Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

İmmünohistokimya ve tanısal histopatoloji için kullanılan dokular rutin olarak %10 fosfat tampon formalinine sabitlenir. Beyin dokusunda formalin ile sabitlenmiş kuduz virüsü antijeninin tespiti benzersiz bir zorluk teşkil eder ve IHC testinin kuduz virüsü antijen tespiti için hassas ve spesifik bir yöntem olduğu bulunmuştur. Biyopsi veya diğer tespit yöntemlerinin birincil avantajı, antijenlerin doku ve hücresel morfoloji ile ilişkili olarak tespit edilebilmesidir.

IHC ile beyin ve beyin dışı dokularda kuduz antijeninin lokalizasyonu, rutin Hematoksilin ve Eosin leke bölümleri ile elde edilemeyen ek bilgiler sağlar. Kuduz tanı testi, kuduz virüsüne maruz kalan insanlarda maruziyet sonrası profilaksilerin başlatılması için önemlidir. IHC, formalin-sabit dokularda en sık yapılan tahlillerden biridir.

Spesifik antikorlarla, ilgili patojenlerin tespiti için kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, nekropsiden sonra toplanan üç ila beş milimetrelik beyin dokusunu 24 ila 72 saat boyunca% 10 tamponlanmış formalin çözeltisine yerleştirin. Yaklaşık doku ağırlığını, doku tipini ve formalin hacmini kaydedin.

Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için dokuları% 70 etanol içine yerleştirin. Örnek fiksasyonunu takiben, dokuyu beyin sapının kesitleri, beyincik veya hipokampus gibi önemli beyin bölgelerini içerecek şekilde parçalara ayrıştırın. Her biri, üç ila beş milimetre arasında bir kalınlıkta kesin.

Dokuları işleme kasetlerine yerleştirin. Parafin balmumu infiltrasyon için doku kasetlerini işleyin. Onları parafin bloklarına gömün ve bir mikrotom üzerine bölümlere ayırdım.

İlk olarak, metin protokolünün Şekil 1'inde belirtildiği gibi boyama kabını ayarlayın. Her yemeği hazırlanan çözeltinin 250 mililitresi ile doldurun. AEC substrat stok çözeltisini hazırlamak için, 20 miligramlık bir AEC tabletini 5 mililitre N, N-Dimetilformamid içinde çözmek için bir cam pipet kullanın.

Proteaz stok çözeltisini hazırlamak için, 200 mililitre PBS'de 7 miligram proteaz çözün. Durulama tamponu hazırlamak için 100 mililitre Ara 80 ila 990 mililitre PBS ekleyin ve homojen bir PBT-T çözeltisi oluşturmak için iyice karıştırın. Bir mikrotom kullanarak, beş mikrometre parafin bölümü yapın.

Bölümü 38 santigrat derecede bir su banyosuna yükleyin ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalemle etiketleyin. Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve bir saat boyunca 55 ila 60 santigrat derecede bir fırında eritin.

Ardından, slaytları fırından çıkarın ve her biri 5 dakikalık 3 ardışık ksilen durulama kullanarak hemen deparaffinize edin. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, etanol seyreltmelerini deiyonize suya indirerek slayttaki bölümleri rehidratlayın. Slaytları proteolitik antijen alımı için 30 dakika boyunca proteazla tedavi edin, ardından slaytları PBS-T'de 10 dakika durulayın ve 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin.

Bundan sonra, slaytları PBS-T ile 10 dakika boyunca tekrar yıkayın. Başlamak için, bir slaydı arabellekten çıkarın, diğerleri su altında kalırken aynı anda yalnızca bir slaydı işlediğinizden emin olun ve doku bölümünün etrafındaki fazla arabelleği lekelemek için bir kağıt havlu kullanın. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca normal keçi serumu ile kuluçkaya yatırın.

Daha sonra, nem odasındaki slaytları önceden belirlenmiş en uygun seyreltme birincil anti-kuduz antikoru ve negatif kontrol antikorları ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Bundan sonra, slaytları PBS-T ile 10 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında biyotinillenmiş antikor ile bir nem odasında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları PBS-T ile 10 dakika boyunca tekrar yıkayın.

Slaytları ve nem haznesini şerit bölmeli ve HRB kompleksini oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya bırakın ve PBS-T'yi 10 dakika yıkayın. Daha sonra, AEC ile oda sıcaklığında bir nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları deiyonize suda 10 dakika yıkayın ve Gill'in Hematoxilyn'i ile karşı çekim yapın, iki dakika boyunca deiyonize su ile bir ila iki kez seyreltin.

Bundan sonra, fazla hematoksilinleri deiyonize suya daldırarak durulayın. Slaytları Scott'ın Musluk Suyu'nda 30 saniye durulayın ve 10 dakika deiyonize suda yıkayın. Slaytları teker teker çıkarın ve suda çözünür montaj ortamıyla monte edin.

Ardından, slaytları okumak için hafif bir mikroskop kullanın. Bu çalışmada kudurmuş virüs antijeninin formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak saptanması için immünosik kimya testi gösterilmiştir. Beyin sapı, beyincik ve purkinje hücreleri ve hipokampus dahil olmak üzere farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili immünostik kimya lekeleme sonucu burada gösterilmiştir.

Mavi karşıt arka plana karşı AEC substratı kullanılarak renk gelişimini gösteren macenta kırmızısı lekelenme, kuduz antijenine karşı antikorların reaktivitesine bağlı. İmmünohistokmiyozda olumlu bir sonuç doku bölümlerindeki macenta kırmızısı lekeye karşılık gelir. Sitoplazmik inklüzyonların ve farklı büyüklükteki granüler inklüzyonların lekelenmeleri RABV enfeksiyonları için pozitif örneklerin göstergesidir.

Hematoksilin nedeniyle spesifik kırmızı lekelenme veya sadece mavi arka plan gözlenmediği takdirde numuneler negatif kabul edilir. Pozitif lekelenmeye ek olarak, inklüzyonların dağılımı, örnekteki kuduz antijen seviyelerinin dolaylı olarak nicelleştirilmesini sağlayabilir ve bu da doku örneğinin viral yüküne karşılık gelebilir. Dağılım düzeylerinden bağımsız olarak, herhangi bir özel boyama, numuneyi RABV antijen tespiti için pozitif olarak sınıflandıracaktır.

Dokular formalin içinde yeterince sabitlenmeli ve bu işlem sırasında dokuların donmasını önlemelidir. Kuduz antijeni IHC tarafından tespit edilir, daha sonra RNA dizi bilgilerine dayanarak Lyssavirus varyantını belirlemek için parafin bölümlerinde moleküler teknikler yapılabilir. Ksilen ve formalin gibi reaktifler duman kaputlarında ele alınmalıdır.

Kanserojen olduğu için AEC ile ilgilenirken dikkatli olunmalıdır.