Name: Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Keşfedin kızılötesi nanospektroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu ile bireysel protein agregalarının karakterizasyonunu. Bu yöntemler, nörodejeneratif hastalıklarda protein toplanmasını anlamak için güçlü araçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'na (SNF) mali destek için teşekkür (hibe numarası P2ELP2_162116 ve P300P2_171219), Darwin College, Erasmus+ programı için mali destek için (hibe numarası 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) ve bu sonuçlara yol açan araştırmalar, Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden ERC hibe PhysProt (anlaşma numarası 337969), Newman Vakfı (T.P.J.K.) ve Cambridge Misfolding Hastalıkları Merkezi (C.G., M.V., ve T.P.J.K.).

1. Floresan levha okuyucular üzerinde toplama tahlilleri
NOT: Burada açıklanan protokol, herhangi bir protein veya peptidin kimyasal kinetik ile nasıl toplandığının incelenmesine bir örnektir. Özellikle, Alzheimer hastalığının başlangıcı ve ilerlemesi nde yer alan Aβ42 peptid, agregasyon incelemek için optimize edilmiş bir protokol açıklar58,59. Benzer bir protokol ayarlanabilir ve herhangi bir protein veya peptid toplama çalışma doğru kabul edilebilir.
<ol><li>Aβ42 içeren protein fraksiyonlarını ayırt etmek için iyon değişimi ve boyut dışlama kromatografi teknikleri ile Aβ42'nin son derece saf monomerik çözeltisini elde etmek ve monomerik fraksiyonu Elde edilen Aβ42'nin diğer toplam formlarından ayırmak için58 , 59.</li>
	<li>Aβ42 peptidini 20 mM sodyum fosfat tamponunda seyreltin, pH 8.058'de 200 μM EDTA'yı 1−5 μM arasında değişen bir nihai konsantrasyona 1,5 mL düşük bağlamalı tüplerde seyreltin. AFM ölçümleri için toplanan numuneler, AFM analizi için numune birikimi sırasında eserler getirebileceğinden, agregasyon tahlillerinde (tioflavin T, ThT) kullanılan floresan boyayı içermemelidir. Böylece, iki özdeş çözeltinin triplicates hazırlamak: i) Ilk içeren monomerik Aβ42 AFM tarafından toplama sürecini takip etmek; ii) agregasyonk kinetik izlemek için bir izleyici olarak 20 μM ThT ekolarak Aβ42 monomerik içeren ikinci. NOT: Buz üzerinde 1.1 ve 1.2 adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Bu yordam, monomerik Aβ42 çözeltisinin plaka okuyucuda başlatılana kadar toplamını sağlamamasını sağlamaktır. Numuneleri işlerken, protein örneğini etkileyebilecek hava kabarcıklarının ortaya çıkmasına karşı dikkatli pipetleme esastır.</li>
	<li>Pipet, her bir numunenin her bir kuyuda, açık alt ve bağlayıcı olmayan yüzeylere sahip 96 kuyulu, yarım alanlı siyah polistiren plakası.</li>
	<li>Plakayı, numunenin toplama süresince buharlaşmasını en aza indirmek için bir folyo ile kapatın.</li>
	<li>Plaka okuyucunun sıcaklığını 37 °C'ye dengeleyin.</li>
	<li>440 nm uyarma dalga boyunda ve 480 nm emisyon dalga boyunda, sabit zaman-nokta aralıklarında floresan ölçümleri okumak için toplama protokolünü ayarlayın. Toplama quiescent koşullarda başlatılmalıdır.</li>
	<li>Plakayı plaka okuyucusuna takın. NOT: Plaka yı çalıştırmadan önce agregasyonun tetiklenmediğinden emin olmak için plakayı kullanırken dikkatli olmak önemlidir. Her numunenin floresansının en iyi şekilde okunmasını sağlamak için kazanç ayarlama ayarlarını kullanın.</li>
	<li>Ölçümü başlatın. NOT: ThT floresan sigmoidal eğrisi plato58'eulaştığında toplama deneyi sonuçlandırılır.</li>
</ol>2. AFM ve nano-IR ölçümleri için numune hazırlama
<ol><li>Yapıştırıcı sekmeler veya çift taraflı bant kullanarak yüksek kaliteli manyetik paslanmaz çelik diske yapıştırıcı en kaliteli kaliteV1 mika disk.</li>
	<li>Mika yüzeyine yapışkan bant bir parça yerleştirerek ve mika üst tabakası çekerek mica etch. Bu işlem, numune birikimine uygun temiz, atomik olarak düz bir yüzey üretecektir. NOT: Kazınan yüzey düzgün ve pürüzsüz olmalıdır. DİkKAT: Yeni kazınmlı mikanın üzerine doğrudan dokunmayın veya nefes almayın, çünkü bu eserler tanıtacak.</li>
	<li>Proteinin toplama işlemi sırasında ilgi çekici zaman noktasını toplamak için plaka okuyucu ölçümünü duraklatın/durdurun.</li>
	<li>Sızdırmazlık folyosunun çıkarılmasını ve tht olmadan numunelerin 10 μL aliquot'ünü kuyudan 1,5 mL düşük bağlamalı tüplere toplayın.</li>
	<li>Numunenin 10 μL'sini taze kazınan mikanın üzerine yatırın. AFM-IR ölçümleri için numuneler taze soyulmuş altın alt tabakaüzerine yatırılmalıdır.</li>
	<li>Fizyorbasyon alabilmek için mikadaki çözeltiyi 1 dk kuluçkaya yatırın. NOT: Daha uzun kuluçka süresi yüzeyde daha iyi emilimi sağlayacak ama yapay öz-organizasyon ve kendi kendine montaj neden olabilir25. Bu etkilerden kaçınmak için, sprey birikimi25yararlanılabilir.</li>
	<li>1 mL ultra saf su ile üç kez durulayın.</li>
	<li>Hava ortamında numuneyi ölçmek için hafif bir azot akışı altında kurulayın.</li>
</ol>3. Protein agregalarının morfolojisinin AFM görüntülemesi
NOT: Morfoloji ölçümleri hem temas hem de dinamik modda yapılabilir, aşağıdaki adımlarda, numunenin 3Boyutlu morfolojisini yüksek çözünürlükte ölçmek için lateral kuvvetleri azalttığı için ikincisi açıklanmıştır. AFM-IR ölçümleri, AFM-IR sinyal-gürültü oranını artırmak için temas modunda yapılacaktır.
<ol><li>Sistemin termal stabiliteye ulaşmasını sağlamak için ölçümlerden en az 30 dakika önce AFM sistemini açın. Kurulum'atıklayın, ardından Probe'da. Sonda Değiştir penceresinde Z, Odak Aşaması'nıhazırlamak için İleri'ye tıklayın.</li>
	<li>AFM ışın anahtarını kapatın (açıksa). Güvercin kuyruğu kilitlerini açın, kafanın sistemden bağlantısını kesin ve Sonda Değiştir penceresinde İleri'yetıklayın.</li>
	<li>AFM kantilini sonda tutucuya monte edin. Kafayı sisteme bağlayın ve güvercin kuyruğu kilitlerini kilitleyin. NOT: Dinamik modda biyolojik numuneleri incelemek için optimal kantileverler 2−40 N m-1 arasında değişen yay sabiti ve 2−8 nm14arasında değişen bir apeks yarıçapına sahiptir.</li>
	<li>AFM lazer ışını anahtarını açın ve Sonda Değiştir penceresinde İleri'yetıklayın.</li>
	<li>Açılan pencerede cantilever türü değişmediyse Hayır'ı tıklatın. Cantilever'i bulmak için optik hizalama düğümlerini ayarlayın. Cantilever üzerine odak ayarlayın ve İleritıklayın.</li>
	<li>Açılan pencerede odak kantilever ise Evet'e tıklayın.</li>
	<li>Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri kullanarak lazer ışınını kantilin in sonuna yerleştirin. Konuma duyarlı fotodiyot (PSPD) üzerindeki saptırılmış lazer ışınının konumunu kontrol eden düğümleri kullanarak dört dörtlük fotodiyot ile ölçülen toplam sinyali en az >1 V'a kadar en üst düzeye çıkarın. Sonda Değiştir penceresinde İleri'ye ve ardından Kapat'atıklayın.</li>
	<li>Kantilin termal stabiliteye ulaşması için 15 dk bekleyin. Gerekirse PSPD üzerinde saptırılmış lazer ışınının konumunu kolayca hazırlayın.</li>
	<li>NCM SWEEPtıklayın, salınım istenilen genlik seçin, Kullanım Aşamasıtıklayın , otomatik tıklayın ve bir yaklaşık 300 kHz olan salınım, ilk ücretsiz rezonans maksimum yakın cantilever ayarlayın 40 N m-1yay sabiti ile cantilever . NOT: Kantilin serbest rezonansının maksimumundan çıkarılması, ölçümlerin daha yüksek stabilitesini sağlar14.</li>
	<li>Numuneyi numune tutucuya yerleştirin. Uygun görüntüleme parametrelerini seçin. Tipik tarama hızı 1 x 1 μm2 ila 5 x 5 μm2'likbir tarama alanı için 0,3−1,0 Hz'dir. Gerekli tipik çözünürlük 256 x 256 ve 1024 x 1024 piksel arasındadır. Tarayıp boyutunu ve piksel numarasını seçmek için Scan Alanını tıklatın.</li>
	<li>Optik görünümü örneğe odakla. Örnek yüzeyine yaklaşmak için Yaklaşım'a tıklayın. Yaklaşma tamamlandıktan sonra AFM ucunu numunenin yüzeyinden 100 μm üzerine çıkarmak için Lift 100 μm'ye tıklayın. Örneğin optik görüntüsünü Genişlet'i tıklatın. Görünümü örnek yüzeyine odaklamak için Odak Aşaması çubuğuna tıklayın.</li>
	<li>İlgi örneği bölgesinde hareket etmek için okları kullanın. Yaklaş düğmesine basarak yüzeyi meşgul edin. Line Tcan düğmesine tıklayın ve ucun yüzeyi iyi izleyip takip edip olmadığını kontrol edin, gerekirse Set Noktasınıayarlayın.</li>
	<li>Scan düğmesine basarak örnek yüzeyini görüntülemeye başlayın. Görüntüleme sırasında, büyük görüntüleme kuvvetinden kaçınmak ve bağımsız numunelerin tutarlılığını korumak için Δ20°42'yigeçmeyen sabit bir faz değişimi rejimini koruyun.</li>
	<li>Dosya adını girin ve edinilen görüntünün kaydedileceği temel dizini seçin.</li>
</ol>4. Protein agregalarının kızılötesi nanospektroskopi ölçümleri
<ol><li>Termal stabilizasyon ölçümleri öncesinde AFM-IR sistemini ve kızılötesi (IR)lazer60 30−60 dk'yı açın. AFM-IR cihazları için tipik lazerler optik parametre osilatörleri (OPO) ve kuantum basamaklı lazerlerdir (QCL).</li>
	<li>Cihazı kontrol etmek için yerleşik yazılımı açın. Yeni bir nanoIR dosyasını açmak için dosyaya ve ardından yeni ye tıklayın. AFM-IR sistemini başlatmak için düğmeye basın.</li>
	<li>AFM-IR sistemine alet kapağını açın ve numuneyi temas modunda ölçmek için nominal yarıçapı 30 nm olan silikon altın kaplama prob ve 0,2 N/m yay sabiti monte edin.</li>
	<li>Bölüm AFM sondasında Yükle'ye tıklayın ve ardından. Sonda bölümüne odaklanArak kamerayı kantilever'e odaklamak için oklara tıklayın. Kesit örnek XY hareketi,kantilever sonuna çapraz hava yerleştirmek için oklar kullanın.</li>
	<li>Algılama lazerinin konumunu kontrol eden düğümleri, lazeri kantilinin sonunda konumlandırmak için döndürün. Dört dörtlük fotodiyot tarafından ölçülen toplamı algılamak ve en üst düzeye çıkarmak için lazer düğümlerini döndürün ve bir değere >3 V. Kavrama sapmasını -1 V'e ayarlamak için sapma düğmesini döndürün ve sonra sonrakinitıklatın. Enstrümanın kapağını kapatın.</li>
	<li>Örnek üzerinde bölüm odak kamera örnek odaklanmak için okları kullanın. Daha sonra, kesit örneğinde XY hareketi, numunenin ilgi alanında hareket etmek için okları kullanın ve yaklaşmaya tıklayın ve devreye girin.</li>
	<li>Mikroskop penceresinde, numunenin biyofiziksel özelliklerini haritalamak için ilgi kanalları nın girişleri olarak seçin. Özellikle, morfoloji için yükseklik seçin, IR emilimi için Genlik 2 ve pll frekansı harita ipucu örnek temas rezonans.</li>
	<li>Denetim penceresinin AFM tarası bölümünde, bölüm 3'teki gibi benzer parametreler kullanın (örneğin, 0.1−1.0 Hz tazyik hızı, 256 x 256 ile 1024 x 1024 piksel arasında). Örnek pürüzlülüğe göre kazançların değerini seçin: integral I = 1−10 ve orantılı P = 10−30. Ardından, bir morfoloji haritası elde etmek için teşle'ye tıklayın. NOT: Morfoloji benzer şekilde dinamik dokunma modunda ölçülebilir, ancak AFM-IR ölçümleri burada iletişim modunda gürültü oranlarına daha yüksek sinyal esahip olmak için yapılır.</li>
	<li>Morfolojinin haritalaması tamamlandıktan sonra, mikroskop penceresinde, sondayı bir agreganın üstüne konumlandırmak için yükseklik haritasına tıklayın. Daha sonra kontrol penceresinin nanoIR bölümünde, ÖRNEĞI IR lazerle aydınlatmak için start IR'ye tıklayın.</li>
	<li>Kızılötesi lazeri kantilever'e odaklamak için optimizasyonatıklayın. Bu pencerede, örneğin yüksek emiciliğe sahip olacak bir dalga numarası yazın ve ekle'yetıklayın. Protein için tipik bir değer 1655 cm-1'dir. IR lazer konumunu bulmak için tarayıp güncellemeye tıklayın ve konumunu kantilever ile hizalamak için güncelleme'ye tıklayın. Pencereyi kapat.</li>
	<li>NanoIR ayarı bölümünde, göreli alanda yüksek emicilik beklenen bir dalga numarası yazın. Daha sonra, Bant Geçiş Filtresi seçeneğini devre dışı bırakın ve sayaç okumave cantilever yanıtı hızlı Fourier dönüşümü (FFT) bakmak. FFT penceresinde cantilever rezonans frekansını okumak için yeşil imleci hareket ettirin. Kantilevers rezonans FFT tipik bir değeri yaklaşık 300 kHz olduğunu. Bu rezonans frekans değerini freq. orta alandaki genel bölüme yazın ve 50 kHz'lik bir freq. pencere kullanın. NOT: Sayaç okumasını doygunlaştırmayacak, kantilever yanıtında bozulma olmayacak ve numuneyi aşırı ısıtmayacak kadar düşük bir lazer gücü seçin.</li>
	<li>Rezonans geliştirilmiş modunu kullanmak için lazer darbe ayar penceresine tıklayın. 300 kHz'lik bir frekans merkezi, 50 kHz'lik bir ayar aralığı ve %5'lik lazer görev döngüsü seçin. Lazerin nabız hızını süpürmek için edinme üzerine tıklayın. Grafikteki imleci kullanarak, lazer darbesini, IR ışığını emen numunenin termal genişlemesinin mekanik tepkisinin frekansına ayarlayın. Ardından, örnek ve ipucu arasındaki temas rezonansını izlemek için PLL seçeneğini belirleyin. PLL penceresindeki sıfır düğmesine basın ve örnek uçlu kontak rezonansını izlemeyi etkinleştirin. Integral kazanç I = 0,5 ve orantılı kazanç P = 10 seçin. Pencereyi kapat.</li>
	<li>Optimizasyon penceresini tekrar açın ve numunenin ana emici bantlarına (amide bant I-II-III) karşılık gelen en az 3 dalga numarası ve lazerin her çipi için en az bir dalga numarası için IR lazerin konumunu bulun.</li>
	<li>Araçlar 'a tıklayın | IR Arka Plan Kalibrasyonu | Yeni. Pencerede spektroskopik ilgi bölgesini seçin (protein örneklerini incelemek için 1800−1200 cm-1); adım 4.12'de belirlenen aynı nabız oranını ve %5'lik bir görev döngüsünü seçin; hızlı edinimi tıklayın ve lazer hızı seçin, bir kuantum basamaklı lazer için tipik aralığı 20−500 cm-1arasındadır. IR lazer arka planı ölçmek için edinme'ye tıklayın. Bu arka plan spektrumu ölçülen nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumların normalleştirilmesi için kullanılacaktır. Pencereyi kapat. NOT: Hızlı lazer ve rezonans gelişmiş modu yoksa, adım 4.12'yi atlayın ve hem arka planda hem de IR spectra edinme pencerelerinde hızlı yerine adımlı spektrumları seçin. Ancak, tek bir toplu duyarlılık ulaşılamayacaktır.</li>
	<li>IR spektrum ayarlarında, 1−4 cm-1 ve en az 64x ortak ortalamalar arasında bir IR spektrum çözünürlüğü seçin. Protein aralığında (1800−1200 cm-1)nano ölçekli lokalize IR spektrumu ölçmek için satın almak tıklayın.</li>
	<li>Nano ölçekli çözümlenmiş kimyasal harita elde etmek için IR görüntüleme seçeneğini seçin, bir dalga sayısı seçin (örn. amide bandı I için 1655 cm-1) ve AFM taraması penceresindeki taramaya tıklayın.</li>
	<li>Eşleme tamamlandıktan sonra dosyaya gidin ve ölçümleri kaydedin. Morfoloji, temas rezonans ve kimyanın edinilmiş haritalarını ve nano ölçekli yerelleştirilmiş spektrumları analiz etmek için yerleşik AFM görüntü işleme yazılımını kullanın. Spectra ve Görüntüler ticari yazılımile daha ayrıntılı analiz için .csv veya .axz dosyaları olarak kaydedilebilir.</li>
</ol>5. Kesitsel boyutların görüntü işleme ve analizi
<ol><li>Düzleştirmek ham görüntüler14,17,19,41,42,59 dahili AFM görüntü işleme yazılımı veya ticari yazılım kullanarak. NOT: Agregalar, analiz eserlerinden ve ölçülen yüksekliklerinin küçümbirini önlemek için hesaplamadan maskelenmelidir.</li>
	<li>Görüntüyü 0 sipariş düzlemine uygun çıkarma ile düzleştirir.</li>
	<li>Görüntüyü düzleme düzleştirir ve 1st regresyon sırasına göre satır satır, ikinci adım görüntünün çizgi profilindeki düz taban çizgisine ulaşılıncaya kadar yinelenir.</li>
	<li>Örnek çok kalabalıksa, son derece yüksek agregalar içeriyorsa veya tarayıcı yay artefaktı mevcutsa,2.</li>
	<li>Fibril eksene dik olarak alınan bir çizgi profilinden toplam yüksekliği ve genişliği ölçün14,17,19,41,42,59.</li>
	<li>Fibril uzunluğunu fibril eksenine paralel olarak ölçün14,17,19,41,42,59.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokoldeki ilk kritik adım, 1.1 ve 1.2 adımlarında tanımlanan Aβ42 çözeltisi gibi monomerik proteinlerin hazırlanmasıdır. Oligomerik veya birleştirilmiş türlerin varlığı, toplama kinetiğinin yetersiz tekrarlanabilirliğine neden olabileceğinden ve AFM'deki eserleri ikna edebileceğinden, sonderece saf, monomerik bir çözeltiden toplama işlemini başlatmak esastır. ölçümler (örn. fibriller türler agregasyonun ilk aşamalarında belirgin olacaktır), bu da verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir....

Dünya çapında 40 milyondan fazla insan şu anda nörodejeneratif bozukluklar etkilenir, Alzheimer gibi (AD)1 ve Parkinson (PH)2 hastalıkları. Daha genel olarak, elliden fazla patoloji protein misfolding ve agregasyon ile moleküler düzeyde ilişkilidir, çözünmez fibriller protein agregalarının çoğalmasına yol açan bir süreç, amiloid mevduat olarak bilinen3, 4. Nörodejenerasyonun moleküler kökenleri ve amiloid oluşumuna yol açan proteinlerin protein konformasyonel değişiklikleri ile bağlantıları, ancak, heterojen yüksek düzeyde nedeniyle büyük ölçüde belirsiz liğini koruyor, geçici doğa ve nanoölçek patolojik agregaların boyutları4,5.
Son birkaç on yıl içinde protein yapıları son derece başarılı araştırmalar x-ışını kristalografisi, kriyo-elektron mikroskobu ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi 5 dahil olmak üzere toplu yöntemlerin kullanımı, yaygın olarak dayanmaktadır5, 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9. Teknikleri bu sınıf içinde, kızılötesi (IR) spektroskopi proteinler 8 gibi biyolojik sistemlerin kimyasal özelliklerini çözmek için hassas bir analitik araç olarak ortayaçıkmıştır. IR yöntemleri, protein sekonder ve kuaternary yapısal değişikliklerin yanlış katlama ve toplama sırasında nicelleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, mikroskobik düzeyde daha fazla şifreyi çözmek için onların toplama sırasında protein karmaşık serbest enerji manzara dahil mekanistik ayrıntıları, önemli bir ilerleme karmaşık genişletmek için kimyasal kinetik araçların geliştirilmesi olmuştur amiloid fibrilsoluşumu5,6,7,10,11,12dahil olmak üzere kendi kendine montaj yolları . Ancak, toplu spektroskopik yöntemler, çözeltide bulunan veya belirli mikroskobik adımlarda yer alan türlerin heterojen topluluğu hakkında sadece ortalama bilgi sağlayarak bireyin biyofiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar. nanoölçekli düzeyde zorlu toplu türler13,14.
Son yıllarda ışığın kırınım sınırından daha küçük ölçeklerde çalışma kapasitesine sahip çeşitli mikroskopi teknikleri ortaya çıkmıştır. Bu yöntem sınıfı elektron mikroskobu (EM) ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) içerir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) bir numunenin iki boyutlu (2D) görüntülerini sağlarken, AFM son yıllarda üç boyutlu (3D) morfolojileri incelemek için güçlü ve çok yönlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. nanometre çözünürlüğü 13 , 14,15,16,17,18,19, 20.000 , 21.000 , 22.000 , 23.000 , 24.000 , 25.000 , 26.000 , 27- AFM ile protein toplama eğitiminin ardındaki mantık, bu yaklaşımınçözelti13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. Özellikle, zaman bir fonksiyonu olarak örnek izleyerek, AFM mümkün takip etmek ve amiloid oluşumu 23 yollarını görselleştirmek için yapar, örnek içinde türlerin morfolojisi evriminin araştırılmasına olanak sağlar23, 25,38,39,40,41,42. Ayrıca, AFM kesitsel yükseklikleri ve çözelti13mevcut bireysel türlerin uzunlukları gibi yapısal parametrelerin sayısallaştırılması nı sağlar 13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44.000 , 45.000 , 46.000 , 47.000 , 48- Ancak, morfoloji gibi tek bir biyofiziksel özelliğin incelenmesi, heterojen ve karmaşık biyolojik sistemleri incelerken genellikle yeterli değildir. AFM, SEM veya TEM görüntüleme yöntemleri tek başına nano ölçekte amiloid agregalarının heterojen türlerinin kimyasal özelliklerini kolayca ortaya çıkaramaz.
Bu ölçekte heterojen biyolojik örneklerin analizi için önemli bir ilerleme son zamanlarda kızılötesi nanospektroskopi (AFM-IR)24,26protein toplama alanına geliştirme ve uygulama ile yapılmıştır, 38,42,49,50,51,52. Bu yenilikçi yöntem, AFM'nin (~1−10 nm) uzamsal çözünürlüğünün IR'nin kimyasal analiz gücüyle birleşiminden yararlanır. AFM-IR tekniği, IR lazeri tarafından yönlendirilen fototermal rezonans etkisinin ölçümü ve AFM ucu ile araştırılanın camı termal genleşmenin ölçümü üzerine dayanır. Örnek, geleneksel kızılötesi spektroskopi24,42,52,53 gibi, toplam iç yansıma doğrudan üst veya alttan IR lazer ile aydınlatılabilir . IR lazer kilohertz (1−1000 kHz) yüzlerce sırayla tipik frekansları ile darbeli olabilir ve geniş bir spektral aralık üzerinde ayarlanmış, genellikle arasında 1000−3300 cm-1. Lazer kaynağı ~30 μm çapında bir alanı kapsa da, AFM-IR tekniğinin mekansal çözünürlüğü, sistemin yerel ısıgenliğini algılayan AFM uç çapı ile nominal olarak belirlenir. AFM-IR biyolojik numuneleri incelemek için uygundur, çünkü IR sinyali kalınlığı 1−1,5 μm'ye kadar orantılıdır ve ortaya çıkan IR spektrumları genellikle ilgili FTIR iletim spektrumları13,54 ile uyum içindedir ,55. Bu nedenle, spektroskopide yerleşik analiz yöntemleri, kimyasal değişimlerin incelenmesi, bant şekli değişimi ve ikinci türevlerin analizi ile de-kıvrım gibi kolayca uygulanabilir52. Genel olarak, AFM'nin uzamsal çözünürlüğünü IR spektroskopisinin kimyasal tanıma gücüyle birleştiren AFM-IR, nano ölçekte bir numunenin çok çeşitli morfolojik, mekanik ve kimyasal özelliklerinin aynı anda elde edilmesini sağlar.
Burada, in vitro floresan tahlilleri, yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleme ve nano ölçekli AFM-IR kombinasyonunu kullanan protein toplama sürecinin karakterizasyonu için bir protokol gösterilmektedir. Bu kombine yaklaşım, protein agregalarının oluşturduğu bireysel mikro damlacıkların kimyasal ve yapısal özelliklerinin incelenmesinde, sıvı-sıvı protein faz ayrıştırma çalışmalarında ve nanoölçekte23, 26,38,45,50,53,bireysel toplu türlerin heterojenite ve biyofiziksel özelliklerini araştırmak , 56,57.

<table><tbody><tr><td>AFM-IR sistemi</td><td>Anasys Instruments</td><td>nanoIR 2 veya 3</td><td>Temas ve rezonans modunda termal genleşmeyi ölçmek için sistemler</td></tr><tr><td>Corning 96 kuyulu Yarım Alan Siyah/Şeffaf Alt Polistiren NBS</td><td>Mikroplaka Corning</td><td>3881</td><td></td></tr><tr><td>Corning Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı</td><td>Corning</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Çift Taraflı Yapışkan Diskler</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG3347N</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega BMG</td><td>Labtech</td><td>415-101</td><td>Plaka Okuyucu</td></tr><tr><td>Mika Disk 10mm V1</td><td>AGAR Bilimsel</td><td>AGF7013</td><td></td></tr><tr><td>Park NX10 AFM sistemi</td><td>Park</td><td>Sistemleri N/A</td><td>Atomik Kuvvet Mikroskobu</td></tr><tr><td>Ornitorenk Ultra Düz Altın Cips</td><td>Ornitorenk Teknolojileri</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td></td></tr><tr><td>PPP-NCHR-10 konsollar</td><td>Park Sistemleri</td><td>PPP-NCHR-10</td><td></td></tr><tr><td>Protein LowBind Tüpleri, 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>Silikon altın kaplı konsollar</td><td>Anasys Instruments</td><td>PR-EX-nIR2</td><td></td></tr><tr><td>SPM Numune Diskleri 12mm</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGF7001</td><td></td></tr></tbody></table>

bireysel protein agregalarının kızılötesi nanospektroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu ile karakterizeleştirilmesi

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Protein yanlış katlama ve toplama olgusu, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif durumlarla ilişkili yüksek heterojen protein agregalarının oluşumuna neden olur. Özellikle düşük molekül ağırlıklı agregalar, amiloid oligomerler, jenerik sitotoksik özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir ve demans birçok formları nörotoksinler olarak karıştığı gösterilmiştir. Konvansiyonel yapısal yöntemlerle incelenmesi zor olan bu agregaların morfolojik, yapısal ve kimyasal özelliklerini karakterize etme gibi zorlu bir görevi ele almak için atomik kuvvet mikroskobu (AFM) dayalı yöntemlerin kullanımını gösteriyoruz. heterojenlik leri ve geçici doğası nedeniyle yöntemler veya toplu biyofiziksel yöntemler. Tarama sondamikroskopi yaklaşımları artık nanometre çözünürlüğü ile amiloid agregaların morfolojisini araştırma yeteneğine sahiptir. Burada, AFM'nin yüksek çözünürlüğünü ve IR spektroskopisinin kimyasal tanıma gücünü aynı anda kullanan kızılötesi (IR) nanospektroskopinin (AFM-IR) daha ileri gidebileceğini ve bireyin yapısal özelliklerinin karakterizasyonunu mümkün kılabilir. protein agregaları, ve böylece toplama mekanizmaları içine anlayışlar sunuyoruz. Tarif ettiğimiz yaklaşım, protein derlemelerinin küçük moleküller ve antikorlarla etkileşimlerinin araştırılmasına da uygulanabildiği için, tanı veya tedavi etmek için yeni terapötik bileşikler geliştirmek için temel bilgiler sunabilir. nörodejeneratif bozukluklar.

Aβ42 toplamanın temsili bir zaman rotası, ThT floresan tetkik ile ölçüldüğünde, Şekil 1'degösterilmiştir. Toplama işlemi genellikle bir sigmoidal eğri ile karakterizedir, bir gecikme fazı başlangıçta gözlenen nerede, ve dik bir büyüme aşaması tarafından takip, eğri bir plato ulaşmadan önce bir denge sabit devlet ulaşıldığında6,7 , 58. Toplama işlemleri58ile ilgili moleküler a...

Biz kızılötesi nanospectroskopi ve yüksek çözünürlüklü atomik kuvvet mikroskobu oligomerik agregalar ve amiloid fibrils içine protein kendini montaj sürecini görselleştirmek için uygulama açıklar, yakından başlangıç ve geliştirme ile ilişkilidir insan nörodejeneratif bozuklukların geniş bir yelpazede.

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Atomik kuvvet mikroskobuna dayalı yöntemler, nano ölçekteki biyomoleküler prosesleri morfolojik kimyasal veya yapısal çözünürlükle karakterize etmeyi mümkün kılarak, son olarak biyoloji üzerine yeni bir ön gözlem penceresi açmaktadır. Tek moleküllü yöntemler, protein agregasını anlamak için özellikle geçerli olan yüksek heterojen sistemlerin araştırılmasını sağlar. Tek molekülleri sırt yaklaşımlarıyla birleştirerek, proteinlerin davranışları, insan hastalığı ile bağlantıları ve başarılı olabilecek farmakolojik müdahaleler tasarlamaları hakkında temel bilgiler edinebiliriz.Ayrıca, bu yöntem, ilaç teslimatı, uygulamaları ve diğer biyoteknolojik amaçlar için biyomalzemelerin kimyasal ve yapısal özelliklerini incelemek için başarıyla uygulanabilir. Yüksek çözünürlük için doğru AFM parametrelerini ayarlamak başlangıçta zor olabilir ve fibriller agregalarınızı ölçerken AFM'nizi kolayca ayarlamak kolaydır. AFM görüntülemeden 30 dakika önce, AFM sistemini açın ve kurulum ve sondayı tıklatın.Sonda değiştirme penceresinde, Z odak aşamasını hazırlamak için hemen tıklatın. Açıksa AFM ışın düğmesini kapatın ve güvercin kuyruğu kilitlerini açın. Kafanın sistemden bağlantısını kesin ve sonda deği

characterizing-individual-protein-aggregates-infrared

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Görüntüleme protein büyüklükler bir nearfield kızılötesi mikroskop montaj açıklanmıştır.

Kurul, Tuning ve Protein Görüntüleme için bir Apertureless Yakın Alan Kızılötesi Mikroskop Kullanımı

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bir protein fotoreseptörünün yapısını araştırmak için bir yöntem bu yazıda açıklanmıştır. PeakForce Kantitatif Nanomekanik Özellik Haritalama (PF-QNM), mika yüzeyindeki bozulmamış protein dimerlerini ortaya çıkarır.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Atomik Kuvvet Mikroskopisi-Kızılötesi Spektroskopi (AFM-IR), bakteriyel çalışmalar için güçlü bir platform sağlayarak nano ölçekli çözünürlük elde etmeyi sağlar. Her ikisi de, hücre altı değişikliklerin haritalandırılması (örneğin, hücre bölünmesi üzerine) ve kimyasal bileşimin karşılaştırmalı çalışmaları (örneğin, ilaç direncinden kaynaklanan) bakterilerde tek bir hücre düzeyinde yapılabilir.

Atomik Kuvvet Mikroskopisi, Tek Bakteri Kimyasını Araştırmak için Bir Araç Olarak Kızılötesi Spektroskopi ile Birleştirildi

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Nötron geri saçılma spektroskopisi, proteinlerin ps-ns dinamiklerine ve hidrasyon suyuna tahribatsız ve etiketsiz bir erişim sunar. İş akışı, amiloid proteinleri üzerine iki çalışma ile sunulmaktadır: agregasyon sırasında lizozimin zamanla çözülmüş dinamikleri ve tau'nun lif oluşumu üzerine hidrasyon suyu dinamikleri üzerine.

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Bu protokol, üç boyutlu çok polimerik numunelerin karakterizasyonunda fototermal nano ölçekli kızılötesi spektroskopinin performansını değerlendirmek için atomik kuvvet mikroskobu ve nano ölçekli kızılötesi spektroskopinin uygulanmasını açıklar.

Çok Fazlı Polimerik Sistemleri Keşfetmek için Nano Ölçekli Kızılötesi Spektroskopideki Gelişmeler

Burada, sıvı–sıvı faz ayrılmış kondensatları gözenekli, düşük eriyen agaroz hidrojel matrisi içinde fiziksel olarak immobilize etmenin ve iç sıvı dinamiklerini bozmadan sağlam bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, damla tortulması, birleşme ve yüzey ıslatma eserlerini en aza indirerek, saatler boyunca tekrarlanabilir görüntüleme ve nicel biyofiziksel analiz mümkün kılmaktadır.

Düşük Eriyen Agararoz hidrojellerinde Stabilize Edici Protein ve Protein—RNA Kondensatları Nicel Biyofiziksel Ölçümler İçin

Keşfedin kızılötesi nanospektroskopi ve atomik kuvvet mikroskobu ile bireysel protein agregalarının karakterizasyonunu. Bu yöntemler, nörodejeneratif hastalıklarda protein toplanmasını anlamak için güçlü araçlar sunar.

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

Daha fazla video keşfet