Name: Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Öğrenin, akut beyin dilimlerinde tek sinapta glutamat salınımı ve alımını iGlu u sensörüyle değerlendirme yöntemini. Huntington hastalığında sinaptik işlev bozukluklarını belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma CHDI (A-12467), Alman Araştırma Vakfı (Exc 257/1 ve DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) ve Charité intramural Araştırma Fonları tarafından desteklenmiştir. K. Török, St. George's, Londra Üniversitesi ve Liverpool Üniversitesi N. Helassa'ya iGluu plazmid ve birçok yararlı tartışma için teşekkür ederiz. D. Betances ve A. Schönherr mükemmel teknik yardım sağladı.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Deneyler genel ilgi ile ilgili bir soru - sinaps bağımsızlığı ve nörodejenerasyon seyrinde olası kaybı, ve biz yaşlı (>1 yıl) fareler akut beyin dilimlerietkilenen sinapsları belirlemek için yeni bir yaklaşım açıklar. Son zamanlarda tanıtılan glutamat sensörü iGluu gelişmiş kinetik özellikleri yararlanarak deneyler sinaptik glutamat salınımı ve alımı arasındaki ilişkiyi daha önce mümkün olmamıştır bir şekilde aydınlatmak.
Glutamat temizliğinin sinapsların işlevi ve bakımı üzerindeki...

Bir "üniter bağlantı" ait her sinaptik terminalin göreceli etkisi (yani, 2 sinir hücreleri arasındaki bağlantı) genellikle postsinaptik nöron ilk segmenti üzerindeki etkisi ile değerlendirilir1,2. Postsinaptik nöronlardan somatik ve / veya dendritik kayıtları en yaygın temsil ve, şimdiye kadar, aynı zamanda en verimli bir yukarıdan aşağıya veya dikey perspektif 3 altında bilgi işleme açıklığa kavuşturmak için anlamına gelir3,4,5. Ancak, kendi ayrık ve (kemirgenler) örtüşen olmayan toprakları ile astrositlerin varlığı sinyal değişimi, entegrasyon ve sinaptik sitelerde senkronizasyon yerel mekanizmalar dayalı yatay bir perspektif katkıda bulunabilir6,7,8,9,10.
Astroglia oyun olduğu bilinmektedir çünkü, genel olarak, nörodejeneratif hastalık patogenezinde önemli bir rol11,12 ve, özellikle, bakım ve glutamaterjik sinapsların plastisite bir rol13,14,15,16, bu sinaptik performans değişiklikleri çeşitli lif ile aksesuar lif ortak hedef alanında astrosit durumuna uygun olarak gelişmeye düşünülebilir. Sağlık ve hastalıkta hedef/astroglia kaynaklı yerel düzenleyici mekanizmaları daha fazla araştırmak için, bireysel sinapsların değerlendirilmesi gerekmektedir. Mevcut yaklaşım, fonksiyonel glutamat salınımı ve açıklık göstergelerinin aralığını tahmin etmek ve hareket başlatmaile en yakından ilişkili beyin bölgelerindeki işlevsiz (veya iyileşmiş) sinapsları tanımlamak için kullanılabilecek kriterleri tanımlamak için çalışılmıştır (yani, her şeyden önce motor korteks ve dorsal striatumda).
Striatum içsel glutamaterjik nöronlar yoksun. Bu nedenle, ekstrastriatal kökenli glutamaterjik afferents belirlemek nispeten kolaydır. İkincisi çoğunlukla medial talamus ve serebral korteks kökenli(bkz. 17,18,19,20 daha fazlası için). Kortikotoriatal sinapslar kortikal tabakalarda lokalize piramidal nöronların aksonlar tarafından oluşur 2/3 ve 5. İlgili aksonlar, piramidal yolu (PT) oluşturan bir lif sistemi aracılığıyla ikili intra-telensefalik (IT) bağlantıları veya ipsilateral bağlantılar oluştururlar. Ayrıca BT ve PT tipi terminallerin sürüm özellikleri ve boyutu21,22farklı olduğu ileri sürülmüştür. Bu veriler göz önüne alındığında, bir de glutamat kullanımı bazı farklılıklar bekleyebilirsiniz.
Striatum Huntington hastalığı en çok etkilenen beyin alanıdır (HD)5. İnsan HD ciddi bir genetik kalıtsal nörodejeneratif bozukluktur. Q175 fare modeli HD hipokinetik-sert formu hücresel temelini araştırmak için bir fırsat sunuyor, parkinsonizm ile çok ortak bir devlet. Yaklaşık 1 yaşında başlayan, homozigot Q175 fareler (HOM) hipokinezya belirtileri sergiler, açık bir alanda hareket olmadan harcanan zaman ölçerek ortaya23. Heterozigot Q175 fareler (HET) ile mevcut deneyler HOM gözlenen önceki motor açıkları doğruladı ve ek olarak, gözlenen motor açıkları astrositik eksitatif amino asit taşıyıcı 2 protein (EAAT2) kortikostrital sinaptik terminalleri yakın çevresinde azaltılmış bir düzeyde eşlik ettiğini gösterdi24. Bu nedenle astrositik glutamat alımı bir açığı disfonksiyon ya da ilgili sinapsların bile kaybına yol açabilir hipotez olmuştur25,26.
Burada, serbest nörotransmitter miktarına göre tek sinaps glutamat açıklık değerlendirmek için izin veren yeni bir yaklaşım açıklar. Yeni glutamat sensörü iGluu kortikostal piramidal nöronlarda ifade edildi. Katalin Török27 tarafından geliştirilen ve daha önce tanıtılan yüksek yakınlık ama yavaş glutamat sensörü iGluSnFR28bir değişiklik temsil eder. Her iki sensör de gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) türevleridir. Spektral ve kinetik özellikler için helassa ve ark.27'yebakınız. Kısaca, iGluu hızlı de-aktivasyon kinetik ile düşük afinite sensörü ve bu nedenle özellikle iyi glutamat serbest sinaptik terminallerde glutamat açıklık çalışmak için uygundur. iGluu'nun dissosilasyon süresi sabiti, 20 °C'de tau'yu 2,1 ms, 34 °C27sıcaklıkta tahmin edildiğinde 0,68 ms'lik bir değere sahip bir durmuş akış cihazında belirlenmiştir.off 2-foton mikroskop altında organotipik hipokampal kültürlerin CA1 bölgesinde spiral lazer taraması ile 34 °C'de incelenen tek Schaffer teminat terminalleri, ortalama 2,7 ms'lik bir çürüme süresi sergiledi.

<table><tbody><tr><td>Stereo microsope</td><td>WPI</td><td>PZMIII</td><td>Hassas Stereo Zoom Binoküler Mikroskop</td></tr><tr><td>Stereotaksik çerçeve</td><td>Çalma</td><td>51500D</td><td>Dijital Laboratuvar Yeni Standart stereotaksik çerçeve</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı matkap ekipmanı</td><td>Çalmak</td><td>514439V</td><td>Foredom K1070 kromoter Kiti</td></tr><tr><td>Enjeksiyon sistemi</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Özet Stereotaksik Enjektör (QSI)</td></tr><tr><td>Hamilton şırınga 5 ve mikro; l</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>75RN Syr (26s / 51/2)</td></tr> <tr><td>Lazer konumlandırma sistemi</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA-40</td><td>UGA-40</td></tr><tr><td>iGluu uyarımı için mavi lazer</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-473-020-S</td><td>473 nm lazer 473 nm Rapp</td></tr><tr><td></td><td>OptoElectronic</td><td>ROE TB-355-405-473</td><td>Dikroik</td></tr><tr><td>1P dik mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1066-600</td><td>Axioskop 2 FS Plus</td></tr><tr><td>Objektif 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td>421480-9900</td><td>W Plan-Apochromat</td></tr><tr><td>4x objektif</td><td>Carl Zeiss</td><td>44-00-20</td><td>Achroplan 4x/0,10</td></tr><tr>iGluu <td>Omega optik</td><td>XF2030</td><td></td><td>için dikroik ayna</td></tr><tr><td>iGluu</td><td>Omega optik</td><td>XF3086</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik ayna</td><td>Omega optik için emisyon filtresi</td><td></td><td></td>QMAX_DI580LP</tr><tr><td>Otofloresan subtrs için emisyon filtresi.</td><td>Omega optik</td><td>QMAX EM600-650</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS kamera</td><td>Andor</td><td>ZYLA4.2PCL10</td><td>ZYLA 4.2MP Plus</td></tr><tr><td>Edinme yazılımı</td><td>Andor</td><td>4.30.30034.0</td><td>Solis</td></tr><tr><td>AD/DA dönüştürücü</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895035</td><td>InstruTECH LIH8+8</td></tr><tr><td>Satın alma yazılımı</td><td>HEKA Elektronik</td><td>895153</td><td>TIDA5.25</td></tr><tr><td>Elektrot konumlandırma sistemi</td><td>Sutter Enstrümanı</td><td>MPC-200</td><td>Mikromanipülatör</td></tr><tr><td>Elektrik stimülatörü</td><td>Charite atölyeleri</td><td>STIM-26</td><td></td></tr><tr><td>Dilimleyici</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td>Vibrotom</td></tr><tr><td>Kahverengi/Alevli tip çektirme</td><td>Sutter Instr</td><td>SU-P1000</td><td>P-1000</td></tr><tr><td>Enjeksiyon pipetleri için cam tüpler</td><td>WPI</td><td>1B100F3</td><td></td></tr><tr><td>Stimülasyon için cam tüpler pipetler</td><td>WPI</td><td>R100-F3</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksin</td><td>Abcam</td><td>ab120054</td><td>TTX</td></tr><tr><td>iGluu plazmid</td><td>Addgene</td><td>106122</td><td>pCI-syn-iGluu</td></tr><tr><td>Q175 fareler</td><td>Jackson Lab</td><td>27410</td><td>Z-Q175-KI</td></tr></tbody></table>

normal ve huntington farelerden akut beyin dilimlerinde glutamat salınımı ve alımının tek sinaps göstergeleri

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Sinapslar, birbirleri üzerinde bağımsız olarak çalışan son derece bölümlere ayrılmış fonksiyonel birimlerdir. Huntington hastalığı (HD) ve diğer nörodejeneratif bozukluklar, bu bağımsızlık yetersiz glutamat temizliği ve ortaya çıkan dökülme ve dökülme etkileri nedeniyle tehlikeye olabilir. Presinaptik terminallerin ve/veya dendritik dikenlerin değiştirilmiş astrositik kapsamı nın yanı sıra glutamat salınım bölgelerindeki glutamat taşıyıcı kümelerinin küçültülmesi dis-/hiperkinezi semptomlarına yol gösteren hastalıkların patogenezinde de yer almıştır. Ancak HD'de glutamaterjik sinapsların disfonksiyonuna yol açan mekanizmalar iyi anlaşılamamıştır. Sinaps görüntülemenin iyileştirilmesi ve uygulanması, hareketlerin başlatılmasını engelleyen mekanizmalara yeni Bir ışık yayan veriler elde ettik. Burada, yeni genetik olarak kodlanmış ultra hızlı glutamat sensörü iGluu,geniş alan optik, bilimsel CMOS (sCMOS) kamera, 473 nm lazer ve lazer konumlandırma sistemi kullanarak tek sinaps çözünürlüğü elde etmek için nispeten ucuz bir yaklaşımın temel unsurları nı açıklıyoruz. Glutamat geçici leri, perisynaptic [Glu]'nun çürüme (TauD) zaman sabitinde yansıtıldığı gibi, aktif bölge ve ii) glutamat alımının yanındaki glutamat konsantrasyonunun maksimal yüksekliğine (Glu] dayalı olarak, tek veya birden fazla pikselden i) glutamat salınımı tahminlerini elde etmek için oluşturulmuştur. Dinlendirme bouton boyutundaki farklılıklar ve kısa süreli plastisitenin zıt desenleri, kortikotonsefalik (BT) veya piramidal yol (PT) yoluna ait olarak kortikokostatal terminallerin tanımlanmasında ölçüt görevi görür. Bu yöntemleri kullanarak, pt tipi kortikozorsial sinapsların ~%40'ında semptomatik HD farelerde yetersiz glutamat açıklığı sergilenerek bu sinapsların eksitotoksik hasar riski altında olabileceğini keşfettik. Sonuçlar, hipokinetik fenotipli Huntington farelerinde işlevsiz sinapsların biyomarkeri olarak TauD'un yararlılığının altını çizer.

Kortikosriatal glutamaterjik varislerin iki tip belirlenmesi BT ve PT afferents katman 2 /3 ve 5, sırasıyla kaynaklanır ve ipsilateral ve kontralateral (sadece BT terminalleri) striatum diferansiyel sonuçları ve sonlandırma desenleri sergiler. Hala çok az glutamat salınımı ve hareketlerin başlatılması sırasında gözlenen tekrarlayan aktivasyon koşulları altında açıklık özellikleri hakkında bilinmektedir, ama iyi ilgili glutamat serbest varisleri boyutu22farklı olduğu belgelenmiş...

Erişkin farelerden gelen akut dilimlerde tek kortikostatal glutamaterjik sinapslarda glutamat salınımı ile açıklık arasındaki dengeyi değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Bu protokol glutamat tespiti için floresan sensör iGluu, sinyal alımı için bir sCMOS kamera ve odak lazer aydınlatma için bir cihaz kullanır.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Hızlı glutamat sensörünü ifade eden tek sinapsların yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, verici salınımı ve alımı arasındaki yerel uyumsuzluğun algılanmasını sağlar. Hastalık durumunda, bu yöntem işlevsiz sinapsları tanımlamak için kullanılabilir. Otofloresan düzeltme için, ilk olarak, tek foton mikroskobun kayıt odasına ilgi farebir beyin dilimi yerleştirin.Oksijenli, yapay beyin omurilik sıvısı dilim batırın ve dorsal striatum bulmak için 20x su daldırma hedefi kullanın. Doku hareketini en aza indirmek için bir platin arp üzerinde bir naylon ızgara ile dilimleri düzeltmek ve 63x su daldırma hedefine geçin. 510 nanometre yüksek geçiş filtresi kullanarak, birlikte otofloresan ve glutamat sensörü pozitif yapıların bir görüntü elde.600 nanometre yüksek geçiş filtresi kullanarak, tek başına otofloresan yapıların ikinci bir görüntü elde. Aralığı tanımlamak için, kırmızı ve sarı görüntüleri ölçeklendirmek için en parlak ve 10 en koyu pikselin ortalama yoğunluklarını kullanın. Ardından, sarı eksi kırmızı görüntünün bir çıkarını gerçekleştirin ve çıkarbouton'un uygun görselleştirilmesi için standart bir 8 bit TIFF dosyası oluşturmak için çıkarılan görüntüyü yeniden ölçeklendirin.Duyarlı bou

single-synapse-indicators-glutamate-release-uptake-acute-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu video, bir fare beyin dilimindeki tek kortikostriatal sinapslarda glutamat salınımının ve klerensinin değerlendirilmesini göstermektedir. Elektriksel stimülasyon, sinapsta glutamat salınımını kolaylaştırır. Serbest bırakılan glutamat, sensör proteininin zamanla bozulan floresansını değiştirerek salım ve temizleme verimliliğini gösterir.

Bir fare beyin diliminde tek bir nöron sinapsında glutamat salınımının ve klerensinin analiz edilmesi

Kaynak: McLeod, F.,  et al. Hipokampal Kemirgen Beyin Dilimlerinde Sinaps Yoğunluğunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017). Bu video, konfokal immünofloresan analizi kullanarak hipokampal beyin dilimlerinde sinaptik belirteçleri görselleştirmek için bir yöntemi göstermektedir. Dilimler, presinaptik ve postsinaptik belirteçleri hedef alan primer antikorlarla immün boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Etiketli belirteçler daha sonra sinaptik mimariyi kolokalizasyonları...

İmmünofloresan Kullanılarak Fare Hipokampal Dilimlerinde Sinapsların Mikroskobik Analizi

Biz eksitotoksisite kaynaklı beyin hasarı dahil moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilecek bir beyin kesit modeli geliştirdik. Bu teknik açıdan olgun beyin dokusunu oluşturur ve kısmen sağlam nöronal devreleri, hücresel etkileşimleri ve postsinaptik bölmeleri korurken, deney için gerekli olan hayvan sayısı azalır.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Bu tam hücre patch-kelepçesi ve fare beyin, akut doku dilimleri dendrit ve hipokampal nöronlar dikenler Hücre içi sodyum transient çoklu foton görüntüleme ile, nöro-aktif bileşiklerin fokal UV uyarımlı foto-aktivasyon kombinasyonunu tarif eder.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Burada, tonik ve enzim-bağlı mikroelektrot dizileri (MEA) kullanılarak in vivo olarak fazik hücre dışı glutamat değişiklikleri ölçmek için bir uzamsal ve zamansal hassas bir yöntem için kurulum, yazılım navigasyon ve veri analizi tarif eder.

Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için

Doğru bir şekilde belirlenmesi ve Hipokampal dilimleri ayirt kullanarak sinapslarda analiz için bir protokol bu makalesinde ana hatlarıyla.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Bu makale, farelerde yatay hipokampal beyin dilimleri elde etmek için sistematik bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu metodolojinin amacı, dentat girus ile ilgili nörolojik süreçleri değerlendirmek için perforant yol ve yosunlu lif yolu gibi hipokampal lif yollarının bütünlüğünü korumaktır.

Fare Beyninin Yatay Hipokampal Dilimleri

Bu yöntem, akut beyin dilimleri kullanılarak endojen monoamin salınımının tespiti için basit bir teknik sunar. Kurulum, monoamin salınımı için bir doku tutucu içeren 48 kuyulu bir plaka kullanır. Serbest bırakılan monoamin, elektrokimyasal algılama ile birlikte HPLC tarafından analiz edilir. Ek olarak, bu teknik ilaç keşfi için bir tarama yöntemi sağlar.

Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Öğrenin, akut beyin dilimlerinde tek sinapta glutamat salınımı ve alımını iGlu u sensörüyle değerlendirme yöntemini. Huntington hastalığında sinaptik işlev bozukluklarını belirlemeye yardımcı olur.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Daha fazla video keşfet