapamil 'i kullanarak, birden fazla kemik iliği nüfusu arasında δkr m 'i doğru şekilde ölçmek için bir protokol açıklanmaktadır. Pompa aktivitesinin ortaya çıkan inhibisyonu, hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde TMRM yoğunluğunu artırmak için gösterilir (hspcs), Olgun fraksiyonları nispeten değişmeden bırakarak iken. Bu, Δkr m 'ye bağımlı boyalar kullanıldığında ve yazılmış ve görselleştirildiğinde gerekli olan boya-efflux aktivitesine yakın ilgi vurgulamaktadır, bu protokol kemik iliği içindeki farklı nüfus ya da aynı nüfus içinde doğru karşılaştırmak için kullanılabilir farklı deneysel modeller arasında.

Yukarıda açıklanan protokol, BM-MNCs ' i fare modelinden kolay yalıtımını sağlar. Şekil 1 protokolün ana adımlarını özetler: kemik yalıtımı, kemik iliği dışında yıkama, kırmızı kan hücresi Lizi, ve antikor boyama, belirli bir hematopoetik nüfus mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için TMRM boyama izledi .
BM-MNCs, HSCs dahil olmak üzere birkaç hücre nüfus içerir. Bu protokolde kullanılan antikor kokteylleri, HSCs 'nin (CD34− ve CD34+),...

Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Mitokondriyal fonksiyon hematopoetik kök hücre kendini yenileme için önemlidir. Mitokondriyal aktivite iç mitokondriyal membran potansiyelinin bir reflektörüdür, tmrm ile ölçülebilir, bir hücre floresan, hücre perkastesi katyonik boya. Ksenobiyotik efflux pompalar HSC'de son derece aktiftir ve TMRM ekstrüzyonuna neden olur.Bu protokolün en büyük avantajı, efflux pompaların inhibitörü Olan Verapamil'i kullanarak bu etkinin düzeltilmesidir. Fare uyluk kemik iliği izole ederek başlayın. İki posterior pençeleri kesmek için forceps ve keskin makas bir çift kullanın.Sonra farenin ventral deri küçük bir snip yapmak ve germek. Femur ve tibia ayıklayın, femur başları yerinden değil özen yaparken, ve altı kuyu plaka kemikleri yerleştirin, boyama tampon 1.5 mililitre ile dolu. Kemiklerden kasları çıkarın ve kemik iliği çıkmak için izin, kemiklerin uçlarını kesti.Temizlenmiş kemikleri 1,5 mililitre boyama tamponuyla yeni kuyulara yerleştirin. Sonra, kemik üç mililitreşlik şırınga ve 25 gauge iğne ile kemik iliği dışarı floş, kemik beyaz olana kadar. 1.5 mililitrelik bir tüptüm hücreleri toplamak ve 180 kez G beş dakika santrifüj, sonra supernatant atın.Dikkatle buz soğuk ACK lysing tampon 300 mikrolitre pelet resuspend ve bir dakika için buz hücreleri koymak. Daha sonra bir mililitre boyama tamponu ekleyerek lysis'i hemen devre dışı bırakın. Hücreleri 180 kez g.Resuspend hücre pelet, beyaz görünmesi gereken beş dakika santrifüj, boyama tampon bir mililitre içinde.Hücreleri 35 mikrometre naylon kafesle hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreuygulayın ve mononükleer hücreler elde edin. Soyun kokteyli ve feorofore konjuge antikorlar hazırlayarak başlayın, el yazması talimatlara göre. Antikorları buzda tutun ve ışıktan koruyun.Daha sonra, 180 kez G beş dakika için örnek santrifüj ve supernatant atın. Hücre peletine 400 mikrolitre silik kokteyl ve dört mikrolitre CD135 biyotinylated antikorlar ekleyin ve karışımı girdap. Sonra 30 dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, numuneyi üç mililitre boyama tamponu ekleyerek, 180 kez G'de beş dakika eğdirerek ve süpernatantı atarak yıkayın. Sonra antikor çözeltisi 400 mikrolitre ekleyin ve karışımı girdap. 30 dakika daha buzüzerinde kuluçkaya yatvere ve boyama tamponu ile yıkamayı tekrarlayın.TMRM boyama çözeltisini hazırlamak için trombopoietin ve kök hücre faktörü ile 2,2 mikrolitre TMRM stok çözeltisi ve 1,1 mikrolitre Verapamil, 1,1 mililitre serumsuz hematopoetik kültür ortamı ekleyin. TMRM boyama çözeltisinin bir mililitresinde kemik iliğini yeniden askıya alın, girdap hızlıca ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Akış sitometresini tıkamamak için numuneyi 35 mikrometre naylon kafesle bir hücre süzgeci kapağı kullanarak filtreleyin.Sonra DAPI bir mikrolitre ekleyin ve akış sitometri ile devam edin. Kemik iliği örneğini çalıştırın ve en az bir milyon etkinlik elde edin. Daha sonra cd135 Lin-negatif ve Lin-pozitif fraksiyonları tanımlamak için, pasifik mavisi için bir komplo canlı kemik iliği mononükleer hücreleri görüntüleyin.Çok güçlü ataveya MPP fraksiyonu tanımlamak için APC/Cy7 karşı PE/Cy7 için Lin-negatif fraksiyonu çizin. Sonra hematopoetik kök hücre veya HSC fraksiyonu tanımlamak için, PerCP/Cy5.5 karşı APC için MPP fraksiyonu çizin. CD34 negatif HSC ve CD34 pozitif HSC fraksiyonlarına bölmek için FITC veya CD34 için HSC fraksiyonu görüntüleyin.Son olarak her popülasyonda TMRM yoğunluğu elde edin. TMRM boyamadoğru çalıştı emin olmak için, örnek için FCCP bir mikrolitre ekleyin, bir milimolar son konsantrasyon için, ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. O zaman bir milyon etkinlik kazan.FCCP ilavesi sonrasında TMRM yoğunluğu önemli ölçüde artırılmalıdır. Bu protokol, TMRM boyası ile çeşitli hücre popülasyonlarında mitokondriyal membran potansiyelini ölçmek için başarıyla kullanılmıştır. PBS ve FBS'nin kültür ortamıiçinde bulunmasının TMRM sinyal yoğunluğunu etkilediği gösterilmiştir.Bu nedenle serumsuz genleşme ortamda TMRM boyama yapmak önemlidir. Hematopoetik kök hücreler, TMRM boyasını ekstrüzyon yapan ksenobiyotik efflux pompaların yüksek aktivite düzeylerini ifade eder. Yani TMRM profilleri de Verapamil veya Siklosporin H, pompaları blok varlığında değişir.TMRM boyama doğruluğunu doğrulamak için, FCCP mitokondri depolarize ve TMRM yoğunluğunu azaltmak olabilir. Bu protokol, TMRE veya JC-1 dahil olmak üzere farklı bir mitokondriyal membran potansiyel boya ile HSC eğitimi için kolayca uyarlanabilir. Yanı sıra MitoTracker veya MitoSOX gibi diğer mitokondriyal boyalar.Kemik iliği popülasyonu arasında efflux pompaların farklı aktivitesi nden kaynaklanan kritik konular açıktı. Yani bu protokol, önceki bulgular arasındaki tutarsızlığı azaltmayı amaçlamaktadır.

improving-accuracy-flow-cytometric-assessment-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, hipoksi/reoxygenation veya koruyucu bir ajan olmadan maruz sonra hücreleri mitokondrial membran potansiyelini değerlendirmek için Dizayn Merkezi-1 boya kullanan bir iletişim kuralı mevcut.

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Bu teknik, floresan tabanlı canlı görüntüleme kullanarak HeLa hücrelerindeki mitokondriyal membran potansiyelini ve süperoksit seviyelerini görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek için etkili bir iş akışını tanımlar.

HeLa hücrelerinde canlı görüntüleme kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ve süperoksit seviyelerinin floresan bazlı ölçümü

Bağışıklık hücrelerinde fizyolojik olarak ilgili substrat konsantrasyonları altında mitokondriyal biyoenerjetik çalışma yöntemleri sınırlıdır. İnsan T hücrelerinde, monositlerde ve periferik mononükleer hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin enerji talebine tepkisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan bağışıklık hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri

Keşfedin, akış sitometrisi ile hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin doğru ölçümü için Verapamil kullanımını. Bu yöntem, kök hücre biyolojisinde güvenilir sonuçlar sağlar.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

Daha fazla video keşfet