Name: Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Keşfedin, kemik iliği transplantasyonu sonrası dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığındaki rolünü. Bu yöntem, makrofaj ve nötrofil gibi diğer immün hücre popülasyonlarını incelemek için uyarlanabilir ve transplantasyon sonrası immün yanıtları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma University of Central Florida College of Medicine start-up hibe (HN), Pittsburgh Üniversitesi Tıp Merkezi Hillman Kanser Merkezi start-up hibe (HL), Amerika Birleşik Devletleri NIH Grant #1P20CA210300-01 ve Vietnam Sağlık Bakanlığı Hibe #4694/QD-BYT (PTH için) tarafından desteklenir. Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nden Dr. Xue-zhong Yu'ya çalışma için malzeme sağladığı için teşekkür ederiz.

Deneysel prosedürler, Central Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. GVHD İndüksiyon
NOT: Allojeneik kemik iliği (BM) hücre nakli (adım 1.2) ışınlama dan sonra 24 saat içinde yapılır. Aşağıda açıklanan tüm işlemler steril bir ortamda gerçekleştirilir. Bir doku kültürü başlık prosedürü gerçekleştirin ve filtrelenmiş reaktifler kullanın.
<ol><li>0. Gün: Alıcı fareleri hazırlayın.<ol>
<li>Balb/c arka planda (CD45.2+ H2kd+), alıcı olarak 10−12 haftalık dişi yabani fareler kullanın.</li>
		<li>TBI'den önce alıcıları tarttırın ve kulak etiketi. Daha sonra, ışınlama odasına en fazla 11 fare yerleştirin ve ışınlayıcıda saklayın. 10−15 dk boyunca 700 cGy tek bir dozda ışın.</li>
		<li>Radyasyona maruz kalanlardaki hayvanları kafeslere geri döndürün ve nakilden önce patojensiz tesislerde barındırın. NOT: Alıcıların en az vücut ağırlığı yaklaşık 20 g olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>1. Gün: Donör farelerden T-hücre tükenmiş kemik iliği (TCD-BM) hazırlayın.<ol>
<li>CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 fareleri CO2 boğulma ile ötenazi edin ve bilinçsiz olana kadar 2−3 dk bekleyin. Gerekirse ikincil ötenazi olarak servikal çıkığı gerçekleştirin.</li>
		<li>Her fareyi temiz bir çalışma tahtasına koyun. % 70 isopropanol ile kürk ve cilt sanitize.</li>
		<li>Forseps ve makas kullanarak her iki bacaktan tibia ve femur toplayın. 50 mL konik tüplerde %1 FCS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 2 mM L-glutamin (%1 RPMI) içeren buz gibi RPMI'ye koyun. Femur ve tibia kemiklerini, forceps ve makas kullanarak tüm kas dokularını temizleyerek iyice temizleyin. 50 mL konik tüplerden %1 RPMI içeren 92 mm çapındaki Petri kabına femur ve tibia aktarın.</li>
		<li>Makas kullanarak, femur veya tibia uçlarını kesti. 50 mL'lik bir tüpü %1 RPMI 1640 orta ile 25 mL doldurun. Bunu, 26 G iğneye bağlı ve %1 RPMI'lik 3 mL'lik bir şırınga yı doldurmak için kullanın. Bu şırıngayı kemiğe takın ve daldırıcıyı iterek kemik iliğini (BM) boşluktan %1 RPMI (~3 mL/kemik) ile toplama tüpüne boşaltın.</li>
		<li>Diğer donör farelerden kalan tüm kaval kemiği ve uyluk kemiği için adım 1.2.4'ü tekrarlayın. Tüm toplama tüplerini buzda tut.</li>
		<li>Kemik iliği parçalarını 75 μm mesh hücreli süzgeçten geçirerek tek hücreli süspansiyonu yapın. Tek hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpte toplayın.</li>
		<li>4 °C'de 5 dk için 800 x g santrifüj tüpler. Aspire ve supernatant atın. PBS tamponundaki peletin %0.5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren 20 x 106 hücre/mL'de yeniden askıya alınması. Saflık boyama için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.</li>
		<li>0,05 μg/106 hücre14 ve 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yat.a 80 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 00 00 00 00 0 25 mL buz gibi PBS ile bir kez yıkayın. 20 x 106/mL'de %0.5 BSA/10% genç tavşan komplemanı/%2 DNase(steril H2O'da 10.000 U/mL) yeniden askıya alın. 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatın ve eskisi gibi 2x yıkayın. NOT: T-hücreleri Thy1'e özgü bir mAb kullanılarak tükenir, tüm T-hücreleri tarafından ifade edilen bir protein, ancak diğer lökositler tarafından ifade edilmez.</li>
		<li>%0.5 BSA içeren PBS tamponunun 20 mL'lik hücrelerini yeniden askıya alın. Kemik iliği hücrelerini hemositometre kullanarak %1 asetik asit tesviye edin. Hücre saflaştırma sonra akış sitometri tarafından saflık kontrolü için 2 x 106 hücreleri bir aliquot tutun. NOT: Bir donör fare normalde yaklaşık 25 x 106 TCD-BM üretir.</li>
		<li>Başarılı bir T hücresi tükenmesini onaylamak için akış sitometrisini kullanın. 1 x 106 hücreleri, 1.2.7 (T-hücre tükenmesinden önce) ve 1.2.9 (T-hücre tükenmesinden sonra T-BM) aşağıdaki antikorlarla lekeler: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve α-CD8α (53-6.7).</li>
	</ol></li>
	<li>1. Gün: Donör farelerden T-hücreleri hazırlayın<ol>
<li>CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 yabani tip (WT) fareleri T hücreleri için donör olarak kullanın.</li>
		<li>1.2.1'de açıklandığı gibi C57BL/6 farelerini karbondioksit (CO2)boğulması ile ötenazi.</li>
		<li>Farenin kürkünü ve cildini %70 etanol ile iyice temizleyin. Dalakları ve lenf düğümlerini özelleştirin ve şırınga pistonu ve 40 m örgü süzgeçkullanarak splenositlerin tek hücreli süspansiyonuna ayırın. Tüm splenositleri toplamak için süzgeci ve şırınga pistonu %1 RPMI (%1 FBS içeren RPMI media) ile yıkayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna 800 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. 5 mL ACK lysing tampon (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) ekinden atılmalıdır. Hücre süspansiyonuna oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: ACK lysis tampon kırmızı kan hücrelerinin lysing için kullanılır.</li>
		<li>Lysis durdurmak için% 1 RPMI 5 mL ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.</li>
		<li>Buz gibi manyetik aktive hücre sıralama (MACS) tamponu (%0.5 BSA, PBS'de 2 mM EDTA, pH 7.2) hazırlayın. Kullanmadan önce arabelleği degas edin. 5 mL MACS arabelleğindeki hücre peletlerini yeniden askıya alın.</li>
		<li>Splenositleri sayın ve hemositometre ve %1 trippan mavisi kullanarak canlı ve ölü hücreleri kontrol edin. Akış sitometri analizi ile saflaştırma verimini değerlendirmek için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin.</li>
		<li>MACS tamponunda 200 x 106/mLkonsantrasyonda splenositleri yeniden askıya alın. 0.03 μL biotin anti-mouse-Ter-119, 0.03 μL biotin anti-mouse-CD11b, 0.03 μL biotin anti-mouse-CD45R ve 0.03 μL biotin anti-mouse-DX5 106 hücre başına ekleyin. 4 °C'de 15 dakika kuluçka. NOT: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R ve biotin anti-mouse-DX5 sırasıyla eritrosit, granülositler, B-hücreleri ve NK hücreleri ile reaksiyona kullanıldı. Bu nedenle, bu hücre alt kümeleri aşağıdaki adım15tükenmiş.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi MACS tamponu ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.</li>
		<li>MACS arabelleğindeki hücre peletlerini 100 x 106/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Splenosit süspansiyonuna anti-biyotin mikroboncukları (0.22 μL/106 hücre) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna 10 mL buz gibi MACS tamponu yla bir kez yıkayın. 4 °C'de 5 dk 800 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı atın.</li>
		<li>Manyetik alana manyetik bir ayırma sütunu koyun. 3 mL MACS arabelleği ile sütunu durulayın. Hücre süspansiyonu sütunüzerine bırakın. Yeni bir 15 mL konik tüp içinde, sınırsız, zenginleştirilmiş T-hücrelerinden oluşan akış-through toplamak. MS sütununa 3 mL buz gibi MACS arabelleği ile yıkayın. NOT: Yıkama adımlarını gerçekleştirmeden önce sütunun boş olduğundan emin olun.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna 800 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin. 5 mL MACS arabelleğindeki hücre peletini yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücreleri hemositometre kullanarak %1 trippan mavisi olarak sayın. Akış sitometrisi tarafından saflık kontrolü için 2 x 106 hücreden oluşan bir aliquot kaydedin. NOT: Bu yöntemle izole edilen dalak T-hücrelerinin ortalama verimi fare başına ~20−25 x 106 hücredir.</li>
		<li>Akış sitometrisi ile T-hücre zenginleştirme verimini onaylayın. 1 x 10 6 hücreleri, 1.3.7 (T-hücre tükenmesinden önce) ve 1.3.13 (T-hücre tükenmesinden sonra TCD-BM) basamaklarından korunan 1 x 106 hücreleri aşağıdaki antikorlarla lekeler: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ve-α-CD8α (53-6.7).</li>
	</ol></li>
	<li>1. Gün: Işınlanmış farelere donör T-hücreleri ve TCD-BM enjekte edin.<ol>
<li>TCD-BM ve T-hücrelerini 2x PBS ile yıkayın (4 °C'de 5 dk için 800 x g). Enjeksiyon için buz gibi PBS hücreleri resuspend. Hücre konsantrasyonu TCD BM için 20 x 106/mL ve T hücreleri için 4 x 106/mLolarak ayarlayın.</li>
		<li>Çift taraflı kuyruk damarlarının görünürlüğünü artırmak için bir ısıtma lambası kullanarak hayvan ısıtın. Gerekirse fareyi bir dizginleyiciye yerleştirin.</li>
		<li>% 70 isopropanol kullanarak kuyruk yüzeyini temizleyin. TCD-BM (5 x 106 hücre/fare) t-hücreleri (0,75 x 106 hücre/fare) ile enjekte edin. Şırınganın içine hava sokmamaya dikkat edin.</li>
		<li>İğneyi çıkarın ve kanamayı durdurmak için doğrudan enjeksiyon bölgesine 5−10 s antiseptik bir bez uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>GVHD'yi 2−80 gün olarak değerlendirin.<ol>
<li>Hayvan hayatta kalma takip edin. Cook ve ark.16 tarafından daha önce kurulan skorlama sisteminden uyarlanan GVHD'nin klinik bulgularını ve alıcı farelerin vücut ağırlığını haftada 2 x izleyin. Vücut kilo kaybıhesaplamak için TBI önce belirlenen vücut ağırlığı kullanın.</li>
		<li>Her fareyi ayrı ayrı tartın. Puan aşağıdaki gibi kilo kaybı: grade 0 = az% 10; sınıf 1 = %10−%20; grade 2 = %20'den fazla.</li>
		<li>Alıcıların duruş işareti puan: grade 0 = hiçbir önsezi; grade 0.5 = hafif önsezi ama yürürken düzer; sınıf 1 = hayvan yürürken kambur kalır; grade 1.5 = hayvan düzleştirmek değil; grade 2.0 = arka ayak larda hayvan standı.</li>
		<li>Alıcıların hareketlilik işareti puan: grade 0 = çok aktif; grade 0.5 = naif farelerden daha yavaş; grade 1.0 = sadece dürttüğünde hareket eder; grade 1.5 = dürttüğünde hafif hareket eder; grade 2.0 = dürttüğünde hareket etmez.</li>
		<li>Alıcıların cilt puan: grade 0 = hiçbir aşınma, lezyonlar, ya da ölçekleme; grade 0.5 = belirli bir alanda kızarıklık; grade 1 = bir alanda aşınma veya iki alanda hafif aşınma; grade 1.5 = iki veya daha fazla alanda ciddi aşınmalar; grade 2.0 = şiddetli sıyrıklar, çatlama cilt, kurutulmuş kan.</li>
		<li>Alıcıların kürk puan: grade 0 = hiçbir anormal işaretler; grade 0.5 = boyun göbek veya ense tarafında ridging, grade 1.0 = karnının veya boyun tarafı nın veya yan sının; grade 1.5 = unkempt mat ve fırfırlı kürk; grade 2.0 = göbek ve sırt üzerinde kötü mat kürk.</li>
		<li>Puan alıcıların ishal: grade 0 = hiçbir ishal; grade 0.5 = hafif ve yumuşak dışkı; grade 1.0 = hafif (sarı dışkı); grade 1.5 = orta (biraz kan ile sarı dışkı); grade 2 = şiddetli (açık sarı ve kanlı dışkı, "kurutulmuş kek dışkı" anal alanda görünür).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kotransplantasyon Modeli
<ol><li>Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler (BM-DCs) oluşturun.<ol>
<li>1.2.3−1.2.4 adımlarında açıklandığı gibi B6 arka planüzerindeki WT veya faktör B (fB)-/- farelerin uyluk ve tiyyanlarından kemik iliği izole edin. Hücreleri 800 x g'de 5 dk döndürün.</li>
		<li>Kırmızı kan hücresi lisisi için 5 mL'lik ACK lysing tamponundaki peleti yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 5 dk için 800 x g'de lisi ve santrifüjü durdurmak için hücre süspansiyonuna %1 RPMI'nin 10 mL'sini ekleyin. Supernatant atın.</li>
		<li>Hücre peletlerini 10 mL kültür medyasında (RPMI 1460 %10 FBS içeren, 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2 mM l-glutamin ve 50 mM β-mercaptoetanol) yeniden askıya alın ve 2 x 106 hücre/mL'nin son konsantrasyonuna uyacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna 20 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyin. Kültür 100 x 15 mm Petri yemekleri 37 °C 5% CO2 6 gün boyunca kemik iliği hücreleri.</li>
		<li>Devam eden kültür ortamının yarısını (yaklaşık 5 mL) 3.</li>
		<li>Kültür ortamını 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın. Kemik iliği kültür yemeklerinden yaklaşık 5 mL medya toplayın. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın. 40 ng/mL GM-CSF içeren 5 mL kültür medyasında hücre peletini yeniden askıya alın.</li>
		<li>BM-DC'leri olgunlaştırmak için kültürün 6.6</li>
		<li>Olgunlaşmış BM-DC'leri toplayın: Petri yemeklerinden CD'leri yumuşak bir şekilde kazımak için hücre kaldırıcıları kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını 50 mL konik tüplerde toplayın. Santrifüj 800 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant atın. Hücre peletlerini 50 mL buz gibi PBS ile 3 x yıkayın. Akış sitometrisi ile immünolojik fenotip analizi için yaklaşık 2 x 106 BM-DC kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>BMT (DC-cotransplanting BmT) dendritik hücre ko-transplantasyon gerçekleştirin. NOT: T-hücreleri ve BM hücreleri için donör olarak FVB (H2kq)fareler kullanın. 1.100 cGy (2 doz, 3 saat aralık) bir dozda B6 Ly5.1 alıcı fareler ışın. 1.1. adımdaki ayrıntılara bakın.<ol>
<li>BM'yi FVB donör farelerin uyluk kemiğinden ve tibiaslarından ayırın. 1.2.3−1.2.10 adımlarında ayrıntılara bakın. NOT: Bu modelde TCD-BM yerine toplam izole kemik iliği kullanın.</li>
		<li>FVB donör farelerin dalak ve lenf düğümlerinden T-hücrelerini arındırın. 1.3.1-1.3.13 adımlarında ayrıntılara bakın.</li>
		<li>Deney kursunun 0. gününde BM-D'lerle (2 x 106/fare) BM(5 x 106/fare), T-hücrelerini (0,5 x 106/fare) enjekte edin.</li>
		<li>Transplantasyondan sonraki 3.<ol>
<li>Alıcıların gözlerinden kan toplayın.</li>
			<li>CD45.1/Ly5.1 B6 farelerini %3 isofluran emdirerek anestezi edin. Bir parmak sıkışmayanıt eksikliği ile anestezi derinliği ni kontrol edin.</li>
			<li>Burun düzleminden 30−45° açıyla caudally yönlendirilen gözün medial kanthusuna steril cam pipet tüpü yerleştirin. Tüpü hafifçe döndürürken basınç uygulayın.</li>
			<li>Kanı 10 μL heparin içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine bırakın. 5 mL cam akış tüplerine 50 μL kan aktarın.</li>
			<li>2 mL ACK lysing arabelleği ekleyin. 45 dk. 2 mL FACS boyama tamponu ekleyin. Santrifüj 800 x g'de 5 dk 4 °C'de. Supernatant atın.</li>
			<li>Uygun akış boyama antikorları içeren 200 μL FACS tamponu içeren hücre peletlerini yeniden askıya alın (canlı/ölüm sarısı, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c ve α-MHCII). Karanlıkta 4 °C'de 15 dakika kuluçka. 1 mL FACS arabellek ile 2x yıkayın. 200 μL FACS tampon hücre peletleri resuspend ve akış sitometri ile analiz yapmak.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. BMT GVHD /GVL Modelleri
<ol><li>GVHD/GVL indüksiyonu gerçekleştirin.<ol>
<li>Kültür luciferase RPMI kültür medyada A20 B hücreli lenfoma transduced.</li>
		<li>700 cGy (tek doz) de BALB / c arka plan WT veya Ly5.1 alıcı ışın. 1.1. adımdaki ayrıntılara bakın.</li>
		<li>TCD-BM'yi B6'nın uyluk ve tiyyanlarından ayırın. Ly5.1 donör fareler. 1.2.1−1.2.10 adımlarında ayrıntılara bakın.</li>
		<li>C57BL/6 donör farelerin dalak ve lenf düğümlerinden T-hücrelerini arındırın. 1.3.1−1.3.15 adımlarında ayrıntılara bakın.</li>
		<li>A20 lenfoma 2x'i 25 mL PBS ile yıkayın. Hücre peletlerini 10 mL buz gibi PBS'de yeniden askıya alın. Bir hücre süspansiyon aliquot alın (10 μL) ve% 1 trypan mavi ve hemositometre kullanarak hücreleri saymak. Hücre konsantrasyonu 20.000 hücre/mL olarak ayarlayın.</li>
		<li>TCD-BM (5 x 106/fare) T-hücreleri (0,75 x 106/fare) ve A20 lenfoma (5.000 hücre/fare) ile enjekte edin.</li>
		<li>Deneysel kurs sırasında alıcının sağkalımını, GVHD klinik bulgularını ve vücut kilo kaybını takip edin. 1.5 adımdaki ayrıntılara bakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biyolüminesans görüntüleme yapın.<ol>
<li>Alıcıya 4 mg D-luciferin enjekte ederek, nakledilen alıcıdaki tümör büyümesini izleyin. Luciferin luciferase ile reaksiyona emin olmak için 5 dakika kuluçka.</li>
		<li>Bir biyolüminesans görüntüleyici odasında% 3 izofluran kullanarak fare anestezi ve alan D ve 1 dk pozlama süresi 5 dakika için alıcılar görüntü.</li>
		<li>Görüntü analiz yazılımLarını kullanarak verileri analiz edin. En iyi sonuçlar için sözde renkli görüntülerin ölçeğini değiştirin. NOT: Tüm resimler deneyler arasında aynı ölçekte olmalıdır.</li>
		<li>İlgi bölgelerini belirlemek ve her ilgi bölgesinden yayılan akısı (fotonlar/ler) hesaplayarak sinyal yoğunluğunu ölçmek için görüntü analiz yazılımını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shlomchik, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).</li>
<li>Appelbaum, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+cell+transplantation+as+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy.</a> Nature. 411, 385-389 (2001).</li>
<li>Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+graft-versus-host+disease+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in graft-versus-host disease biology and therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).</li>
<li>Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2010+report+from+the+Center+for+International+Blood+and+Marrow+Transplant+Research+%28CIBMTR%29%3A+current+uses+and+outcomes+of+hematopoietic+cell+transplants+for+blood+and+bone+marrow+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders.</a> Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).</li>
<li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+graft-versus-host+disease%3A+advances+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+%26+Mechanism%22%5BJournal%5D)">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).</li>
<li>Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Preclinical+Development+of+Allogeneic+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.</a> ILAR Journal. , ily006(2018).</li>
<li>Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+subsets+in+lethal+graft-versus-host+disease+%28GVHD%29+directed+to+class+I+versus+class+II+H-2+differences.+II.+Protective+effects+of+L3T4%2B+cells+in+anti-class+II+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD.</a> Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).</li>
<li>Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosuppressor+and+allohelper+T+cells+in+acute+and+chronic+graft-vs-host+disease.+I.+Alloreactive+suppressor+cells+rather+than+killer+T+cells+appear+to+be+the+decisive+effector+cells+in+lethal+graft-vs.-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).</li>
<li>Lu, Y., Waller, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichotomous+role+of+interferon-gamma+in+allogeneic+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).</li>
<li>Abdollahi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+platelet-derived+growth+factor+signaling+attenuates+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+regulation+of+graft-versus-host+disease+and+graft-versus-leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia.</a> Blood. 119, 5088-5103 (2012).</li>
<li>Ullmann, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posaconazole+or+fluconazole+for+prophylaxis+in+severe+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease.</a> New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).</li>
<li>Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+specific+cell+populations+by+complement+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Depletion of specific cell populations by complement depletion.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Nguyen, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+alloantigen-activated+T+cells+after+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li>
<li>Nguyen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C3a+and+C5a+receptors+promote+GVHD+by+suppressing+mitophagy+in+recipient+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy.</a> Science. 342, 1417(2013).</li>
<li>Negrin, R. S., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+using+bioluminescence%3A+a+tool+for+probing+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).</li>
<li>Roy, D. C., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+vs+minor+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Major vs minor histocompatibility antigens.</a> Blood. 129, 664-666 (2017).</li>
<li>Gendelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+conditioning+is+a+primary+determinant+in+modulating+the+effect+of+IL-7+on+murine+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease.</a> Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HY-Specific+Induced+Regulatory+T+Cells+Display+High+Specificity+and+Efficacy+in+the+Prevention+of+Acute+Graft-versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease.</a> Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).</li>
<li>Zeiser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+CD30+signaling+is+critical+for+adoptively+transferred+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+prevention+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 109, 2225-2233 (2007).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

Belirli bir kişiye uygun kök hücre kullanımı gelişmiş ve dirençli kanserlerin tedavisinde etkili bir yaklaşımdır18. Küçük molekül ilaç, ancak, uzun kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin birincil odak kalmıştır. Öte yandan, hücresel tedavide donör ve konak arasındaki etkileşimlerin çok sayıda kararlı tedavi sonuçlarını etkileyebilir, BMT sonra GVHD gelişimi gibi1.
BmT'nin MHC'li büyük fare modelleri GVHD'nin biyolojisini anlamada ve tedavide ilaçl...

Allojeneik hematopoetik kök hücre nakli (KT) hematolojik malignitelerin tedavisinde etkili bir tedavidir1,2 greft-versus-lösemi (GVL) etkisi ile3. Ancak, donör lenfositler her zaman alıcı dokulara karşı istenmeyen immünolojik ataklar monte, greft-versus-host hastalığı olarak adlandırılan bir süreç (GVHD)4.
GVHD Murine modelleri GVHD ve GVLyanıtı5 biyolojisini incelemek için etkili bir araçtır. Fareler uygun maliyetli bir araştırma hayvan modelidir. Onlar küçük ve verimli moleküller ve biyolojik geliştirmeninerken aşamalarında ile dosed 6 . Onlar genetik olarak iyi tanımlanmış, çünkü fareler genetik manipülasyon çalışmaları için ideal araştırma hayvanlar, hangi biyolojik yollar ve mekanizmaları incelemek için idealdir6. C57BL/6 (H2b) ile BALB/c (H2d)ve FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7gibi birkaç fare majör histouyumluluk kompleksi (MHC) MHC uyumsuzmodelleri iyi kurulmuştur. Bunlar, bireysel hücre tiplerinin, genlerin ve GVHD'yi etkileyen faktörlerin rolünü belirlemek için özellikle değerli modellerdir. C57/BL/6 (H2b)ebeveyn donörlerinden MHC I (B6.C-H2bm1)ve/veya MHC II (B6.C-H2bm12)mutasyonu olan alıcılara yapılan transplantasyon, hem MHC sınıf I'de hem de sınıf II'de bir uyumsuzluk olduğunu ortaya koymuştur. Bu hem CD4+ ve CD8+ T-hücreleri hastalık gelişimi için gerekli olduğunu göstermektedir7,8. GVHD aynı zamanda 'pro-inflamatuar sitokin fırtınası' olarak bilinen inflamatuar bir kaskad yer almaktadır9. Murine modellerinde en sık kullanılan klima yöntemi x-ray veya 137Cs ile toplam vücut ışınlaması (TBI) yöntemidir. Bu alıcının kemik iliği ablasyon yol açar, böylece donör kök hücre engraftment izin ve greft reddini önlemek. Bu donör hücrelere yanıt olarak alıcı T-hücrelerinin çoğalmasını sınırlayarak yapılır. Ayrıca, genetik eşitsizlikler de küçük MHC-uyumsuzluk10bağlıdır hastalık indüksiyon, önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, miyeloablatif ışınlama dozu farklı fare suşlarında değişir (örneğin, BALB/c→C57BL/6).
Donör T-hücrelerinin konak antijen sunan hücreler (AAP' ler) tarafından aktivasyonu GVHD gelişimi için gereklidir. ADC'ler arasında, dendritik hücreler (DCs) en güçlü. Onlar kalıtsal onların üstün antijen alımı nedeniyle GVHD indükleme yeteneğine sahiptirler, T-hücre ko-uyarıcı moleküllerin ekspresyonu, ve patojenik subsets içine T-hücreleri polarize pro-inflamatuar sitokinler üretimi. Alıcı DCs transplantasyon sonrası T-hücre astar ve GVHD indüksiyon kolaylaştırmak için kritik11,12. Buna göre, DCs GVHD tedavisinde ilginç hedefler haline gelmiştir12.
TBI donör hücre engraftment geliştirmek için gereklidir. TBI etkisi nedeniyle alıcı CD'ler aktive edilir ve transplantasyondan sonra kısa bir süre hayattakalır12. Biyolüminesans veya floresan kullanımındaki büyük gelişmelere rağmen, GVHD'de alıcı DC'lerin rolünü incelemek için etkili bir model oluşturmak hala zordur.
Donör T-hücreleri GVL aktivitesi için itici güç olduğundan, t-hücre alloreactivity bastırmak için steroid gibi immünsupresif ilaçlar kullanarak tedavi stratejileri genellikle tümör nüks veyaenfeksiyonneden 13. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedeflemek GVL etkisini korurken ve enfeksiyondan kaçınırken GVHD tedavisinde alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.
Kısacası, mevcut çalışma, alıcı DC'lerde farklı sinyal türlerinin GVHD gelişimini ve BMT'den sonra GVL etkisini nasıl düzenlediğini anlamak için bir platform sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0 100ML</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482100</td><td>MACS tamponu</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>MACS tamponu</td></tr><tr><td>A20 B hücreli lenfoma</td><td>Central Florida Üniversitesi</td><td>Kurum içi</td><td>GVL deneyi</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl</td><td>Jackson Lab</td><td>30954</td><td>GVL deneyi</td></tr><tr><td>ACC1 fl/fl CD4cre</td><td>Central Florida Üniversitesi</td><td></td><td>GVL deneyi</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>Anti-İnsan / Fare CD45R (B220)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-85</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>Anti-fare B220 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10452-85</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Anti-fare CD11c- AF700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>117319</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD25 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0251-82</td><td>Akış boyama</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0041-86</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD4 eFluor & reg; 450 (Pasifik Mavisi & reg; değiştirme)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0042-82</td><td>Akış boyama</td></tr><tr><td>Anti-fare CD45.1 PE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-0900-83</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD8a APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0081-83</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Anti-fare H-2Kb PerCP-Fluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5958-82</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Anti-fare MHC Sınıf II-antikor APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5320-82</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>Anti-Fare TER-119 Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5921-85</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>Anti-Thy1.2</td><td>Bio Excel</td><td>BE0066</td><td>BM nesil</td></tr><tr><td>B6 fB-/- fareler</td><td>Central Florida Üniversitesi</td><td>Kurum</td><td>İçi Alıcılar</td></tr><tr><td>B6. Ly5.1 (CD45.1+) fareler</td><td>Charles River</td><td>564</td><td>Donörler</td></tr><tr><td>BALB/c fareler</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>Nakil alıcıları</td></tr><tr><td>C57BL/6 fareler</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>Bağışçılar/Alıcılar</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0112-85</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>CD25-biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0251-82</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>CD45R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-0452-82</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>CD49b Monoklonal Antikor (DX5)-biyotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-5971-82</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 40 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>Hücre hazırlama</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 uM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Hücre hazırlama</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td>Canlı hayvan görüntüleme</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Atlanta Bilogicals R& D sistemi</td><td>D17051</td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Akış sitometri tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Akış sitometrisi analizi</td></tr><tr><td>FVB / NCrl</td><td>Charles River</td><td>207</td><td>Donors</td></tr><tr><td>Lipopolisakarit (LPS)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>DC olgun</td></tr><tr><td>LS sütunu</td><td>Mitenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Hücre hazırlığı</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 170R inkübatör</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170 R</td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Penisilin + streptomisinPenisilin / Streptomisin (10.000 ünite penisilin / 10.000 mg / ml strep)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>Medya</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>11875-093</td><td>Medya</td></tr><tr><td>TER119</td><td>Termo Balıkçı Bilimsel</td><td>13-5921-82</td><td>T hücresi zenginleştirme</td></tr><tr><td>Ksenojen IVIS-200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ksenojen IVIS-200</td><td>Canlı hayvan görüntüleme</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Biyolojik Işınlayıcı</td><td>Hassas X-RAY</td><td>X-RAD 320</td><td>Tüm Vücut Işınlaması</td></tr></tbody></table>

kemik İliği transplantasyon platformu greft-versus-host hastalığında dendritik hücrelerin rolünü araştırmak için

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allojeneik kemik iliği transplantasyonu (KNOT), tümörlerin kökünü kurutmak için greft-versus-lösemi (GVL) etkisine bağlı hematolojik maligniteler için etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, uygulama greft-versus-host hastalığı gelişimi ile sınırlıdır (GVHD), BMT önemli bir komplikasyon. GVHD donör greftlerinde T-hücreleri alıcı hücreler tarafından ifade alloantijen tanımak ve alıcı sağlıklı dokulara karşı istenmeyen immünolojik saldırılar monte uyarılır. Böylece, geleneksel tedaviler donör T-hücre alloreactivity bastırmak için tasarlanmıştır. Ancak, bu yaklaşımlar gvl etkisini önemli ölçüde bozar, böylece alıcının hayatta kalması iyileştirilmez. Terapötik yaklaşımların BMT, GVL ve GVHD üzerindeki etkilerini anlamak bu nedenle önemlidir. Donör T-hücrelerini uyarmak için antijen sunum ve sitokin salgılayıcı kapasiteleri nedeniyle, alıcı dendritik hücreler (DCs) GVHD indüksiyonönemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, alıcı DC'leri hedefleme gvhd kontrol etmek için potansiyel bir yaklaşım haline gelir. Bu çalışma, ev sahibi DC'lerin transplantasyon sonrası GVH ve GVL yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için yeni bir BMT platformunun açıklamasını sağlar. Ayrıca transplantasyon sonrası GVHD ve GVL biyolojisini incelemek için etkili bir BMT modeli sunulmaktadır.

Majör MHC uyumsuz B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir (Şekil 2). Cooke ve ark.16 tarafından daha önce tespit edilen altı GVHD klinik bulgunun tümü WT-B6 T-hücreleri ile nakledilen alıcılarda meydana gelmekte, ancak gvhd-negatif grubunu temsil eden BM ile nakledilen alıcılarda (adım 1.5) yer almıyordu. Bu modelde GVHD gelişiminde iki aşama vardır. İlk ...

Greft-versus-host hastalığı allojenik kemik iliği transplantasyonu sonrası önemli bir komplikasyondur. Dendritik hücreler greft-versus-host hastalığının patogenezinde kritik bir rol oynarlar. Bu makalede, dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığı nın gelişimindeki rolünü ve greft-versus-lösemi etkisinin araştırılması için yeni bir kemik iliği transplantasyon platformu açıklanmaktadır.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bu yeni kemik iliği nakli protokolü, transplantasyon sonrası konak dendritik hücrelerin greft-versus-host ve greft-versus-lösemi yanıtlarını nasıl düzenlediğini araştırmak için kullanılabilir. Ex vivo hücre rejenerasyonları bu protokolün sadece kültür durumunu değiştirerek makrofaj ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücre popülasyonunun rolünü test etmek için uyarlanmasına olanak sağlar. Prosedürü benimle birlikte gösteren laboratuvar müdürü Krystal Hossack ve lisans Sanjeev Gurshaney olacaktır.Donör T-hücre tükenen C57BL/6 kemik iliği hazırlığı için, ötanazi donör farelerin standart protokollerine göre femur ve tibia hasat ve 92 milimetre çapında Petri çanak içine transfer 1%RPMI orta. Makas kullanarak, her kemikten uçları çıkarın ve taze% 1 RPMI orta ile 26 gauge iğne ile donatılmış üç mililitreşlik şırınga doldurun. İğneyi bir kemiğin bir ucuna yerleştirin ve kemik iliğini boşluktan çıkarıp toplama hücresi süzgecinden çıkarmak için pistonun tuşuna basın.Tüm kemik iliği toplandığında, kemik iliği parçalarını 75 mikrometrelik bir kafes filtresinden geçirin ve tek hücreli süspansiyonu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüj ile tortulayın ve pbs'de mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye 20 çarpı 10 oranında geri alın ve %0.5 BSA ile tamamlayın. Daha sonra, dört santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için altı hücreye 10 kez thi1 antikor 0.05 mikrogram ekleyin.Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi pbs ile iki kez yıkayın ve mililitre başına yedi hücreye 2 kez 10%BSA ile takviye %10 genç tavşan komplemanı ve %2 NAAse steril suda 45 dakikalık kuluçka için 37 santigrat dereceye kadar yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, hücreleri yıkama başına 15 mililitre taze PBS ile iki kez yıkayın ve %0,5 BSA içeren 20 mililitre PBS'de peleti yeniden askıya alın. 40 mikrometre gözenek süzgecinde lenf düğümlerini ve dalağını birleştirin ve hücreleri serbest bırakmak için dokuları filtrelerden geçirmek için bir şırınga pistonu kullanın.Tüm hücreleri toplamak ve santrifüj ile hücreleri tortulamak için% 1 FBS ile desteklenen RPMI orta ile süzgeç ve piston yıkayın. Hücre peletine beş mililitre ACK lisis arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, orta beş mililitre ile reaksiyonu durdurmak 1% FBS ile takviye ve santrifüj ile beyaz kan hücreleri pelet.Saymak için beş mililitre MACS tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve hücreleri taze MACS tamponunda mililitre başına sekiz hücreye kadar iki katı 10'luk bir konsantrasyona seyreltin. Anti-eritrosit uygun konsantrasyonu ekleyin, anti-granülosit, anti-B hücresi, ve anti-NK-hücre tükenmesi antikorları bir kez 10 dört santigrat derecede 15 dakikalık kuluçka için altı hücreye. Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi MACS tamponuyla yıkayın ve taze MACS tamponundaki mililitre konsantrasyonu başına sekiz hücreye bir kere 10'da peleti yeniden askıya alın.Daha sonra, dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçka için karıştırma ile altı hücre ye 10 kez 10 başına Anti-Biotin MicroBeads 0.22 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi MACS tamponuyla yıkayın ve standart boncuk izolasyon protokollerine göre MACSxpress ayırıcısını kullanarak manyetik boncuk ayrıştırma ile bağlanmamış zenginleştirilmiş T-hücrelerini toplayın. Ayırma sonunda, t-hücrelerini santrifüj ile tortular ve peleti saymak için beş mililitre taze MACS tamponu içinde yeniden askıya alın.Kemik iliği kaynaklı dendritik hücreler oluşturmak için, kemik iliğini vahşi tip veya faktör B nakavt farelerin uyluk kemiğinden izole edin ve kırmızı kan hücrelerini ACK lysis tamponunun beş mililitresinde inceleyin, beş dakika sonra %1 FBS ile takviye edilen 10 mililitre RPMI ile reaksiyonu durdurun. Santrifüj ile tüm kan hücrelerini topladıktan sonra, mililitre konsantrasyonbaşına altıncı hücrelere iki kez 10 kültür orta 10 mililitre pelet resuspend ve 10 mililitre hücre üzerine tek tek 100 mililitre tohumlama önce hücrelere GM-CSF mililitre başına 20 nanogram ekleyin 100 tarafından 15 milimetre Petri yemekleri 37 santigrat derece ve 5% karbon dioksit altı gün boyunca. Altıncı günde, kemik iliği kaynaklı dendritik hücre kültürlerini plaka başına mililitre başına 25 mikrogram ile aktive edin.Kültürlü kemik iliği hücrelerinin en az %85'i dendritik hücrelere ayrılır. Manyetik boncuk zenginleştirme sonrası T-hücre saflığı %90'dır Majör MHC uyumsuz C57BL/6 BALB/c modeli transplantasyon sonrası GVHD gelişimine yakından karşılık gelmektedir. Şiddetin doruğu hücre transferinden yaklaşık 11 gün sonra ortaya çıkar ve ardından klinik skorlarda azalma ve 16.Alıcılar 30 ila 40 gün sonra GVHD'ye yenik düştüler. İlginçtir, faktör B nakavt dendritik hücreleri ile transplantasyon alıcı sağkalım ve GVHD klinik skorları artırır. Luciferase transdükse A20 B hücreli lenfoma canlı hayvanlarda tümör büyümesinin izlenmesini sağlar.Bu temsili deneyde, tek başına kemik iliği ve A20 alan tüm yabani balb/c alıcıları tümör nüksünden öldü. Kemik iliği kaynaklı ACC1-tükenmiş donör T-hücreleri ile nakledilen yabani tip BALB/c alıcıları GVHD'den öldü. Buna ek olarak, donör kemik iliği ve ACC1-tükenmiş T-hücreleri alınan hayvanlar hem GVHD ve tümör nüks öldü.Yeterli kemik iliği hücresi oluşturmak için, toplanan tibia ve femur kemikleri kemik iliği düzeltme önce kas dokusu tamamen serbest olmalıdır. Biyotinylaz anti-CD3 ve Anti-Biotin MikroBoncuklar ile kemik iliği hücrelerinin negatif saflaştırma da kemik iliği lenfosit tüketmek için yapılan başına olabilir.

bone-marrow-transplantation-platform-to-investigate-role-dendritic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu yazıda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinde alloantigen özel anerji ikna etmek için basit bir teknik anlatılmaktadır. Tekniği olmayan alloreactive donör hücreleri oluşturmak için klinik olarak uygulanabilir. İnfüzyon bu hücrelerin bağışıklık sulandırıldıktan geliştirmek ve allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu sonrası toksisite azaltabilir.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Bu video, allojenik hematopoietik kök hücreler ve GvHD'yi indükleyen splenik alloreaktif T lenfositleri kullanılarak letoral ışınlanmış bir alıcı farede bağırsak greftine karşı konak hastalığının (GvHD) indüksiyonunu göstermektedir. Bu protokol, hastalığın mekanizmasını anlamak ve yenilikçi terapötik seçenekler geliştirmek için ciddi bir akut intestinal GvHD modeli oluşturmaya yardımcı olur.

Allojenik Kemik İliği ve Splenik Hücre Nakli ile Fare Modellerinde Graft Versus Host Hastalığının İndüksiyonu

Burada, hoşgörü Ekiminde teşvik ve içinde in vitro ve in vivo değerlendirmek için bir protokol farklı hücre alt kümeleri alıcıdan gelen süpresif kapasitesi ve donör veya eksojen antijenleri doğru alıcının bağışıklık durumu mevcut.

Vitro ve In Vivo değerlendirme T, B ve Myeloid hücrelerin süpresif etkinlik ve nakli alıcılardan gelen Humoral yanıt

Burada, Allojeneik Hematopoietik kök hücre transplantasyonu açıklar ve distal kolonun tekrarlayan mini-endoskopik değerlendirme yerinde varlığı, özellikleri ve canlı içinde kolon iltihabı şiddeti için izin veren bir protokol mevcut bağırsak graft - versus - host hastalığı fareler.

İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Burada, bir xenogeneic Graft-versus-Host hastalığı (xenoGVHD) modelinde hastalığı teşvik etmek ve puan vermek için bir protokol sunuyoruz. xenoGVHD, insan T hücrelerinin bağışıklık bastırılmasını incelemek için bir in vivo modeli sağlar. Ayrıca, immunobastırma ölçmek için bir araç olarak dijital PCR ile dokularda insan T hücrelerinin nasıl algılanmasını açıklar.

Bir Xenogeneic Murine modelinde Graft-versus-Host hastalığının indüksiyon ve skorlama ve dijital PCR kullanarak fare dokularında ınsan T hücrelerinin ölçümü

Biz bir insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) - çeviriimmün-onkoloji araştırma için insanlaşmış ksenogreft fare modeli dayalı açıklar. Bu protokol, I-O terapi değerlendirmesi için benzer modellerin oluşturulması ve karakterizasyonu için genel bir kılavuz görevi görebılabilir.

Çevirisel İmmüno-onkoloji (I-O) Araştırma için İnsani Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Modeli

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Keşfedin, kemik iliği transplantasyonu sonrası dendritik hücrelerin greft-versus-host hastalığındaki rolünü. Bu yöntem, makrofaj ve nötrofil gibi diğer immün hücre popülasyonlarını incelemek için uyarlanabilir ve transplantasyon sonrası immün yanıtları anlamaya yardımcı olur.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Daha fazla video keşfet