Name: Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin, ultra-performans sıvı kromatografi ile IgG N-glikan analizi yapmayı. Bu hassas yöntem, glikan izomerlerini ayırarak immünoloji ve tanısal araştırmalarda güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81673247 & 81872682) ve Avustralya-Çin İşbirlikçi Hibe (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020) tarafından desteklenmiştir.

Protokolde yer alan tüm konular Sermaye Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır, Pekin, Çin12. Çalışmanın başında her konudan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.
1. IgG izolasyon
<ol><li>Bağlayıcı tampon (fosfat tamponlu salin, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), nötralize tampon: 10x PBS (pH = 6.6-6.8), elüent: 0.1 M formik asit (pH = 2.5), elüent için çözelti nötralize: 1 ammonium bikarbonat, depolanan% 20: etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), protein G için temizleme çözeltisi: 0.1 M NaOH + %30 propan-2-ol. NOT: Bu protokolde pH düzeyi çok önemlidir. IgG elution çok düşük pH gerektirir, ve asit hidroliz nedeniyle siyalik asit kaybı riski vardır. Bu nedenle, elüsasyon saniye içinde gerçekleşir ve pH hızla nötrlüğe geri, IgG ve siyalik asitlerin bütünlüğünü koruyarak.</li>
	<li>Örnekleri hazırlayın: Dondurulmuş plazma örneğini eritin ve 80 x g'de 10 dakika santrifüj edin ve Protein G monolitik plakayı ve yukarıda bahsedilen kimyasalları oda sıcaklığında 30 dakika (RT) bırakın.</li>
	<li>100 μL'lik bir numuneyi (ilk arızayı önlemek için 2x'i tespit etmek için kullanılabilir) 2 mL'lik bir toplama plakasına (burada toplam altı standart numune, bir kontrol numunesi [ultra saf su] ve 89 plazma numunesi 96 kuyu plakası için tasarlanmış ve rasgele atanmış plakaya).</li>
	<li>Numuneleri 1x PBS ile 1:7 (v/v) seyreltin.</li>
	<li>0,45 μm hidrofilik polipropilen (GHP) filtre plakası 200 μL ultra saf su ile temizleyin (tekrar 2x).</li>
	<li>Seyreltilmiş numuneleri filtre plakasına aktarın ve numuneleri vakum pompası (266.6-399.9 Pa kontrol vakum basıncı) kullanarak toplama plakasına süzün.</li>
	<li>Protein G monolitik plakaların hazırlanması<ol>
<li>Depolama arabelleği atın.</li>
		<li>Monolitik plakaları 2 mL ultra saf su, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M formik asit, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (sıralı) ile temizleyin ve vakum pompası kullanarak akan sıvıyı çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrelenmiş numuneleri IgG bağlama ve temizleme için G monolitik proteinine aktarın, ardından monolitik plakaları 2 mL 1x PBS ile temizleyin (temizleme 2x'i tekrarlayın).</li>
	<li>1 mL 0,1 M formik asit içeren Elute IgG ve vakum pompası ile numuneleri toplama plakasına süzün, ardından toplama plakasına 170 μL amonyum bikarbonat ekleyin.</li>
	<li>Bir soğurma spektrofotometre (optimal dalga boyu = 280 nm) kullanarak IgG konsantrasyonu algıla.<ol>
<li>Yazılımı açın ve protein-CY3 modunu seçin.</li>
		<li>2 μL ultra saf su çekin ve ekrana yükleyin, ardından ekranı temizlemek için yazılımdaki Boş'a tıklayın (tekrarlayın 1x).</li>
		<li>2 μL ultra saf su çekin ve ekrana yükleyin, ardından ultra saf suyu algılamak için yazılımdaki Örnek'e tıklayın.</li>
		<li>2 μL IgG numunesi çizin ve ekrana yükleyin, ardından örneği algılamak için yazılımdaki Örnek'e tıklayın.</li>
		<li>2 μL ultra saf su çekin ve ekrana yükleyin, ardından ekranı temizlemek için yazılımdaki Boş'a tıklayın.</li>
		<li>Yazılımı kapatın. NOT: IgG konsantrasyonunu hesaplamaformülü aşağıdaki gibidir: CIgG = absorbans x yok olma katsayısı (13.7) x 1.000 μg/mL</li>
	</ol></li>
	<li>Çıkarılan IgG'yi 60 °C'de bir fırında kurumaya koyun ve çıkarılan IgG'yi (300 μL çıkarılmış IgG'yi 4 saat boyunca) koruyun.<ol>
<li>Konsantrasyon 1.000 μg/mL'den büyükse 300 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.</li>
		<li>Konsantrasyon 500-1.000 μg/mL arasında ysa 350 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.</li>
		<li>Konsantrasyon 200-500 μg/mL arasındaysa 400 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.</li>
		<li>Konsantrasyon 200 μg/mL'den küçükse 600 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın. NOT: İG konsantrasyonu tercihen >200 μg/mL olmalıdır. İlk testin başarısız olması durumunda 2 kat test edilebilen ortalama IgG miktarı tercihen >1200 μg olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Yeniden kullanım için G monolitik plaka proteininin temizlenmesi<ol>
<li>Plakayı 2 mL ultra saf su, 1 mL 0,1 M NaOH (çökelmiş proteinleri çıkarmak için), 4 mL ultra saf su ve 4 mL 1x PBS (sırayla) ile yıkayın, ardından vakum pompası kullanarak akan sıvıyı çıkarın.</li>
		<li>Plakayı 2 mL ultra saf su, 2 mL %30 propan-2-ol (bağlı hidrofobik proteinlerin alınması için), 2 mL ultra saf su ve 4 mL 1x PBS (sıralı) ile yıkayın, ardından vakum pompası kullanarak akan sıvıyı çıkarın.</li>
		<li>Plakayı 1 mL tamponla yıkayın (%20 etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) ve 1 mL tampon (%20 etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) ekleyin ve plakayı 4 °C'de bırakın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Glikan salınımı
<ol><li>Kurutulmuş IgG'yi hazırlayın ve %1,33 SDS, %4 Igepal (ışıktan uzak saklayın) ve RT'de 5x PBS gibi kimyasalları saklayın.</li>
	<li>250 U enzimini 250 μL ultra saf su ile seyrelterek PNGase F enzimini hazırlayın.</li>
	<li>IgG'nin denatürasyonu<ol>
<li>%1,33 SDS'nin 30 μL'sini ekleyin ve girdap yaparak karıştırın, numuneyi 10 dk boyunca 65 °C'lik bir fırına aktarın, sonra fırından çıkarın ve 15 dk dinlendirin.</li>
		<li>% 4 Igepal 10 μL ekleyin ve 5 dakika boyunca sallayarak kuvöz üzerine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glikanların çıkarılması ve serbest bırakılması<ol>
<li>8.0 pH'ı düzenlemek için 20 μL 5x PBS ve 30-35 μL 0.1 mol/L NaOH ekleyin ve girdap ile karıştırın. 4 μL PNGase F enzimi ekleyin ve girdap ile karıştırın. Daha sonra, 37 °C su banyosunda 18-20 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Serbest bırakılan glikanları 60 °C'de 2,5-3,0 saat kurumaya koyun.</li>
		<li>Serbest bırakılan glikanları daha fazla ölçümede kadar -80 °C'de saklayAbilirsiniz. NOT: Bu adım önemlidir. Glikan salınımının anahtarı, etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için PNGase F enziminin aktivitesini artırmaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Glikan etiketleme ve arınma
<ol><li>2-aminobenzamid (2-AB) etiketleme reaktifini 0,70 mg 2-AB, 10,50°L asetik asit, 6 mg sodyum siyanoborohidrit (NaBH3CN) ve 24,50 μL dimetil sülfoksit (DMSO) (toplam hacim = 35 μL) hazırlayın. Sonra, sırayla DMSO içine asetik asit, 2-AB ve NaBH3CN ekleyin.</li>
	<li>Glikanları 35 μL 2-AB etiketleme reaktifi kullanarak etiketlayın, etiketli glikanları 5 dakika boyunca osilatöre aktarın, 65 °C'de 3 saat fırına aktarın, ardından 30 dakika RT'ye aktarın. NOT: Glikan etiketleme adımının tamamı ışıktan korunurken yapılmalıdır.</li>
	<li>%70 etanol 200 μL, ultra saf su 200 μL ve %96 asetonitril (4 °C) 200 μL'lik 0,2 μm GHP filtre plakası koyun ve vakum pompası kullanarak atıkları çıkarın.</li>
	<li>2-AB etiketli glikan arınması<ol>
<li>2-AB etiketli glisan'a 700°L %100 asetonitil ekleyin ve 5 dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine aktarın.</li>
		<li>Santrifüj 134 x g 5 dk (4 °C) için.</li>
		<li>Numuneyi 2 dk boyunca 0,2 m GHP filtre plakasına aktarın ve vakum pompası kullanarak filtrasyon (akan sıvı) çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-AB etiketli glian %96 asetonitril (4 °C) ile yıkayın ve 5x-6x vakum pompası kullanarak filtrat (akan sıvı) çıkarın.</li>
	<li>100 μL ultra saf su 3x ile Elute 2-AB etiketli glikan.</li>
	<li>2-AB etiketli glian'ı fırına aktarArak 60 °C'de 3,5 saat kurulayın.</li>
	<li>Etiketli N-glikanları -80 °C'de daha fazla ölçüme kadar saklayAbilirsiniz.</li>
</ol>4. Hidrofilik etkileşim kromatografisi ve glikan analizi
<ol><li>UPLC cihazlarının kondisyon ve mobil aşamaların hazırlanması<ol>
<li>Solvent A: 100 mM amonyum formatı (pH = 4.4), çözücü B: %100 asetonitril, çözücü C: %90 ultra saf su (%10 metanol) ve çözücü D: %50 metanol (ultra saf su) dahil olmak üzere mobil fazlar hazırlayın.</li>
		<li>Mobil aşamaları kontrol etmek için yazılımı açın.</li>
		<li>UPLC aletleri 0,2 mL/dk akış hızında yıkayın (%50 solvent B ve %50 solvent C) 30 dakika, ardından 0,2 mL/dk akış hızında (%25 solvent A ve %75 solvent B) 20 dk, ardından 0,4 mL/dk dengeleme akış hızı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiketli N-glikanları %100 asetonitril ve ultra saf su karışımının 25 μL'si ile 2:1 oranında (v/v) çözün. Daha sonra, 5 dakika (4 °C) için 134 × g santrifüj ve UPLC aletleri içine etiketli N-glikanlar 10 μL yükleyin.</li>
	<li>Etiketli N-glikanları 0,4 mL/dk akış hızıyla %75 ila %62 asetonitril ile 25 dakika boyunca ayırın. Daha sonra, 60 °C'de bir UPLC üzerinde dekstran kalibrasyon merdiveni/glikopeptid kolonu ile analitik bir çalışma gerçekleştirin (burada, numuneler enjeksiyondan önce 4 °C'de tutuldu).</li>
	<li>Sırasıyla 330 nm ve 420 nm uyarma ve emisyon dalga uzunluklarında N-glikan floresanını saptamak.</li>
	<li>Glikanları en yüksek pozisyona ve bekletme süresine göre entegre edin.</li>
	<li>Her Glikan Zirvesinin (GP)/ tüm Glikan Zirvelerinin (GP) göreli değerini hesaplama (yüzde, %) aşağıdaki gibidir: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, vb.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
<li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).</li>
<li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).</li>
<li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).</li>
<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

UPLC göreceli nicel analizyöntemi5,15olarak hizmet vermektedir. Sonuçlar UPLC iyi tekrarlanabilirlik ve göreceli nicel doğruluk ile istikrarlı bir algılama teknolojisi olduğunu göstermektedir. Her tepedeki glikan miktarı, göreli değer olan UPLC kullanılarak toplam tümleşik alanın yüzdesi olarak ifade edilir. Göreli nicelik, test örneklerinin karşılaştırılabilirliğini artırır. Buna ek olarak, 96 iyi protein G plakaları yüksek iş lenme tespiti için bir seferde 96 ö...

N-insan proteinlerinin glikozilasyon yaygın ve temel post-translational modifikasyon1 ve nispeten doğru hastalıkların oluşumu ve gelişimini tahmin yardımcı olabilir. Yapısının karmaşıklığı nedeniyle, 5.000'den fazla glikan yapısı olması beklenmektedir, hastalıklar için tanısal ve tahmine dayalı biyobelirteçler olarak büyük bir potansiyel sağlayan2. N -glikanlar immünglobulin G bağlı (IgG) IgG fonksiyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir, ve IgG N-glikozilasyon pro- ve anti-inflamatuar sistemler arasındaki dengeye katılır3. Diferansiyel IgG N-glikozilasyon hastalık gelişimi ve ilerlemesinde rol oynar ve hastalık patolojisinde yer alan yatkınlık ve fonksiyonel mekanizmayı temsil emdir. IgG N-glikozilasyon inflamatuar rolü yaşlanma ile ilişkili olmuştur, inflamatuar hastalıklar, otoimmün hastalıklar, ve kanser4.
Algılama teknolojisinin geliştirilmesi ile, aşağıdaki yöntemler en yaygın olarak yüksek iş yapma glycomics kullanılır: hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) floresan saptama ile ultra-performans sıvı kromatografisi (UPLC-FLR), lazer indüklenen flor ile multipleks kapiller jel elektroforezi eskuss algılama (xCGE-LIF), matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon zaman-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) ve sıvı kromatografi elektrosprey kütle spektrometresi (LC-ESI-MS) . Bu yöntemler düşük akı önceki eksiklikleri aşmak var, kararsız sonuçlar, ve kötü duyarlılık özgüllüğü5,6.
UPLC yaygın IgG N-glikozilasyon ve bazı hastalıklar arasındaki ilişkiyi keşfetmek için kullanılır (yani, yaşlanma7, obezite8, dislipidemi9, tip II diyabet10, hipertansiyon11, iskemik inme12, ve Parkinson hastalığı13). Yukarıda belirtilen diğer üç yöntemle karşılaştırıldığında, UPLC aşağıdakiavantajlarasahiptir 5,14. İlk olarak, göreceli bir nicel analiz yöntemi sağlar ve toplam alan normalleştirme içeren veri analizi her örnek karşılaştırılabilirliğini artırır. İkinci olarak, ekipman maliyeti ve gerekli uzmanlık nispeten düşüktür, bu da glikozilasyon biyobelirteçlerinin klinik uygulamalara uygulanmasını ve dönüştürülmesini kolaylaştırır. Daha yaygın olarak kullanılabilir böylece Burada Sunulan UPLC bir giriştir.

<table><tbody><tr><td>2-aminobenzamid, 2-AB</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu toplama plakası</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu filtre plakası</td><td>Pol</td><td>0.45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu monolitik plaka</td><td>BIA Ayrımları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalı rotor</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Almanya</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum format</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sürekli sallanan inkübatör / rocker</td><td>Zhicheng analitik enstrüman imalat co, Ltd, Çin</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran Kalibrasyon Merdiveni / Glikopeptid sütunu</td><td>Watts technology Co., Ltd, Çin</td><td>BEH sütunu</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disodyum fosfat</td><td>Shenggong Biyoloji Mühendisliği Co, Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli fırınlar</td><td>Test cihazı aletleri Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>3.0 Waters</td><td>technology Co., Ltd., Amerika'yı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>güçlendirin Etanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Etiketleme kiti</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı santrifüj</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Almanya</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük sıcaklık santrifüjü</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük sıcaklık buzdolabı</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manifold 96 kuyulu plaka</td><td>Watt teknolojisi Co., Ltd, Çin</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q saf su sayacı</td><td>Millipore Co., Ltd, Amerika</td><td>Avantajı A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biyoloji Mühendisliği Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH test cihazı</td><td>Sartorius Co., Ltd, Almanya</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su, PBS</td><td>Shenggong Biyoloji Mühendisliği Co, Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Almanya</td><td>4672100, 0.5-10&mu; l & 10-100 & mu; l & 20-200&mu; l & 1000 & mu; l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F enzimi</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Shenggong Biyoloji Mühendisliği Co, Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Shenggong Biyoloji Mühendisliği Co, Ltd, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborohidrit (NaBH3CN)</td> <td>Sigma, Çin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Şangay Yuanxi enstrüman Co, Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Transfer sıvı tabancası</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Çin</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, Amerika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı</td><td>Thermo Co., Ltd, Amerika</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra performanslı sıvı kromatografisi</td><td>Watts technology Co., Ltd, Çin</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Vakum Pompası</td><td>Watts technology Co., Ltd, Çin</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Uçuculaştırma makinesi/Kurutucu</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Almanya</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Çin</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Test cihazı aletleri Co, Ltd</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Tartı terazisi</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

ultra-performans sıvı kromatografi ile İmmünoglobulin g n-glikan analizi

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics hastalık yatkınlığı, ilaç hedef keşif ve hassas tıp için yeni nesil biyobelirteçler keşfetmek önemli bir potansiyel sunan omics sistem araştırmayeni bir alt uzmanlık olduğunu. Alternatif IgG N-glikanlar çeşitli yaygın kronik hastalıklarda bildirilmiştir ve klinik uygulamalarda büyük potansiyele sahip olduğu ileri sürülmüştür (yani, hastalıkların tanı ve tahmini için biyobelirteçler). IgG N-glikanlar hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) ultra-performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) yöntemi kullanılarak yaygın olarak karakterize edilir. UPLC iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek göreli kantitatif doğruluk ile istikrarlı bir algılama teknolojisidir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır, ve glikan bileşimi ve plazmada göreceli bolluk karakterizedir.

Şekil 1'degösterildiği gibi, IgG N-glikanlar pik pozisyon ve tutma süresine göre 24 ilk IgG glikan piki (GPs) olarak analiz edildi. N-glikan yapıları bir önceki çalışmaya göre kütle spektrometresi tespiti ile kullanılabilir (Tablo 1)15. Sonuçların karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için, her tepedeki glikan miktarının toplam entegre alanın yüzdesi olarak ifade edildiği toplam alan normalizasyonu uy...

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-performans sıvı kromatografi salik duyarlılığı nedeniyle igG n-glikan doğru analizi için teknoloji kurulmuş gibi görünüyor ve glikan belirli bir bilgi sağlamak için yeteneğine sahiptir Bu yöntemkullanımı kolay ve artışlar farklı nispeten düşük maliyetli sayısına sahiptir, yüksek tekrarlanabilirlik Glikan izomerleri yeteneği. Plazmadaki protein ölçümleri çekici olabilir. tıpta.ayrıca glikoz baz igG ile ilişkili ve Bu ve biyolojik nüfus içeren. IgG'yi glikanlarda test etmek için saf olmayan bir durum olduğunu biliyorsun. Aslında, protein n-glikanları test edebilir.Bu iki saf durumda çapraz bağlı protein protein protein uygulanabilir VEYA deneysel süreç nispeten basit iken deneysel süreç standardize edilmesi gerekir. Uçuça deneysel sürecin çalışması üç gün sürer ve deneysel becerilerde ustalaşmak için deneysel adımların ezberlenmesi gerekir. Örnekleri hazırlamak için donmuş plazma örneğini eritin.Sonra, 10 dakika boyunca 80 kez G santrifüj. Protein G monolitik plakayı oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. İki mililitrelik toplama plakasının her kuyuya 100 mikrometre lik numune aktarın.Tek bir kontrol numunesi olarak ultra saf su ekleyin. Numuneleri bir X PBS ile hacim oranına göre bir ila yedi hacim arasında seyreltin. 0,45 mikron hidrofilik polipropolen filtre plakası 200 mikrolitre ultra saf su ile temizleyin.Temizliği iki kez daha tekrarlayın. Seyreltilmiş numuneleri filtre plakasına aktarın ve 266,6 ila 399,9 Pascal basınçlı bir vakum pompası kullanarak numuneleri kolektif plakaya süzün. Protein G monolitik plakaları hazırlamak için, ilk depolama tampon atın.İki mililitre ultra saf su, iki mililitre x PBS, bir mililitre 0,17 azılı formik asit, iki mililitre 10 X PBS ve iki mililitre bir X PBS sırayla temizleyin. Vakum pompası kullanarak aşağıdaki sıvıyı çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, filtrelenmiş numuneleri IgG bağlama ve temizleme için G monolitik proteinine aktarın.Sonra, yekpare plakaları temizlemek için bir X PBS iki mililitre ekleyin. PBS'yi vakum pompası kullanarak çıkarın ve temizliği iki kez daha tekrarlayın. Bir mililitre 0.17 molar formik asit ile Illute IgG ve vakum pompası ile toplama plakasına örnekleri filtre.Daha sonra, toplama plakaiçine bir molar amonyum bikarbonat 170 mikrolitre ekleyin. 280 nanometre optimum dalga boyunda bir emme spektratörmetre kullanarak IgG konsantrasyonu tespit edin. Üç saat boyunca 60 santigrat derece kuruması için bir fırında çıkarılan IgG yerleştirin.El yazmasında açıklandığı gibi konsantrasyonuna göre gözlemlenecek miktarı belirleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kurutulmuş IgG'yi toplayın ve %1,33 SDS, %4 IgePal ve %5 PBS gibi kimyasalları oda sıcaklığında saklayın. 250 ünite enzimi 250 mikrolitre ultra saf su ile seyrelterek indoglycosidase F enzimini hazırlayın.IgG dennature için, 1.33% SDS 30 mikrolitre ekleyin ve girdap tarafından karıştırın. Numuneyi 10 dakika boyunca 65 derecelik bir fırına aktarın. Daha sonra fırından çıkarın ve 15 dakika soğumaya bırakın.Aynı numuneye %4 IgePal'ın 10 mikrolitresini ekleyin ve beş dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin. PH'ı 8,0'a kadar düzenlemek için 5 X PBS ve 30 ila 35 mikrolitre 0,1 molar sodyum hidroksit 20 mikrolitre ekleyin ve girdap ile karıştırın. Endoglycosidase F enzimdört mikrolitre ekleyin ve girdap tarafından karıştırın.Sonra, 37 santigrat derece su banyosunda 18-20 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, serbest bırakılan gylcans 60 santigrat derece bir fırında iki buçuk-üç saat kurumaya yerleştirin. Serbest glikanları eksi 80 santigrat derecede daha fazla ölçüme kadar kaydedin.DMSO 24,5 mikrolitre, asetik asit 10,5 mikrolitre, iki amino benzimid 0,7 miligram ve sodyum siyanoborohydride altı miligram ile iki amino benzimid etiketleme reaktif hazırlayın. Daha sonra, karanlık bir odada, iki amino benzimid etiketleme reaktif 35 mikrolitre ekleyerek glikanlar etiket. Etiketli parıltıları beş dakika lığına bir osilatöre aktarın ve sonra 65 derecede üç saat fırına aktarın.Bundan sonra, 30 dakika oda sıcaklığına aktarın. IgG n-glycase, saf olmayan durumun floresan tespiti tarafından tespit edilebilmesi için etiketle etiketeceğiz. %70 etanol 200 mikrolitre, ultra saf su 200 mikrolitre ve dört santigrat derecede %96 asetit nitril 200 mikrolitre ile 0,2 mikron GHP filtre plakası pretreat.Sonra, bir vakum pompası kullanarak atık kaldırın. Glikan etiketli iki amino benzimid arındırmak için, numuneye% 100 asetonitit 700 mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine aktarın. Santrifüj 134 kez G'de beş dakika dört santigrat derecede.Supernatent'i 0,2 mikron GHP filtre plakasına iki dakika aktarın ve vakum kullanarak filtrasyonun çıkarılmasını bekleyin. Dört santigrat derecede %96 asetonitile 200 mikrolitre glikan etiketli iki amino benzimide yıkayın ve 5-6 kez bir vakum pompası kullanarak filtrat kaldırın. Illute iki amino benzimide glikan ultra saf su 100 mikrolitre ile üç kez etiketli.Glian etiketli iki amino benzimide fırına aktarArak 60 derecede üç buçuk saat kurulayın. Etiketli n-glikanları eksi 80 santigrat derecede daha fazla ölçüme kadar kaydedin. İlk olarak, mobil aşamaları kontrol etmek için yazılımı açın.UPLC aletleri %50 solvent B ve %50 solvent C ile dakikada 0,2 mililitre akış hızında 30 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, 20 dakika boyunca dakikada 0,2 mililitre akış hızında %25 çözücü A ve %75 çözücü B ile yıkayın. Daha sonra, dakikada 0,4 mililitre akış hızı ekleyin.Etiketli n-glikanları %100 asetonitril ve ultra saf su karışımının 25 mikrolitresi ile hacim oranına göre iki ila bir hacim de çözün. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika için 134 kez G santrifüj ve UPLC aletleri içine supernatent 10 mikrolitre yüklemek için kuru bir boru kullanın. Etiketli n-glikanları dakikada 0,4 mililitre akış hızıyla %75 ila %62 asetonitril ile 25 dakika ayırın.Daha sonra, Dexteran kalibrasyon merdiveni glikopeptid sütunu tarafından 60 santigrat derecede bir UPLC üzerinde çalışan bir analitik çalıştırın. X alıntı ve emisyon dalga boylarında n-glijen floresantespit 330 nanometre ve 420 nanometre, sırasıyla. Bu şekilde gösterildiği gibi, IgG n-glikanlar pik pozisyon ve tutma süresine göre 24 ilk IgG glikan pikleri analiz edildi.N-glikan yapıları kütle spektrometresi tespiti ile 24 tipte mevcuttur. Yöntemin tekrarlanabilirliğini ve stabilitesini analiz etmek için standart örnek altı kez paralel olarak test edilmiştir. Nispeten küçük oranlarda glikan zirveleri varyasyon katsayısı fazla% 10 yüksek ölçüm hataları gösterdi.Parça da ve önemli bir IgG n-glikan yapısı nın oluşturulması için, özellikle terminal kurulması için Bu nedenle, yerine bulunan 3.3 IgG n-glycase Bu IgG önemi önemlidir. Glikanların farklı olduğu bilinmektedir. Glikan prototomindeki gelişmelerle birlikte, glikanlarda birleşince bu konuda ki bilgileri keşfetmek için günümüz tanısı için bir potansiyel olarak kullanılabilir.Bu teknik geliştirme den sonra, keşfetmek için yeni bir yol sağlar

immunoglobulin-g-n-glycan-analysis-ultra-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Bu video, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi kullanılarak hidrofilik polar bileşiklerin ayrılması ilkesini göstermektedir. Bu teknik, N-glikanlar dahil olmak üzere çeşitli polar analitlerin saflaştırılmasına yardımcı olur.

Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi: Hidrofilik Polar Analitleri Hidrofilik Boncuklar Kullanarak Ayırmak İçin Bir Teknik

Plazmada kombine proteomik ve glikomik saflaştırma ve LC-MS/MS miktar tayini için yüksek verimli bir protokol geliştirilmiştir. N-bağlı glikozilasyon motiflerinin deamidasyon analizi, deglikosile edilmiş bölgelere özgüydü. N-glikanların doğru kantitasyonu, glikan hidrazid etiketleri stratejisi ile etiketleme yapılırken filtre destekli N-glikan ayrımının bireysellik normalizasyonuna bağlanmasıyla elde edildi.

Nicel Glycomics ve Proteomik Kombine Arıtma Stratejisi

Bu makale, GC-MS tarafından tespit edilmek üzere glikanların bileşen bağlarına özgü monosakkaritlere kimyasal olarak parçalanması yoluyla fraksiyonlanmamış biyoakışkanlardaki glikanların havuzlanmış bileşim profilini analiz etmek için tasarlanmış yeni bir aşağıdan yukarıya glikomik tekniğinin geliştirilmiş bir biçimini sunmaktadır. Potansiyel uygulamalar arasında kanser ve diğer glikan-afektif bozuklukların erken tespiti yer alır.

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Bu protokol, kanserlerin glikobiyolojisini daha iyi anlamak için gerekli olan karmaşık tümör mikro ortamlarındaki heterojen glikoproteom hakkında kapsamlı bilgiler sunan entegre bir omik teknolojisi olan glikomik kılavuzlu glikoproteomik yöntemini detaylandırır.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Öğrenin, ultra-performans sıvı kromatografi ile IgG N-glikan analizi yapmayı. Bu hassas yöntem, glikan izomerlerini ayırarak immünoloji ve tanısal araştırmalarda güvenilir sonuçlar sunar.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Daha fazla video keşfet