Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi
September 7th, 2019
Iyon hareketlilik-kütle spektrometresi ve moleküler modelleme teknikleri, tasarlanmış metal bağlayıcı peptidlerin ve bakır bağlayıcı peptid metanobakinin seçici metal şelat performansını karakterize edebilir. Metal şelat peptidler yeni sınıflar geliştirilmesi metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır.
İyon hareketliliği kütle spektrometresi veya IM-MS, pH'ya bağlı redoks ve peptidlerin metil bağlama reaksiyonundan çeşitli ürün iyonlarını tanımlar. Üçüncül yapılarının moleküler modellemesi ile metal korelasyonları belirlenebilir. IM-MS, ürün iyonlarının her birini çözebilir ve aynı anda kütle-şarj ve varış sürelerini ölçerek ve stokiyometrileri, protonasyon durumları ve konformasyonel yapıları ile ilgili olarak moleküler bileşimlerini belirleyebilir.
Metal şelat peptidler sınıfları geliştirme metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır, Menkes ve Wilson hastalığı gibi, kanserler, ve Alzheimer hastalığı. Başlamak için, ESI giriş tüp ve iğne kılcal iyice yaklaşık 500 mikrolitre 0.1 molar buzul asetik asit, 0.1 molar amonyum hidroksit ve son olarak, deiyonize su ile temizleyin. 10 ppm poli-DL-alanin çözeltisinin negatif ve pozitif iyon IM-MS spektrumlarını her biri 10 dakika boyunca toplamak için metin protokolünde açıklandığı gibi yerel ESI-IM-MS koşullarını kullanın.
Pipet 200.0 mikrolitre 0.125 milimolar alternatif metanobactin, veya amb çözeltisi, bir içine 1.7 mililitre flakon. 500 mikrolitre deiyonize su ile seyreltin ve çözeltiyi iyice karıştırın. 1,0 molar asetik asit çözeltisi 50 mikrolitre ekleyerek numunenin pH'ını 3,0'a ayarlayın.
PH ayarlı numuneye 0,125 milimolar metal iyonun 200,0 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra, numunenin 1,00 mililitrelik son hacmini elde etmek için deiyonize su ekleyin. Iyice karıştırın ve örnek oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dengelemek için izin verin.
Künt bir burun şırıngası kullanarak, numunenin 500 mikrolitresini alın ve negatif ve pozitif iyon ESI-IM-MS spektrumlarını her biri beş dakika toplayın. Kalibre edilmiş mikro pH elektrotunu kullanarak son pH'ını kaydetmek için numunenin kalan 500 mikrolitresini kullanın. Yeni hacimlerde asetik asit veya amonyum hidroksit çözeltisi ekleyerek pH'ı dört, beş, altı, yedi, sekiz, dokuz veya 10'a ayarlamak dışında bu adımları yineleyin.
Ortaya çıkan çözeltilerin negatif ve pozitif iyon ESI-IM-MS spektrumlarını her biri 10 dakika toplayın. IM-MS spektrumlarından, alternatif metanobakinin hangi yüklü türlerinin teorik kütleden yüke izotop desenleriyle eşleştirerek mevcut olduğunu belirleyin. Bunu yapmak için MassLynx'i açın ve Kromatogram penceresini açmak için Kromatogram'ı tıklatın.
IM-MS veri dosyasını bulmak ve açmak için Dosya menüsüne gidin ve Açın. IM-MS spektrumuna sağ tıklayarak, kromatogramı sürükleyerek ve serbest bırakarak ayıklayın. Spektrum penceresi, IM-MS spektrumu gösteren açılacaktır.
Spektrum penceresinde, Araçlar ve Izotop Modeli'ni tıklatın. Izotop modelleme penceresinde, amb türünün moleküler formülünü girin, Yüklü iyon kutusunu Göster'i işaretleyin ve şarj durumuna girin. Tamam'ı tıklatın. IM-MS spektrumundaki tüm türleri tanımlamak ve kütleden şarja izotop aralıklarını kaydetmek için bu işlemi tekrarlayın.
Her amb türü için, herhangi bir rastlantısal kütleden şarja türü ayırın ve onları tanımlamak için kütleden şarja izotop desenlerini kullanarak varış zaman dağılımlarını veya ATD'leri ayıklayın. DriftScope'u açın ve IM-MS veri dosyasını bulup açmak için Dosya ve Aç'a tıklayın. Fareyi ve sol tıklatmayı kullanarak amb türünün topluizotop desenini yakınlaştırın.
Izotop deseni seçmek için Seçim Aracı'nı ve sol fare düğmesini kullanın. Geçerli seçimi kabul et düğmesini tıklatın. Herhangi bir rastlantısal kütleden şarjtürü ayırmak için, amb türünün izotop deseniyle hizalanmış ATD saatini seçmek için Seçim Aracı'nı ve sol fare düğmesini kullanın.
Geçerli seçimi kabul et düğmesini tıklatın. ATD'yi dışa aktarmak için, File'a gidin, MassLynx'e aktarın. Ardından Drift Süresini Koru'yu seçin ve dosyayı uygun klasöre kaydedin.
MassLynx'in Kromatogram penceresinde, kaydedilen dışa aktarılan dosyayı açın. İşleme'yi tıklatın, menüden Tümleştir'i tıklatın, ApexTrack Peak Tümleştirme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. CENTroid'i ve ATD'nin entegre alanını kaydedin. Tüm kaydedilmiş amb ve poli-DL-alanine IM-MS veri dosyaları için bu işlemi tekrarladıktan sonra, her titrasyon noktasındaki pozitif veya negatif iyonların tüm çıkarılan amb türleri için entegre ATD'yi kullanarak göreceli bir yüzde ölçeğine normalleştirin.
Bunu yapmak için, amb türlerinin kimliklerini ve her pH'daki entegre ATD'lerini bir elektronik tabloya girin. Her pH için, tek tek amb türlerinIN ATD'sini yüzde ölçeğine göre normalleştirmek için tümleşik ATD'lerin toplamını kullanın. Her amb türün pH'a karşı yüzde yoğunluklarını çizin, her türün popülasyonunun pH'ın bir fonksiyonu olarak nasıl değiştiğini gösterin.
Bir elektronik tablo kullanarak, helyum tampon gazı ile ölçülen poli-DL-alanin negatif ve pozitif iyonların çarpışma kesitlerini düzeltilmiş çarpışma kesitlerine dönüştürün. Daha sonra, poli-DL-alanine kalirantların ve amb türlerinin ortalama varış sürelerini sürüklenme sürelerine dönüştürün. Poly-DL-alanine calibrants'ın sürüklenme sürelerini düzeltilmiş çarpışma kesitlerine karşı takın.
Daha sonra, en az karereyon sığması kullanarak, A asal ve b değerlerini belirleyin, asal sıcaklık, basınç ve elektrik alan parametreleri için düzeltme ve B IM aygıtının doğrusal olmayan etkisini telafi eder. Bu A asal ve B değerlerini santrifüj zaman değeri ile kullanarak, düzeltilmiş çarpışma kesitlerini ve bunların çarpışma kesitlerini belirleyin. Bu yöntem, gaussview ile Gaussian kullanarak yaklaşık% 2 tahmini mutlak hataları ile peptid türleri için çarpışma kesitleri sağlar, ve teori B3LYP LanL2DZ düzeyi, gözlenen kitle-şarj bir tür koordinasyon tüm olası türleri için geometri optimize conformers bulmak.
B3LYP LanL2DZ teori düzeyi Becke üç çevre hibrid fonksiyonel, Dunning temel seti ve elektron çekirdek potansiyelleri oluşur. Gaussian çıkış dosyasından optimize edilmiş kondiktörlerin her birinin termokimyasal analizlerini ayıklayın ve Sigma programından iyon ölçekli Lennard-Jones yöntemini kullanarak teorik çarpışma kesitlerini hesaplayın. En düşük serbest enerji konforbazından, im-MS ölçülen çarpışma kesiti ile aynı fikirde olan Lennard-Jones çarpışma kesitini hangi conformer'ın sergilediğini belirleyin.
Bu işlem, deneyde gözlenen konforyanlar için üçüncül yapıyı ve koordinasyon türünü tanımlar. Moleküler modelleme farklı metal şelat siteleri, cis ve trans peptit bağları, tuz köprüleri, hidrojen yapıştırma ve pi-katyon etkileşimleri ile konfordanların serbest enerji ve çarpışma kesitlerinin karşılaştırılmasını gerektirir. Alternatif metanobactin bir IM-MS çalışma pH bağımlı bir şekilde hem bakır ve çinko iyonları şelite gösterdi, ancak farklı reaksiyon mekanizmaları ve koordinasyon siteleri aracılığıyla.
Çinko(II)'nin altıdan büyük bir pH'ında, öncelikle çinko(II)'nin iki imidazol ve iki tiyatril tarafından tetrahedrally koordine edildiğini gösteren tek bir negatif yüklü kompleks oluşturduğu gözlendi. Bakır(II)bağlama bir disülfür köprü oluşturan tiyoller eşlik etti. Altıdan büyük bir pH'da, tek negatif yüklü bakır(II)kompleksi oluşmuştur, bu da imidazol ve iki deprotonated amid azotunun bakırı koordine ettiğini gösteren(II)Ancak, pH altının altında, bakır(II) ekleyerek, aynı zamanda tek pozitif yüklü bakır(I)kompleksini ve pH altının üzerindeki tek pozitif yüklü bakır(II)kompleksini oluşturmuştur.
Amb 2 ve amb four im-MS çalışmaları da bakır reaksiyonları inter-veya intramoleküler disülfür köprü, bakır (I)veya bakır (II) iyonları sayısı ve pH bir fonksiyonu olarak değişti deprotonasyon siteleri sayısı farklı ürünler verdiğini göstermektedir. Moleküler modelleme ile IM-MS sonucu alternatif metanodikinler tiyolit, imidazoller ve karboksiat grupları ile üç bakır (I) iyonları kadar koordine olabileceğini gösterdi. IM-MS enstrümantal ayarları, metinde açıklandığı gibi peptidlerin stoiyometrisini, yük dağılımlarını ve konformasyonel yapılarını korumak için dikkatle seçilmelidir.
Aspartik asitte tirozin gibi metal koordinasyonunu etkileyecek daha geniş bir boyut aralığının birleşimi, yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Moleküler modelleme ile IM-MS proteinlerin konformasyonel yapılarını belirlemek için kristalografi ve NMR spektroskopihızlandırmak için alternatif teknikler haline gelmiştir, DNA, lipidler, ve kompleksleri.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, metanbakterin dahil tasarlanmış peptitlerin metal şelatlama yeteneklerini analiz etmek için iyon mobilite-kütle spektrometrisi (IM-MS) ve moleküler modelleme kullanmaktadır. Bulgular, metal iyon dengesizlikleriyle bağlantılı hastalıkların tedavisi için ilaç geliştirilmesine katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Kütle Spektrometrisi
Arka Plan
- Metal iyon dengesizliği çeşitli hastalıklarla ilişkilidir.
- Peptitler, metal iyonlarını seçici olarak bağlamak üzere tasarlanabilir.
- IM-MS, bu peptitlerin moleküler bileşimini karakterize edebilir.
- Metal bağlanmayı anlamak, terapötik gelişmelere yol açabilir.
Çalışmanın Amacı
- Metal bağlayıcı peptitlerin performansını karakterize etmek.
- Bu peptitlerin metal iyonuna bağlı hastalıkların tedavisindeki potansiyeli araştırmak.
- Peptit etkileşimlerinin detaylı analizi için IM-MS kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- Ürün iyon tanımlaması için iyon mobilite-kütle spektrometrisi (IM-MS).
- Peptit yapılarını belirlemek için moleküler modelleme.
- pH'a bağlı redoks ve metil bağlanma reaksiyonlarının analizi.
- Doğal koşullar altında IM-MS spektrumlarının toplanması.
Ana Sonuçlar
- IM-MS, ürün iyonlarını etkili bir şekilde ayırır ve bileşimlerini tanımlar.
- Peptit yapıları, metal bağlama yetenekleriyle ilişkilidir.
- Bulgular, yeni metal şelatlayan peptitlerin geliştirilmesini desteklemektedir.
- Alzheimer ve kanser gibi hastalıklar için potansiyel terapötik uygulamalar.
Sonuçlar
- Metal şelatlayan peptitler, terapötik kullanım için umut vaat etmektedir.
- IM-MS, peptit karakterizasyonu için değerli bir araçtır.
- Klinik uygulamaları araştırmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) combined with molecular modeling enables biopharma R&D to characterize metal-binding peptide interactions with high structural resolution, supporting target validation for metalloprotein-related diseases. This approach provides quantitative collision cross section (CCS) and mass-to-charge (m/z) data that inform binding stoichiometry, protonation states, and conformational changes, facilitating mechanistic de-risking in early discovery. By linking pH-dependent metal coordination to functional output, IM-MS aids in prioritizing peptide candidates with selective chelating properties for therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Resolves metal-bound peptide species by m/z and CCS to identify stoichiometry and protonation states under varying pH conditions.
- Scientific Value: Distinguishes coordination sites (e.g., imidazole, thiolate, amide) through correlation of IM-MS data with B3LYP/LanL2DZ-modeled conformers.
- Scientific Value: Identifies pH-dependent switching between Cu(I) and Cu(II) complexes, revealing redox-active binding mechanisms relevant to oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Enables normalization of ion arrival time distributions (ATDs) across pH titrations to quantify relative populations of peptide-metal complexes.
- Operational Value: Uses poly-DL-alanine calibrants to correct CCS measurements, ensuring reproducible and comparable data across experimental runs.
- Operational Value: Supports high-confidence peak integration via ApexTrack in MassLynx, improving assay precision for low-abundance species.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links peptide structural motifs (e.g., imidazole, thiolate, carboxylate) to metal-binding capacity, informing structure-function relationships for lead optimization.
- Translational Value: Demonstrates capacity to coordinate up to three Cu(I) ions via thiolate, imidazole, and carboxylate groups, suggesting multivalent buffering potential relevant to neurodegenerative metal homeostasis.
- Translational Value: Differentiates Zn(II) and Cu(II) binding mechanisms (tetrahedral vs. disulfide-bridged), enabling selective targeting in diseases like Wilson’s and Alzheimer’s.
Pipeline & Workflow Integration
IM-MS with molecular modeling fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling data-driven progression to lead identification by providing mechanistic insights into metal-peptide interactions.
- Discovery Biology: Tests how pH influences metal binding affinity and coordination geometry, clarifying structure-activity relationships in metallopeptide design.
- Screening: Delivers quantitative CCS and m/z outputs that allow comparison of metal-binding affinity and specificity across peptide variants.
- Analytics: Provides drift time and ATD measurements that, when calibrated, yield accurate CCS values for comparing experimental and theoretical conformers.
- Translational Research: Connects observed coordination environments (e.g., Zn(II) tetrahedral, Cu(I) thiolate-rich) to disease-relevant metal dysregulation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for metal-peptide characterization that can be applied across multiple target classes and peptide libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating experimental IM-MS data with theoretical collision cross sections from low-energy conformers.
- Operational Value: Ensures reproducibility through native ESI conditions, pH-controlled sample preparation, and instrument calibration using poly-DL-alanine standards.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying peptides with selective, pH-responsive metal binding, reducing off-target effects in metallotherapeutic design.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated metal coordination sites and redox behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native ESI-IM-MS operation, ion mobility calibration, and spectral interpretation using MassLynx and DriftScope.
- Dependence on high-resolution IM-MS instrumentation capable of resolving ATDs for overlapping m/z species.
- Needs access to molecular modeling software (Gaussian/GaussView) and collision cross section prediction tools (Sigma, ion-scaled Lennard-Jones).
- Must maintain strict pH control during sample preparation to accurately probe metal-binding dependencies.
- Limited to gas-phase stable complexes; may not capture solution-phase dynamics or transient intermediates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Electrospray-ion Mobility-Mass Spectrometry Analysis
3:02
Analysis of ESI-IM-MS pH Titration Data
6:11
Collision Cross-Sections and Computational Methods
8:30
Results: Reaction Mechanisms and Coordination Sites of the Alternative Methanobactin Complexes
10:00
Conclusion
