Farelerde Hepatosit Nükleer Ploidi Tahmini için Yerinde Yüksek Throughput Yöntemi
19 Nisan 2020
Akış sitometrisi gerektirmeyen sabit/kriyokorunmuş doku örneklerinde hepatosit numarası ve nükleer ploidideki değişiklikleri ölçmek için sağlam, uygun maliyetli ve esnek bir yöntem saseril. Yaklaşımımız karaciğer hasarı ve hastalığın ilerlemesini izlemek için ideal karaciğer sitolojisi güçlü bir örnek çapında imza sağlar.
Bu yöntem, karaciğer gelişimi, rejenerasyon ve kronik hastalık çalışmaları için 2D doku bölümlerinden hepatosit nükleer DNA içeriği nin bir profil oluşturmak için kullanıcı sağlar. Bu otomatik yüksek iş elde etme yaklaşımı tüm 2D karaciğer dokusu bölümleriuygulanabilir, tüm basit dairesel hepatosit çekirdekleri için nükleer ploidi bir iç kalibre okuma sağlayan. Hepatosit nükleer ploidi değişiklikler yaşlanma ile ilişkilidir, kronik karaciğer hastalığı, ve kanser.
Bu teknik, sabit veya kriyokorunmuş karaciğer örneklerinde nükleer ploidin profilini çıkarmak için basit bir araç sağlar. Onlar doku ayrıştırma veya taze malzeme erişimi gerektirmez gibi yerinde ploidy profilleme yöntemleri karaciğer hastalığı ilerlemesini izlemek için araştırma ve klinik araçlar olarak önemli bir potansiyele sahiptir. Murine karaciğer doku örneği hasat sonra, optimal bir kesme sıcaklığı orta dolu kriyomold içine karaciğer lobule gömmek ve hızlı donma sağlamak için hemen kuru buz üzerine kalıp yerleştirin.
Dondurulmuş karaciğer lobule örneğinin dilimlerini elde etmek için, numuneyi altı mikrometre kalınlıkta keserek, her numunenin slayta yapışmasını sağlamak için beş saniye boyunca her numunenin üzerine etiketlenmiş poliamid kaplı bir slayt yerleştirin. Tüm dilimler toplandığında, immünetiketlemeden önce numunelerin oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca dengede olmasını bekleyin. Dengenin sonunda, pbs%4 paraformaldehit bir mililitre ile bir duman kaputiçinde doku bölümleri düzeltmek oda sıcaklığında 10 dakika.
Fiksasyonun sonunda, pbs üç üç dakikalık yıkıntıları ile nazik ajitasyon ile slaytlar durula. Son yıkamadan sonra, her doku bölümü etrafında alan kuru ve her örnek etrafında bir daire çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın. Numuneleri permeabilize etmek için, bölümleri PBS'de %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile oda sıcaklığında 15 dakika tedavi edin.
Kuluçka sonunda, numuneleri PBS'de üç dakika boyunca hafif ajitasyonla iki kez yıkayın ve spesifik olmayan bağlamayı %1 büyükbaş serum albumen, %5 at serumu ve PBS'de en az bir saat boyunca %0,2 iyonik olmayan yüzey aktif bir çözelti ile bloke etmeden önce gösterdi. Daha sonra, ışıktan korunan nemli bir boyama odasında bir gecede dört santigrat derecede tampon engelleme seyreltilmiş HHF4-alfa antikor ile slaytlar inkübed. Ertesi sabah, uygun bir floresan konjuge ikincil antikor ve Hoechst filtrelenmiş 1% sığır serum albumen seyreltilmiş ve% 0.2 Non-iyonik yüzey aktif madde ile kuluçka önce nazik ajitasyon ile PBS dört kez slaytlar yıkayın.
Kuluçka sonunda, slaytları gösterildiği gibi dört kez yıkayın, ardından iki üç dakikalık yıkama lar çift distile suda nazik ajitasyon ile. Son yıkamadan sonra, numuneleri iki damla floresan montaj ortamıyla bir kapak kaymasına yerleştirin ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için gerektiği kadar hafif basınç uygulayın. Daha sonra, iyi bir fiksasyon ve immün etiketleme sağlamak için geleneksel floresan mikroskop kullanarak slaytlar kontrol edin.
Floresan görüntü edinimi için, kullanılan floresan için uygun uyarma kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için yüksek içerikli görüntüleme platformunda parametreleri ayarlayın. Daha sonra doku bölümünün tam kapsama almak için yeterli görüntü elde etmek için örnekleri tazyin. Taramayı sonunda, çekirdeğin en iyi şekilde ayrıştırılmasından emin olmak için yazılımın nükleer segmentasyon parametrelerini ayarlayın ve HNF4-alfa pozitif hepatositler ve HNF4-alfa negatif negatif parenkimal olmayan hücrelerin optimal gating sağlamak için eşik yoğunluğunu değiştirin.
Nükleer niceleme için, Hoechst boyama dayalı kare mikrometreler halinde nükleer alan ayarlayın, ana nükleer Hoechst yoğunluğu, nükleer uzama faktörü, ortalama nükleer yuvarlaklık indeksi, HNF4-alfa durumu, ve nükleer X, Yerçekimi merkezine dayalı Y koordinatları. Hepatosit nükleer ploidi analizi yapmak için, ilk indirin ve ploidy nicelik analizi programı yükleyin. MATLAB'da, araç şeridinin Uygulama sekmesine gidin ve Uygulamayı Yükle'yi tıklatın.
Ploidy Application ML Uygulama Yükleme programını açın. Başarılı yüklemeyi onaylamak için bir ileti görüntülenir. Her veri analizi dosyasında, belirtildiği gibi sütunlar halinde belirlenen ploidy analizi için gerekli tüm verileri içeren hücre ölçüleri olarak adlandırılan bir sayfa içerir.
Her deneysel durum için, iki ila dört N nükleer ploidy kalibrasyonu için iç kontrolü hesaplamak için kullanılacak bir kontrol veri seti sağlayın. Biyolojik çoğaltmalar için, her elektronik tabloyu kendi klasöründe depolayın ve klasör öneklerini artımlı olarak adlandırın. Sonra, Ploidy uygulamasını başlatın.
Ploidy uygulaması grafik kullanıcı arabirimi görünür. Denetim verilerinin bulunduğu klasöre gitmek için Veri Yolu düğmesini tıklatın. Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür.
Klasör Öneki'nde, çıktı dosyalarına verilecek adı yazın. Diğer Verilere Giden Yol düğmesini tıklatın ve karşılaştırmalı verilerin çoğaltıldığı klasöre gidin. Bu veri yolu daha sonra arabirimde görünür.
Ardından Çalıştır'ı tıklatın. Çözümleme tamamlandığında Durum çubuğu Çözümlemesi Tamamla'yı okuyacaktır. İmmünetiketlemeden sonra, kaliteli bir fiksasyon ve boyama elde edildiğini doğrulamak için konvansiyonel floresan mikroskobu ile tüm slaytların kontrol edilmesi önemlidir.
Hoechst boyasının bulaşması veya bulanıklaşması fiksasyon dan önce yetersiz fiksasyon veya örnek bozulmasını gösterebilir. Nükleer segregasyon ve HNF4-alfa eşik parametreleri, floresan mikroskopi ile gözlenen immünboyamanın görsel desenini geniş ölçüde yansıtacak şekilde otomatik görüntü analizi öncesinde dikkatle optimize edilmelidir. Görüntü analizini takiben, veriler artan sayıda parankimal olmayan hücre sayısını ve DDC yaralanması olan karaciğer içindeki HNF4-alfa pozitif çekirdek sayılarında küçük ama önemli olan azalmayı yansıtmalıdır.
Sağlıklı kontrol karaciğerlerinde HNF4-alfa pozitif çekirdeklerin yaklaşık %63'ü basit dairesel morfometri ye sahiptir. Kontrol ve DDC tedavi grupları arasında göreceli nükleer ploidin karşılaştırılması 8C'den büyük hücrelerin artan sayıları ile birlikte yaralanma ile 2C ve 4C hepatosit çekirdekleri önemli bir kaybı yansıtmalıdır. Her ploidy alt grup için göreli konumsal bilgiler yüksek içerik görüntü analizi yazılımı içinde belirli hepatosit alt kümeleri 2D konumu alınarak sorgulanabilir.
Ki-67 gibi ek antikorlarla immünoetiketleme, hücre replikasyonlarını değerlendirmek için yapılabilir ve hepatosit nükleer morfometri verileri ploidi analizini iltifat etmek için daha fazla sorgulanabilir. Bu yöntemle oluşturulan doku çapında ploidi profili tüm dairesel hepatosit çekirdekleri için minimum DNA içeriğini açıklar, ancak mononükleer hücreler ve binükleer hepatositler arasında ayrım yapmaz. Yöntem potansiyel olarak hücre çevresi gibi parametrelere göre uyarlanabilir, binükleer hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırmak ve hücresel ploidi ek bir okuma sağlamak için.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, sabitlenmiş veya krioprezerve karaciğer doku örneklerinde hepatosit sayısı ve nükleer ploidi değişikliklerini ölçmek için sağlam ve esnek bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşım, karaciğer hasarını ve hastalık ilerleyişini izlemek için gerekli olan güçlü bir karaciğer sitoloji imzası sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Karaciğer patolojisi
Arka Plan
- Hepatosit nükleer ploidisi, karaciğer gelişimi ve hastalığını anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Nükleer ploidi değişiklikleri yaşlanma, kronik karaciğer hastalığı ve kanserle ilişkilidir.
- Geleneksel yöntemler genellikle akış sitometrisi ve taze doku örnekleri gerektirir.
- Bu yöntem, doku ayrıştırma gerektirmeden profil oluşturmaya izin verir.
Çalışmanın Amacı
- 2D doku kesitlerinde hepatosit nükleer DNA içeriğini profil oluşturmak için bir yöntem geliştirmek.
- Çeşitli karaciğer doku örneklerine uygulanabilen yüksek verimli bir yaklaşım sağlamak.
- Araştırma ve klinik ortamlarda karaciğer hastalığı ilerleyişini izlemeyi kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 2D karaciğer doku kesitlerinin otomatik yüksek verimli analizi.
- Dairesel hepatosit çekirdeği için nükleer ploidinin dahili olarak kalibre edilmiş ölçümü.
- Optimal kesme sıcaklığı ortamı kullanılarak karaciğer örneklerinin hızlı dondurulması.
- Taze malzeme gerektirmeden in situ ploidi profili oluşturma.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, hepatosit nükleer ploidisi için güvenilir bir profil sağlar.
- Sabitlenmiş veya krioprezerve karaciğer örneklerine uygulanabilir.
- Karaciğer hastalığı ilerleyişini izleme potansiyelini gösterir.
- Çeşitli durumlarla ilişkili nükleer ploidi değişikliklerini değerlendirmek için basit bir yol sunar.
Sonuçlar
- Bu yöntem, karaciğer patolojisini inceleyen araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Karaciğer hasarını ve hastalığı zaman içinde izleme yeteneğini artırır.
- Gelecek uygulamaları klinik teşhis ve tedavi takibi ile sınırlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, spatially resolved quantification of hepatocyte nuclear ploidy from fixed or cryopreserved liver tissue, supporting target validation in liver disease models. By preserving tissue architecture and avoiding disaggregation bias, it provides internally calibrated, reproducible readouts of polyploidization events linked to disease progression. The approach enhances predictive confidence in preclinical studies by linking nuclear DNA content changes to pathophysiological states without requiring fresh tissue or flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating hepatocyte nuclear ploidy shifts with liver injury, regeneration, and disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through internal calibration using control datasets, reducing variability in ploidy measurements across experiments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying dose- or genotype-dependent increases in >8C hepatocyte nuclei as a biomarker of pathological polyploidization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-based readouts of nuclear area, Hoechst intensity, elongation, roundness, and HNF4-alpha status for high-content screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization via optimized nuclear segmentation and threshold gating parameters, improving reproducibility across users and sites.
- Scalability: Compatible with standard high-content imaging platforms, allowing scalable analysis of numerous tissue sections without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Preserves spatial information, enabling retrieval of 2D locations of specific ploidy subsets (e.g., 2C, 4C, >8C) within liver lobules for regional disease correlation.
- Preclinical Model Relevance: Detects significant loss of 2C/4C nuclei and increase in >8C cells following DDC injury, mirroring clinical observations in chronic liver disease and cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides a mechanistic readout to support go/no-go decisions by quantifying polyploidization as a feature of maladaptive repair or neoplastic transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, offering a reusable platform for assessing liver cytology in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in hepatocyte nuclear DNA content to pathway modulation in injury and cancer models.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs through automated image acquisition and segmentation, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates ploidy profiles based on Hoechst staining and HNF4-alpha status, providing quantitative comparisons between control and treated conditions.
- Translational Research: Maintains histological context, allowing correlation of ploidy shifts with fibrosis, inflammation, or tumorigenic regions in liver sections.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable capability for ploidy profiling across multiple liver disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in hepatocyte ploidy changes during disease progression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and imaging protocols compatible with frozen tissue archives.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, spatially resolved biomarkers of liver pathology, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate pathological polyploidization in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, fluorescence microscopy, and high-content image analysis software.
- Dependent on access to cryostat, fluorescence microscope or high-content imaging system, and MATLAB-based ploidy quantification tool.
- Necessitates cross-team standardization of nuclear segmentation and HNF4-alpha threshold settings to ensure consistent gating across datasets.
- Adaptation considerations include adjusting parameters for non-circular nuclei or binuclear hepatocytes to improve specificity in certain models.
- Practical limitations include inability to distinguish mononuclear from binuclear hepatocytes and reliance on optimal circular morphometry for accurate ploidy estimation.
