Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

Atomik kuvvet mikroskobuna dayalı yöntemler, nano ölçekteki biyomoleküler prosesleri morfolojik kimyasal veya yapısal çözünürlükle karakterize etmeyi mümkün kılarak, son olarak biyoloji üzerine yeni bir ön gözlem penceresi açmaktadır. Tek moleküllü yöntemler, protein agregasını anlamak için özellikle geçerli olan yüksek heterojen sistemlerin araştırılmasını sağlar. Tek molekülleri sırt yaklaşımlarıyla birleştirerek, proteinlerin davranışları, insan hastalığı ile bağlantıları ve başarılı olabilecek farmakolojik müdahaleler tasarlamaları hakkında temel bilgiler edinebiliriz.

Ayrıca, bu yöntem, ilaç teslimatı, uygulamaları ve diğer biyoteknolojik amaçlar için biyomalzemelerin kimyasal ve yapısal özelliklerini incelemek için başarıyla uygulanabilir. Yüksek çözünürlük için doğru AFM parametrelerini ayarlamak başlangıçta zor olabilir ve fibriller agregalarınızı ölçerken AFM'nizi kolayca ayarlamak kolaydır. AFM görüntülemeden 30 dakika önce, AFM sistemini açın ve kurulum ve sondayı tıklatın.

Sonda değiştirme penceresinde, Z odak aşamasını hazırlamak için hemen tıklatın. Açıksa AFM ışın düğmesini kapatın ve güvercin kuyruğu kilitlerini açın. Kafanın sistemden bağlantısını kesin ve sonda değiştirme penceresinde, sonrakini tıklatın.

AFM kantilini sonda tutucuya monte edin. Kafayı sisteme bağlayın ve güvercin kuyruğu kilitlerini kilitleyin. AFM lazer ışını anahtarını açın ve sonda değiştirme penceresinde, sonrakini tıklatın.

Açılan pencerede, cantilever türü değişmediyse hayır'ı tıklatın ve cantilever'i bulmak için optik hizalama düğümlerini ayarlayın. Odak noktasını cantilever'e ayarlayın ve sonrakine tıklayın. Açılan pencerede, odak kantilever ise evet tıklatın.

Algılama lazer ışını düğümlerini kullanarak lazer ışınını kantileverin ucundakonumlandırın. Dört çeyrek fotoğraf diyot tarafından ölçülen toplam sinyali en az bir volttan daha fazla maksimize etmek için saptırılmış lazer ışını düğümlerini kullanın. Sonda değiştirme penceresinde, sonraki ni tıklatın ve kapatın.

Cantilever'in termal stabiliteye ulaşması için 15 dakika bekledikten sonra, gerekirse pozisyona duyarlı fotoğraf diyotundaki saptırılmış lazer ışınının konumunu kolayca değiştirin. NCM süpürme'yi tıklatın, istenilen salınım genliğini seçin, kullanım aşamasına tıklayın ve otomatik'e tıklayın. Metre başına 40 newton luk yay sabiti olan bir cantilever için yaklaşık 300 kilohertz'e kadar ilk serbest salınım rezonansının maksimumuna yakın olan kantilever'i ayarlayın.

Numuneyi numune tutucuya yerleştirin. Taraya alanını tıklatın ve çözünürlüğü 256'ya 256 ile 1024 piksel e ayarlayın ve ardından tarayıp boyut ve piksel numarasını ayarlayın. Tarama hızını 0,3'e bir hertz'e ayarlayarak birer beşmikrometre karelik bir tarama alanı ayarlayın.

Optik görünümü numuneye odakla ve örnek yüzeyine yaklaşmak için yaklaşmaya tıklayın. Ardından, AFM ucunu numunenin yüzeyinden 100 mikrometre yukarı kaldırmak için 100 mikrometreyi kaldırın ve numunenin optik görüntüsünü genişletmek için tıklayın. Görünümü örnek yüzeyine odaklamak için odak aşaması çubuğunu tıklatın ve ilgi örneğinin bulunduğu bölgede hareket etmek için okları kullanın.

Yüzeyi meşgul etmek için yaklaşıma tıklayın ve ucun yüzeyi iyi izleyip takip edip etmeyince kontrol etmek için satır tonu'nu tıklatın. Ayar noktasını gerektiği gibi ayarlayın. Daha sonra büyük bir görüntüleme kuvvetinden kaçınmak ve bağımsız numuneler arasında tutarlılığı korumak için görüntüleme sırasında delta 20'yi geçmeyen faz değişiminin sabit bir rejimini koruyarak örnek yüzeyini görüntülemeye başlamak için tarama'yı tıklatın.

IR nanospektroskopisi görüntüleme için, analizden 30 ila 60 dakika önce, AFM IR sistemini ve IR lazerini açın. Enstrümanı kontrol etmek için yerleşik yazılımı açın ve yeni bir nano IR dosyasını açmak için dosyayı ve yeniyi tıklatın. AFM IR sistemini başlatmak ve enstrüman kapağını açmak için başlat'ı tıklatın.

Numuneyi temas modunda ölçmek için 30 nanometre nominal yarıçapı ve metre başına 0,2 newton luk bir yay sabiti ile silikon altın kaplı bir prob monte edin. AFM sondası bölümünde ve sonraki yükle'yi tıklatın. Kamerayı kantilever'e odaklamak için sonda oklarına odaklanın ve artı işaretini kullanarak kantilin in sonuna artı işareti yerleştirin.

Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri döndürerek lazeri ktilever'in sonunda konumlandırın. Üç volttan daha büyük bir değer dört çeyrek fotoğraf diyot tarafından ölçülen toplamı algılamak ve maksimize etmek için lazer knobs döndürün. Bir volt eksi cantilever sapma ayarlamak ve sonraki tıklayın sapma düğmesini döndürün.

Sonra enstrümanın kapağını kapatın. Kamerayı numuneye ve uca odaklamak için sonda oklarına odaklanarak, numunenin ilgi çekici bölgesinde hareket etmek için okları çapraz sorguya çekin. İleri'yi tıklatın ve meşgul.

Mikroskop penceresinde, morfoloji için yükseklik, IR emilimi için genlik iki ve temas rezonansÖrnek ucu haritalamak için PLL frekansı seçin. AFM taraması bölümünde, AFM görüntüleme için gösterildiği gibi parametreleri ayarlayın ve bir morfoloji haritası elde etmek için taramaya tıklayın. Morfoloji eşleme tamamlandığında, mikroskop penceresinde, sondayı bir agreganın üstüne konumlandırmak için yükseklik haritasını tıklatın.

Nano IR bölümünde, ÖRNEĞI IR lazerle aydınlatmak için IR başlat'ı tıklatın. Kızılötesi lazeri kantilever'e odaklamak için en iyi duruma getir'i tıklatın ve dalga sayısı için 1655 santimetre girin. IR lazer konumunu belirlemek için ekle ve taraya tıklayın ve güncellemeyi tıklatın ve konumunu kantilever ile hizalamak için tamam'ı tıklatın.

Genel bölümde, göreli alanda yüksek bir absorbans beklenen bir dalga numarası girin ve bant geçiş filtresi seçeneğini devre dışı bırakın. Ir başlat'ı tıklatın sonra sayaç okuma ve cantilever yanıtı FFT kontrol edin. FFT penceresinde, cantilever rezonans sıklığını okumak için yeşil imleci hareket ettirin.

Kantilevers rezonans FFT tipik bir değeri yaklaşık 200 kilohertz olduğunu. Frekans merkezi alanında genel bölüme oluşturulan rezonans frekans değerini girin ve 50 kilohertz'lik bir frekans penceresi kullanın. Rezonans geliştirilmiş modu seçmek ve 222 kilohertz bir darbe hızı ayarlamak için lazer darbe ayar penceresi tıklayın, 50 kilohertz bir ayar aralığı ve 5% bir lazer görev döngüsü lazer nabız hızını süpürmek için elde edin.

Ir ışığını emen numunenin termal genişlemesinin mekanik tepkisinin frekansına lazer darbesini ayarlamak için imleci kullanın. Ardından, örnek le ipucu arasındaki temas rezonansını izlemek için faz kilitli döngüyü seçin ve sıfıra tıklayın. Nano ölçekteki diğer kimyasal özellikler için, numune spektrumunaşırı ısınma ve yumuşamadan etkilenmediğinden emin olmak için spektrum edinimi sırasında kontak rezonansını takip edin.

Kişi rezonansını bahşiş vermek için örneği izlemeyi etkinleştir'i seçin ve 0,5 integral kazancı ve 10'luk orantılı kazanç seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Optimize etme penceresinde, numunenin ana emici bantlarına karşılık gelen en az üç dalga numarası ve lazerin her bir çipi için en az bir dalga numarası için IR lazerini bulmak için dalga boyunu ve taramaya tıklayın. Araçları, IR arka plan kalibrasyon ve yeni'yi tıklatın ve dalga numaralarını 1200 ile 1800 santimetre arasında ayarlayın. Arka planlar bir, görev döngüsü % 5 ve süpürme hızı 100 santimetre kare olarak ayarlayın.

Ölçülen nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumların normalleştirilmesi için IR lazer arka planını ölçmek, dosyayı kaydetmek ve pencereyi kapatmak için edinme'yi tıklatın. IR spektrum ayarlarında, bir ila dört santimetre arasında bir IR spektrum çözünürlüğü ve en az 64 kez ortak ortalamalar seçin. Sonra protein aralığında bir nano ölçekli lokalize IR spektrumu ölçmek için elde tıklayın.

Nano ölçekli çözümlenmiş kimyasal harita elde etmek için 1655 santimetre ve IR görüntülemeyi seçin ve AFM taraması penceresinde tarayını tıklatın. Eşleme tamamlandığında, ölçümleri kaydedin. Sonra morfoloji, temas rezonans ve kimya ve nano ölçekli lokalize spektrum kazanılmış haritaları analiz etmek için AFM görüntü işleme yazılımı yerleşik kullanın.

Birleştirilmiş türlerin varlığı kinetik kötü tekrarlanabilirlik neden olabilir ve ölçümlerde eserler tanıtmak gibi son derece saf monomerik çözüm elde etmek için kritik bir adımdır. Yüksek heterojenliğe sahip biyolojik numunelerin başarılı bir şekilde incelenmesinde temel bir faktör katı yüzeylerin doğru konumudur. Numune mimarisini ve heterojenliğini korumak için manuel bir yerine mikroakışkan sprey birikiminden yararlanılabilir.

Bu yöntemler, bireysel biyomoleküllerin kimyasal yapısı nın ve özelliklerinin ve bunların fizyolojik ve yerli sıvı ortamındaki etkileşimlerinin çözülmesinin önünü açmaktır.