İnsan Yumurtası Olgunluk Değerlendirmesi ve Klinik Uygulaması

Polarize ışık mikroskobu kullanarak insan yumurtası olgunluğunun non-invaziv değerlendirilmesi için klinik protokolün ana hatlarını salıyoruz.

Klinik uygulamada, bir kutup vücut gösteren her yumurta döllenme için hazır olduğunu varsaymak için alışılmış. İnsan yumurtası olgunlaşmasının yaşam görüntülemesi, kutupsal bir cismin bipolar metafaz II mili bir araya gelmeden çok önce görünür hale geldiğini ve zamansız sperm enjeksiyonu riskini oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Polarize ışık mikroskopisi insan yumurtalarında meyotik milin non-invaziv bir görselleştirme sağlar, ve intracytoplazmamik sperm enjeksiyonu öncesi yumurta olgunluğunu değerlendirmek için IFV güvenle kullanılabilir.

ICSI zamanlaması optimize özellikle ivf döngüleri kötü prognoz önemlidir, döllenme için kullanılabilir oosit sayısı düşük. Bu klinik prosedür standart ivf tedavisine bir eklenti tekniğidir ve iyi laboratuvar uygulamalarına uygun olarak deneyimli personel tarafından önceden oluşturulmalıdır. 35 ila 36 saat sonra insan koryonik gonadotropin enjeksiyonu, karbondioksit bağımsız işleme orta alınan kümülüs-oosit kompleksleri toplamak.

37 santigrat derecede karbondioksitten bağımsız bir kuvözde yumurtaları 10 ila 15 dakika dengeleyin. Yumurtaları yüksek hyaluronidase çözeltisine maruz bırakın, işleme ortamında seyreltin. 30 saniye sonra, mekanik kümülüs-korona hücrelerini kaldırmak için 200 mikrolitrelik pipet kullanın.

Çekirdek ve ilk kutup cismi varlığı veya yokluğuna göre denuded oositlerin sayısını ve gelişimsel durumunu değerlendirin. Mineral yağ ile kaplı karbondioksit-bağımsız kültür ortamının bireysel damlacıklarına mikrop vezikül evresi ve metafaz I ii evre oositleri yerleştirin. Daha sonra, 37 santigrat derece, % 5 karbondioksit ve% 6 oksijen nem ile 3 ila 4 saat için oositler yerleştirin.

Embriyo kültürü için yetiştirme plakaları hazırlamak için, uygun büyüklükteki bir kültür plakasının bireysel kuyularına uygun hacimli önceden dengelenmiş kültür ortamı ekleyin. Damlacıkları eşit lenmiş mineral yağile kaplayın, plakayı benzersiz bir tanımlayıcıyla etiketleyin ve karbondioksite bağımlı bir unbatora en az 20 dakika yerleştirin. ICSI çanak hazırlamak için, her kutup vücut görüntüleme yumurta için önceden ısıtılmış işleme orta 5 mikrolitre damlacıkları ekleyin ve temiz bir plastik çanak iğne yıkama için ekstra damlacık.

İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu öncesinde sperm immobilizasyonu için PVP çözeltisi ek bir damlacık ekleyin ve önceden ısıtılmış mineral yağ ile damlacıkları bindirme. Yemeği etiketlediğinden emin olun. Daha sonra, en az 20 dakika boyunca karbondioksitbağımsız bir kuvözde sperm enjeksiyon çanak yerleştirin.

Plaka dengelenirken, cam tabanlı bir kültür yemeğine her kutup gövdesini gösteren yumurta için önceden ısıtılmış işleme ortamından 5 mikrolitre damlacık ekleyin. Önceden ısıtılmış mineral yağ ile tüm damlacıkları bindirme. Yemeği etiketlediğinden emin olun.

Daha sonra plakayı karbondioksitten bağımsız bir kuvöze en az 20 dakika yerleştirin. Plakalar dengelenirken, ters mikroskoptaki ısıtmalı sahneyi açın ve steril tutma ve sperm enjeksiyon iğnesini mikro enjeksiyon tutuculara sığdırın. İğneleri odak noktası haline getirin ve kondansatörün parlak alan konumunda olduğuna dikkat ederek uygun hedefi seçin.

Yeşil girişim filtresini takın ve sıvı kristal analiz kaydırıcısını çalışma konumuna ayarlayın. Deklanşörü yaklaşık %50'ye ayarlayın ve arka plan gürültüsünü azaltmak için dairesel polarize yi ayarlayın. Polarize ışık mikroskobu incelemesi için bilgisayarı kurmak için görüntüleme yazılımını başlatın ve Video menüsünde Video, Video Kaynağı ve polarAIDE'yi seçin.

Ardından, Video sayfasına giderek canlı videoya geçin ve iğ ve zona analizini etkinleştirmek için simgeyi seçin. Her yumurtanın olgunluğunu belirlemek için, tüm yumurtaları hazırlanan cam alt çanak üzerine tek tek damlacıklara aktarın ve ortaya çıkarılan kabı hazırlanan ters mikroskobun altına yerleştirin. İlk yumurtayı odak noktası haline getirin ve bilgisayar la işlenir ve bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak görüntülendiğinden, algılanan oosit birefringence görüntüsünü gözlemleyin.

Polar vücut 12:00 pozisyonda ve kutup vücut odaklanmak böylece oosit açmak için tutma ve sperm enjeksiyon iğneleri kullanın. Mil kuşu PB çevresinde ilk bakışta açıkça görülemiyorsa, zona pellucida hafifçe dokunun ve yavaşça dizi mil lifleri ile polarize ışık hizalanmasını sağlamak için her eksen etrafında yumurta açın. Mil pozitif yumurtaların tümünü belirledikten sonra, yumurtaları hazırlanan ICSI kabıiçindeki tek tek damlacıklara aktarın ve yumurtaları standart protokollere göre intrasitoplazmik sperm enjeksiyonuna tabi tuğralayın.

Yumurtalar tespit edilebilir metafaz II mili sinyali göstermezse, polarize ışık mikroskop kabını karbondioksitten bağımsız kuvöze 2 ila 3 saat yerleştirin. Gösterildiği gibi polarize ışık mikroskobu incelemesini yeniden önceden bilgilendirmeden önce, enjeksiyondan sonra, blastosist aşamasına ulaşına kadar yumurtaları kültürleri için hazırlanan embriyo yetiştirme plakalarına aktarın. İnsan yumurtasının tüm mikromanipülasyonunun 37 derecede, optimum kültür ortamı pH'sında bir kontrol ortamında gerçekleştirildiğinden emin olun.

Mil görüntüleme, metafaz II evresinde yakalanan tam olgun yumurtaların önemli bir maturational geçiş geçirenlerden ayrımcılığa maruz kalımını sağlar. Gelişimsel olarak gecikmiş oositlerde kutup cisimlerini in vitro olarak ekstrüzyon, metafaz II iğ sinyalinin yokluğu mutlaka hücresel bir rahatsızlığı yansıtmayabilir, ancak yumurtanın metafaz IFaz II aşamasına doğru ilerlemesini gösterebilir. Meiyotik milin varlığı yumurta gelişimsel yeterliliğin olumlu bir göstergesidir.

ICSI'nin ertelenmesi, gelişimsel olarak gecikmiş yumurtaların olgunlaşma sürecini tamamlamak ve enjeksiyondan önce metafaz II mili birleştirmek için ekstra zaman sağlar. Bu yaklaşım kullanılarak, rutin olarak atılan olgunlaşmamış oositler bile klinik olarak kullanılabilir ve başarılı gebeliklere yol açabilir.