Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.

Bugün size ısıkaynaklı antijen alma protokolünün varyantlarını göstermek istiyoruz. Nötrofil elastaz antijeni ve histones için gerekli olan yüksek pH değeri için daha düşük sıcaklık yararları birleştirir. Bu teknik, fare veya erkeklerden parafin dokularda, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar, NETs çalışma sağlar.

Ve aynı zamanda arşivlenmiş malzeme veya retrospektif çalışma çalışma kabul edilir. İlk olarak, raflarda hazırlanan slaytlar yerleştirin ve beş dakika her biri için ters sırayla dehidratasyon ve temizleme için kullanılan ortam içine batırın. Sonra, 70 santigrat derece bir sıcaklık kontrollü sıcak plaka ile bir su banyosu ısı.

Su banyosu içine ısı kaynaklı epitop alma tampon ve% 10 gliserol ile dolu bir kavanoz yerleştirin. Arabellek 70 santigrat dereceye ulaştığında, rafı slaytlarla birlikte arabellek kavanozuna yerleştirin. Slaytları 70 derecede 120 dakika kuluçkaya yatırın.

Bundan sonra, su banyosu kavanoz çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Soğutulmuş bölümleri iyonize su yla üç kez ve Bir kez TBS ile durulayın. Haddelenmiş filtre kağıdı veya pamuklu bez kullanarak, slaytlar üzerindeki bölümler arasındaki sıvıyı dikkatlice çıkarın ve bölümleri nemli bıraktığından emin olun.

Sonra, her bölüm etrafında bir bariyer oluşturmak için bir hidrofobik bariyer kalem kullanın. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında tamponu bloke eden bölümü 30 dakika kuluçkaya yatırın. Mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonu ile tampon engelleme birincil antikorlar seyreltmek.

Slaytlardan engelleme tamponu çıkarın ve seyreltilmiş birincil antikorları ekleyerek kurumasını önlemek için yeterli hacimden emin olun. Nemli kabı kapatın ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatın. Ertesi gün, beş dakika süren her yıkama ile TBS ile bölümleri üç kez yıkayın.

Tampon engelleme ikincil antikorların çalışma bir çözüm hazırlayın. İkincil antikor solüsyonu ile doku bölümlerini kaplayın ve slaytları nemli bir kap taslayın. Nemli kabı kapatın ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatın.

Bundan sonra, tbs ile üç kez ve her yıkama beş dakika süren suda bir kez bölümleri yıkayın. Yıkanmış bölümleri montaj ortamı ile kaplayın ve kabarcık oluşumunu önlerken kapak camı uygulayın. Montaj ortamı katıhale geldikten sonra, immünfloresansı analiz etmek için uygun bant geçiş filtrelerine sahip bir konfokal mikroskop veya geniş alanlı bir mikroskop kullanın.

Slayt tarayıcısı kullanarak tüm bölümleri sayısallaştırmak için negatif ve pozitif denetimleri kullanarak floresan yoğunluğunu ayarlayın. Nötrofil elastaz boyama kullanarak, nötrofil açısından zengin alanları bulmak ve nötrofil elastaz sinyali granüler veya ekstrasellüler olup olmadığını kontrol etmek için bu alanlarda yakınlaştırmak. Sinyal hücre dışı ise ve hem histon hem de DNA boyama ile çakışıyorsa nötrofil ekstrasellüler tuzakları elde edilmiştir.

Bu çalışmada, NET bileşenleri parafin gömülü dokuda başarıyla tespit edilir, hem insan hem de minnet kökenli. Doku kesitleri iki ila üç mikrometre arasında bir kalınlığa sahipse, 10x veya 20x hedefleri kullanılarak geniş alan mikroskobu ile analiz edilebilir. Boyamayı doğru değerlendirmek için hem negatif hem de pozitif örnekler işlenmiştir.

İnsan apandisit dokusunun temsili bir bölümü NE, H2B ve Hoechst 33342 için boyanmış dokuları gösterir. Soldaki görüntüler, sağdaki görüntüler çok sayıda nötrofil içeren ancak NET'lerin bulunmadığı aynı bölümün farklı bir bölgesinden iken, NET'lerin bulunduğu bölümün bir alanından dır. Üç NET bileşeni de genellikle yaylı hücre dışı yapılarda kolokalize olduğundan, büyük NET oluşumuna sahip alanlar düşük büyütmelerde bile kolayca bulunabilir.

Bu yeşil, kırmızı ve mavi için pozitif örtüşen sinyalleri piksel kullanarak mor bir bindirme oluşturmak için görüntü analizi yazılımı kullanılarak ölçülebilir beyazımsı ekstrasellüler lifler olarak üç kanal bindirme görünür. Daha yüksek çözünürlük için odak dışı bulanıklığı en aza indirmek için confocal mikroskoplar veya deconvolution içeren geniş alanlı mikroskoplar kullanılmalıdır. Aynı insan apandisit örneğinden NET açısından zengin bir alanın konfokal yığınının maksimum projeksiyonu, NE'nin granüllerde bulunduğunu, ancak aynı zamanda H2B ve DNA ile birlikte bulunduğu nda da bol miktarda hücre dışı olduğunu göstermektedir.

Hücre dışı kolokalizasyon beyazımsı bir renk kombinasyonu ile sonuçlanır. Yeşil, kırmızı ve mavi için pozitif pikseller, NET'leri sunan mor bir bindirme oluşturmak için bir kez daha kullanılabilir. Mycobacterium tuberculosis ile enfekte bir fare akciğer merkezi bir bölüm temsilcisi bir örnek net her üç NET bileşenleri nin kolokalizasyonu açıkça NÖTRORNoflar arasında nets gösteren mor bir tabaka oluşturmak için kullanılabilir beyazımsı alanlar olarak görülebilir başka bir örnek sağlar.

Boyama işlemi sırasında, bu yanlış pozitif boyama veya yüksek bir arka plan neden olur, çünkü bölümleri kuru düşmemelidir. Arşivlenmiş materyallerin analizi, NET'lerin hastalıklardaki etkisini anlamaya yardımcı olabilir. Parafin dokusu büyük bir arka plana sahip olabileceğinden, boyama ve arka plan arasında ayırt edebilirsiniz olumlu ve olumsuz bir kontrol olması önemlidir.

Dewaxing ve dehidratasyon bir duman başlık altında yapılmalıdır. Eldiven ve laboratuvar önlüğünü giydiğinden emin ol.