Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-performans sıvı kromatografi salik duyarlılığı nedeniyle igG n-glikan doğru analizi için teknoloji kurulmuş gibi görünüyor ve glikan belirli bir bilgi sağlamak için yeteneğine sahiptir Bu yöntemkullanımı kolay ve artışlar farklı nispeten düşük maliyetli sayısına sahiptir, yüksek tekrarlanabilirlik Glikan izomerleri yeteneği. Plazmadaki protein ölçümleri çekici olabilir. tıpta.

ayrıca glikoz baz igG ile ilişkili ve Bu ve biyolojik nüfus içeren. IgG'yi glikanlarda test etmek için saf olmayan bir durum olduğunu biliyorsun. Aslında, protein n-glikanları test edebilir.

Bu iki saf durumda çapraz bağlı protein protein protein uygulanabilir VEYA deneysel süreç nispeten basit iken deneysel süreç standardize edilmesi gerekir. Uçuça deneysel sürecin çalışması üç gün sürer ve deneysel becerilerde ustalaşmak için deneysel adımların ezberlenmesi gerekir. Örnekleri hazırlamak için donmuş plazma örneğini eritin.

Sonra, 10 dakika boyunca 80 kez G santrifüj. Protein G monolitik plakayı oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. İki mililitrelik toplama plakasının her kuyuya 100 mikrometre lik numune aktarın.

Tek bir kontrol numunesi olarak ultra saf su ekleyin. Numuneleri bir X PBS ile hacim oranına göre bir ila yedi hacim arasında seyreltin. 0,45 mikron hidrofilik polipropolen filtre plakası 200 mikrolitre ultra saf su ile temizleyin.

Temizliği iki kez daha tekrarlayın. Seyreltilmiş numuneleri filtre plakasına aktarın ve 266,6 ila 399,9 Pascal basınçlı bir vakum pompası kullanarak numuneleri kolektif plakaya süzün. Protein G monolitik plakaları hazırlamak için, ilk depolama tampon atın.

İki mililitre ultra saf su, iki mililitre x PBS, bir mililitre 0,17 azılı formik asit, iki mililitre 10 X PBS ve iki mililitre bir X PBS sırayla temizleyin. Vakum pompası kullanarak aşağıdaki sıvıyı çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, filtrelenmiş numuneleri IgG bağlama ve temizleme için G monolitik proteinine aktarın.

Sonra, yekpare plakaları temizlemek için bir X PBS iki mililitre ekleyin. PBS'yi vakum pompası kullanarak çıkarın ve temizliği iki kez daha tekrarlayın. Bir mililitre 0.17 molar formik asit ile Illute IgG ve vakum pompası ile toplama plakasına örnekleri filtre.

Daha sonra, toplama plakaiçine bir molar amonyum bikarbonat 170 mikrolitre ekleyin. 280 nanometre optimum dalga boyunda bir emme spektratörmetre kullanarak IgG konsantrasyonu tespit edin. Üç saat boyunca 60 santigrat derece kuruması için bir fırında çıkarılan IgG yerleştirin.

El yazmasında açıklandığı gibi konsantrasyonuna göre gözlemlenecek miktarı belirleyin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kurutulmuş IgG'yi toplayın ve %1,33 SDS, %4 IgePal ve %5 PBS gibi kimyasalları oda sıcaklığında saklayın. 250 ünite enzimi 250 mikrolitre ultra saf su ile seyrelterek indoglycosidase F enzimini hazırlayın.

IgG dennature için, 1.33% SDS 30 mikrolitre ekleyin ve girdap tarafından karıştırın. Numuneyi 10 dakika boyunca 65 derecelik bir fırına aktarın. Daha sonra fırından çıkarın ve 15 dakika soğumaya bırakın.

Aynı numuneye %4 IgePal'ın 10 mikrolitresini ekleyin ve beş dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin. PH'ı 8,0'a kadar düzenlemek için 5 X PBS ve 30 ila 35 mikrolitre 0,1 molar sodyum hidroksit 20 mikrolitre ekleyin ve girdap ile karıştırın. Endoglycosidase F enzimdört mikrolitre ekleyin ve girdap tarafından karıştırın.

Sonra, 37 santigrat derece su banyosunda 18-20 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, serbest bırakılan gylcans 60 santigrat derece bir fırında iki buçuk-üç saat kurumaya yerleştirin. Serbest glikanları eksi 80 santigrat derecede daha fazla ölçüme kadar kaydedin.

DMSO 24,5 mikrolitre, asetik asit 10,5 mikrolitre, iki amino benzimid 0,7 miligram ve sodyum siyanoborohydride altı miligram ile iki amino benzimid etiketleme reaktif hazırlayın. Daha sonra, karanlık bir odada, iki amino benzimid etiketleme reaktif 35 mikrolitre ekleyerek glikanlar etiket. Etiketli parıltıları beş dakika lığına bir osilatöre aktarın ve sonra 65 derecede üç saat fırına aktarın.

Bundan sonra, 30 dakika oda sıcaklığına aktarın. IgG n-glycase, saf olmayan durumun floresan tespiti tarafından tespit edilebilmesi için etiketle etiketeceğiz. %70 etanol 200 mikrolitre, ultra saf su 200 mikrolitre ve dört santigrat derecede %96 asetit nitril 200 mikrolitre ile 0,2 mikron GHP filtre plakası pretreat.

Sonra, bir vakum pompası kullanarak atık kaldırın. Glikan etiketli iki amino benzimid arındırmak için, numuneye% 100 asetonitit 700 mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine aktarın. Santrifüj 134 kez G'de beş dakika dört santigrat derecede.

Supernatent'i 0,2 mikron GHP filtre plakasına iki dakika aktarın ve vakum kullanarak filtrasyonun çıkarılmasını bekleyin. Dört santigrat derecede %96 asetonitile 200 mikrolitre glikan etiketli iki amino benzimide yıkayın ve 5-6 kez bir vakum pompası kullanarak filtrat kaldırın. Illute iki amino benzimide glikan ultra saf su 100 mikrolitre ile üç kez etiketli.

Glian etiketli iki amino benzimide fırına aktarArak 60 derecede üç buçuk saat kurulayın. Etiketli n-glikanları eksi 80 santigrat derecede daha fazla ölçüme kadar kaydedin. İlk olarak, mobil aşamaları kontrol etmek için yazılımı açın.

UPLC aletleri %50 solvent B ve %50 solvent C ile dakikada 0,2 mililitre akış hızında 30 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, 20 dakika boyunca dakikada 0,2 mililitre akış hızında %25 çözücü A ve %75 çözücü B ile yıkayın. Daha sonra, dakikada 0,4 mililitre akış hızı ekleyin.

Etiketli n-glikanları %100 asetonitril ve ultra saf su karışımının 25 mikrolitresi ile hacim oranına göre iki ila bir hacim de çözün. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika için 134 kez G santrifüj ve UPLC aletleri içine supernatent 10 mikrolitre yüklemek için kuru bir boru kullanın. Etiketli n-glikanları dakikada 0,4 mililitre akış hızıyla %75 ila %62 asetonitril ile 25 dakika ayırın.

Daha sonra, Dexteran kalibrasyon merdiveni glikopeptid sütunu tarafından 60 santigrat derecede bir UPLC üzerinde çalışan bir analitik çalıştırın. X alıntı ve emisyon dalga boylarında n-glijen floresantespit 330 nanometre ve 420 nanometre, sırasıyla. Bu şekilde gösterildiği gibi, IgG n-glikanlar pik pozisyon ve tutma süresine göre 24 ilk IgG glikan pikleri analiz edildi.

N-glikan yapıları kütle spektrometresi tespiti ile 24 tipte mevcuttur. Yöntemin tekrarlanabilirliğini ve stabilitesini analiz etmek için standart örnek altı kez paralel olarak test edilmiştir. Nispeten küçük oranlarda glikan zirveleri varyasyon katsayısı fazla% 10 yüksek ölçüm hataları gösterdi.

Parça da ve önemli bir IgG n-glikan yapısı nın oluşturulması için, özellikle terminal kurulması için Bu nedenle, yerine bulunan 3.3 IgG n-glycase Bu IgG önemi önemlidir. Glikanların farklı olduğu bilinmektedir. Glikan prototomindeki gelişmelerle birlikte, glikanlarda birleşince bu konuda ki bilgileri keşfetmek için günümüz tanısı için bir potansiyel olarak kullanılabilir.

Bu teknik geliştirme den sonra, keşfetmek için yeni bir yol sağlar