Name: Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Öğrenin, formalin-sabit beyin dokularında immunohistokimya kullanarak rabies virüsü antijeninin hassas ve spesifik tespitini. Bu yöntem, doku morfolojisi ile ilişkili antijen lokalizasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvar uzmanlarına, epidemiyologlara ve halk sağlığı departmanlarına bağlı kuruluşlara Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerine örnek gönderimler için teşekkür ederiz. Bu rapordaki bulgular ve sonuçlar yazarların bulgularıdır ve mutlaka Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinin resmi konumunu temsil etmez. Ticari isimlerin ve ticari kaynakların kullanımı yalnızca tanımlama içindir ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından onay anlamına gelir.

Mevcutsa RABV'yi devre dışı bırakan formalin-sabit dokularda IHC protokolü yapılırken, uygun biyogüvenlik protokollerine uygun şekilde uyulmalıdır. Tüm biyogüvenlik prosedürleri Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) içinde, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giymek ve açıklandığı gibi aşılama gereksinimi dahil olmak üzere açıklanmıştır12. Ek olarak, tehlikeli kimyasalların (formalin, AEC ve ksilen gibi) uygun şekilde muhafaza edilmesi ve işlenmesi takip edilmelidir (örneğin, duman davlumbazları).
1. Dokuların formalin sabitlenmesi
<ol><li>Nekropsi sonrası toplanan 3-5 mm beyin dokularını13% 10 fosfat tamponlu formalin çözeltisine (1:20 ila 1:50 doku/ formalin oranı) 24-72 saat yerleştirin. DİkKAT: Formalin toksik bir fiksatiftir.</li>
	<li>Yaklaşık doku ağırlığını (boyutunu), doku tipini (beyin bölgelerini) ve formalin hacmini kaydedin. Laboratuvarların sabitleme sürelerine ilişkin kayıtları belgeleması ve tutması önemlidir.</li>
	<li>Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için, dokuyu% 70 etanol içine yerleştirin.</li>
</ol>2. Doku işleme
<ol><li>Örnek fiksasyonunu takiben, dokuyu beyin sapının kesitleri, beyincik (3 lob) veya hipokampus (her ikisi de hipokampi) gibi önemli beyin bölgelerini içerecek şekilde parçalara bölün ve her biri 3 ila 5 mm kalınlığında keser ve işleme kasetlerine yerleştirilir.</li>
	<li>Parafin bloklarına gömülü ve bir mikrotom üzerinde bölümlenmiş (3 ila 6 μm) parafin balmumu infiltrasyon için doku kasetlerini işleyin.</li>
</ol>3. Malzemelerin Hazırlanması / Boyama yemekleri
<ol><li>Şekil 1'de gösterildiği gibi boyama kabı14 'i(Malzeme Masası) ayarlayın. Her yemeği 250 mL çözelti ile doldurun.</li>
	<li>3-Amino-9-etilkarbizol (AEC) substrat stok çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>Bir 20 mg tablet 3-amino 9-etilcarbazole (AEC) 5 mL N, dimetilformamid cam pipet kullanarak çözün. DİkKAT: AEC bir kanserojendir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antijen alımı için proteaz (örneğin, Pronaz) stok çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>200 mL PBS'de 7 mg proteaz çözün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durulama tamponu PBS-T'nin hazırlanması<ol>
<li>10 mL ara 80 ila 990 mL PBS ekleyin. Homojen bir çözelti oluşturmak için iyice karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Deparaffinizasyon ve doku rehidrasyonu
<ol><li>Bir mikrotom kullanarak 5 μm parafin bölümü yapın, 38 ° C'de bir su banyosunda yüzdürün ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalem/işaretleyici ile etiketleyin.</li>
	<li>Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve 55-60 °C fırında 1 saat eritin. Viral antijeni yok edebileceğinden sıcaklığı 60 °C'nin üzerine yükseltmeyin.</li>
	<li>Slaytları fırından çıkarın ve 1, 2 ve 3 yemeklerinde her biri 5 dakikalık ardışık 3 ksilen durulamada hemen deparaffinize edin.</li>
	<li>Etanolün deiyonize suya seyreltilmesinde sıralı daldırmalarla slayttaki bölümleri yeniden sulandırın: (4 ila 11 bir daldırma durulamadır) çanak 4: ksilen / % 100 etanol (1:1); tabak 5: % 100 etanol; tabak 6: % 100 etanol; tabak 7: 95% etanol; tabak 8: 95% etanol; tabak 9: % 80 etanol; tabak 10: % 70 etanol; çanak 11: deiyonize su (Şekil 1. Çanak kurulumu). DİkKAT: Ksilen tehlikeli bir kimyasaldır ve duman kaputunda çalışma yapılmalıdır.</li>
</ol>5. Proteolitik antijen alımı
<ol><li>Slaytları proteazla (PBS'nin 2,5 μg/mL'si) proteolitik antijen alımı için 30 dakika boyunca tedavi edin 12.</li>
	<li>Ardından PBS-T'de 10 dakika durulayın (yemek 13).</li>
	<li>10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin (tabak 14).</li>
	<li>Yine PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 15) yıkayın.</li>
</ol>6. Boyama prosedürü
<ol><li>Kalan slaytları arabelleğe batırarak slaytları teker teker işleyin (slayt tutucusuna tam olarak çıkarmayın - slaytları ıslak tutun). Doku bölümünü rahatsız etmemeye dikkat ingerek bir kaydırağı çıkarın ve doku bölümünün etrafındaki fazla tamponu (kağıt havlu kullanarak) lekeleyin. Nem odasında, nemlendirilmiş kağıt havlular yerleştirilerek yapılan, laboratuvar tezgahının üstkısmındaki 14'te oda sıcaklığında normal keçi serumu (blokaj) ile 15 dakika boyunca sürtün.</li>
	<li>Önceden belirlenmiş en uygun seyreltme primer anti-kuduz antikoru (fare anti-kuduz serumunun 1:250 seyreltilmesi, yayınlanmamış) (pozitif kontrol) ve negatif kontrol antikorlarını oda sıcaklığında yukarıdakiyle aynı şekilde (adım 6.1.) 60 dakika boyunca kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>60 dakika sonra PBS-T ile 10 dakika (tabak 16) yıkayın.</li>
	<li>Biyotinillenmiş antikorla (türe özgü) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nem odasında kuluçkaya yatırın (adım 6.1 ile aynı şekilde işlenin).</li>
	<li>PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 16) yıkayın.</li>
	<li>Streptavidin-HRP kompleksi ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir nem odasında kuluçkaya yatır (6.1 ile aynı işleme).</li>
	<li>PBS-T ile 10 dakika (bulaşık 16) yıkayın.</li>
	<li>Peroksidaz substratı, amino-etilkarbazol (AEC) ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir nem odasında kuluçkalayın. Kullanmadan hemen önce AEC yapın. Bunu yapmak için, 14 mL 0,1M asetat tamponu olan pH 5,2'ye 1 mL AEC stok çözeltisi ekleyin. 0.15 mL% 3 H2O2ekleyin. Karışımı kullanmadan hemen önce filtreleyin (0,45 μm filtre). NOT: AEC'nin çalışma çözümü sadece 2-3 saat boyunca kararlıdır. AEC stok çözeltisi buzdolabında daha uzun süre saklanabilir.</li>
	<li>İyonize suda yıkayın 10 dk (bulaşık 17)</li>
	<li>Gill'in Hematoksilin ile karşıt 2 dakika boyunca deiyonize su ile 1:2 seyreltilmiş (çanak 18).</li>
	<li>Fazla Hematoksilin'i deiyonize su daldırma durulama ile durulayın (tabak 19 ve 20).</li>
	<li>Scott's Tap suyunda durulayın 30 s (bluing çözeltisi) yemek 21.</li>
	<li>İyonize suda yıkayın 10 dk (bulaşık 22)</li>
	<li>Slaytları birer birer çıkarın - suda çözünür montaj ortamıyla monte edin.</li>
	<li>Işık mikroskopunda slaytları okuyun.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Semptom başlangıcından sonra kuduzun yüksek ölüm oranı nedeniyle, RABV enfeksiyonu için şüpheli hayvanların tanısı uygun bir maruziyet sonrası profilaktik tedavi için son derece kritiktir. Kuduz tanısı öncelikle taze veya dondurulmuş dokular kullanılarak DFA, DRIT ve PCR tabanlı tekniklere bağlıdır. Formalin-sabit dokuların test edilmesi için, IHC testi RABV antijeninin hassas ve spesifik tespiti için alternatif bir yöntem sağlar. Formalin ile sabitlenen dokular çapraz bağlama gibi yan zincirlerin modifikasyonu nedeniyle...

Kuduz, lyssavirus cinsine ait negatif duyu RNA virüslerinin neden olduğu akut ilerleyici bir ensefalittir1. Cinsin tip üyesi kuduz virüsü (RABV) enfeksiyonundan kaynaklanan tüm insan ölümlerinin yaklaşık% 99'u köpekler tarafından bulaşır2. Şüpheli hayvanların kuduz tanısı, beyin dokusunda genomik RNA (ribonikoprotein kompleksi, RNP) ile komplekste antijenin (öncelikle viral kodlanmış nükleoprotein, N proteini) tespit edilmesine dayanır3. Doğrudan floresan antikor (DFA) testi ile antijen tespiti kuduz tanısı için altın standart olarak kabul edilir4. Yöntemde taze veya taze dondurulmuş beyin materyali, slayt üzerinde dokunma izlenimi, asetonda fiksasyon, ticari olarak mevcut floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli monoklonal veya poliklonal antikorlar (mAbs/pAbs) kullanılarak boyama ve floresan mikroskopisi tarafından okunur5. DFA testi hızlı, hassas ve taze beyin dokusunda kuduz antijen tespiti için özeldir. Son zamanlarda, doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT), modifiye immünhistokimya (IHC) tekniğinin DFA'ya benzer hassasiyet gösterdiği gösterilmiştir, ancak görselleştirme için ışık mikroskopisi avantajı sunmaktadır6. DRIT'de kullanılan algılama yöntemi IHC'ye benzer olsa da, ilk adımda numunenin dokunma izlenimlerini oluşturmak için taze veya dondurulmuş dokular ve ardından formalin fiksasyonu kullanılır.
IHC, parafin bloklarına gömülü formalin-sabit dokularda spesifik antikorlar kullanarak histolojik değişiklikleri ve proteinlerin tespitini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. IHC, doku bölümlerinde kuduz antijen tespiti için belirlenmiş bir alternatif testtir7. IHC özellikle kuduz yükünü belirlemek için nörolojik hastalıklar sergileyen retrospektif vakaların tanısı için kullanılmıştır8. Parafin gömülü formalin sabit dokular, ortam sıcaklığında depolandığında birkaç yıl sonra bile proteinleri tespit için korur9. Formalin tedavisi, amino asit yan zincirlerini çapraz bağlayarak ve değiştirerek proteinleri değiştirir, bu da epitopların antikorlara karşı artık reaktif olmamasını sağlayabilir10. Kuduz antijen tespiti için IHC testi mAbs veya pAbs içerirken, ikincisi birden fazla epitop ve farklı lyssavirüsler tespit edilebildiğinden avantajlıdır11.
IHC'de yer alan standart adımlar dokuların formalin sabitlenmesi, parafin bloklarına gömülmesi, dokuların bölümlenmesi, deparaffinizasyon ve hidrasyon, epitop iyileşmesi, birincil ve ikincil antikorlara karşı reaktivite ve kromojenik substratlar kullanılarak gelişimdir. Bu makalede kuduz tanısı için protokolün ayrıntılı bir anlatımı açıklanmaktadır. Kuduz antijen tespiti için, ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) Atlanta, Georgia'da biyotinillenmiş fare karşıtı ikincil antikorlarla birlikte üretilen RABV (pAbs) ile aşılanmış fare serumu kullanılmaktadır. Biyotinilasyonlu Abs, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) kompleksinin eklenmesi ve ardından amino-etilkarbazol substratı ile renk gelişimi ile tespit edilir.

<table><tbody><tr><td>%3 hidrojen peroksit</td><td>Pharamacy markaları</td><td></td><td>Raftan %3 H2O2</td></tr><tr><td>3-Amino-9-etilkarbazol (AEC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Asetat Tamponu pH 5.2</td><td>Poly Scientific R& D A.Ş.</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Tamponlu Formalin% 10 Fosfat Tamponlu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Sertifikalı</td></tr><tr><td>Lamel Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50 mm</td></tr><tr><td>Etanol 190 Korumalı</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Korumalı</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Gill'in hematoksilen formülasyonu #2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark Biotin-Streptavidin Peroksidaz Kiti</td><td>seracare</td><td>71-00-18</td><td>Fare Birincil Antikoru&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>Montaj ortamı</td></tr><tr><td>N,N, Dimetil formamid GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Amaç</td><td>Çoklu satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Amaç Çoklu</td><td>satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Protease, Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>Scott'ın Musluk Suyu&nbsp;</td><td>Poli Bilimsel Ar-Ge D A.Ş.</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Slide Leke Seti</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Histolojik Sınıf</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 görüntüleme - mikroskop</td><td>Birden fazla satıcı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formalin-sabit dokulardan lyssavirüs antijen tespiti için İmmünohistokiniti testi

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Kuduz için birincil tanı yöntemlerinden biri, enfekte doku örneklerinde viral ribonikleoprotein (RNP) kompleksinin (antijen) saptanmasıdır. Antijen tespiti için doğrudan floresan antikor (DFA) testi veya doğrudan hızlı immünohistokimyasal test (DRIT) en yaygın olarak kullanılırken, her iki test de antikorlar kullanılarak antijen tespit edilmeden önce slaytlardaki gösterimler için taze ve/veya dondurulmuş dokular gerektirir. Örnekler formalin içinde toplanır ve sabitlenirse, her iki test de antijen tespiti için uygun değildir, ancak test parafin bloklarına ve kesitlere gömüldikten sonra geleneksel immünhistokimya (IHC) tarafından yapılabilir. Bu IHC yöntemi ile dokular anti-kuduz antikorları ile lekelenir, bölümler deparaffinize edilir, kısmi proteoliz veya diğer yöntemlerle antijen alınır ve primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilir. Antijenler yaban turpu peroksidaz / amino etil karbazol kullanılarak lekelenir ve hafif bir mikroskop kullanılarak görselleştirme için hematoksilin ile karşıtır. Spesifik antijen tespitine ek olarak, formalin fiksasyonu histolojik değişikliklerin belirlenmesi, numune depolama ve taşıma için rahat koşullar (ortam sıcaklıkları altında), retrospektif vakaları test etme yeteneği ve enfeksiyöz ajanların inaktivasyonu yoluyla biyolojik güvenliğin iyileştirilmesi gibi başka avantajlar sunar.

Şekil 2, test edilen farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili IHC boyama sonuçlarını göstermektedir. Şekil 2A,D,G 200x'te pozitif örnekleri temsil ederken, Şekil 2B, E, H sırasıyla 400x büyütmeye karşılık gelir. Şekil 2A-C beyin sapına karşılık gelir; Şekil 2</strong...

Burada formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak kuduz virüsü antijeninin tespiti için immünhistokinemya test protokolü sunuyoruz.

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

İmmünohistokimya ve tanısal histopatoloji için kullanılan dokular rutin olarak %10 fosfat tampon formalinine sabitlenir. Beyin dokusunda formalin ile sabitlenmiş kuduz virüsü antijeninin tespiti benzersiz bir zorluk teşkil eder ve IHC testinin kuduz virüsü antijen tespiti için hassas ve spesifik bir yöntem olduğu bulunmuştur. Biyopsi veya diğer tespit yöntemlerinin birincil avantajı, antijenlerin doku ve hücresel morfoloji ile ilişkili olarak tespit edilebilmesidir.IHC ile beyin ve beyin dışı dokularda kuduz antijeninin lokalizasyonu, rutin Hematoksilin ve Eosin leke bölümleri ile elde edilemeyen ek bilgiler sağlar. Kuduz tanı testi, kuduz virüsüne maruz kalan insanlarda maruziyet sonrası profilaksilerin başlatılması için önemlidir. IHC, formalin-sabit dokularda en sık yapılan tahlillerden biridir.Spesifik antikorlarla, ilgili patojenlerin tespiti için kullanılabilir. Bu prosedüre başlamak için, nekropsiden sonra toplanan üç ila beş milimetrelik beyin dokusunu 24 ila 72 saat boyunca% 10 tamponlanmış formalin çözeltisine yerleştirin. Yaklaşık doku ağırlığını, doku tipini ve formalin hacmini kaydedin.Formalin fiksasyonundan sonra ve işlemden önce daha uzun doku depolaması için dokuları% 70 etanol içine yerleştirin. Örnek fiksasyonunu takiben, dokuyu beyin sapının kesitleri, beyincik veya hipokampus gibi önemli beyin bölgelerini içerecek şekilde parçalara ayrıştırın. Her biri, üç ila beş milimetre arasında bir kalınlıkta kesin.Dokuları işleme kasetlerine yerleştirin. Parafin balmumu infiltrasyon için doku kasetlerini işleyin. Onları parafin bloklarına gömün ve bir mikrotom üzerine bölümlere ayırdım.İlk olarak, metin protokolünün Şekil 1'inde belirtildiği gibi boyama kabını ayarlayın. Her yemeği hazırlanan çözeltinin 250 mililitresi ile doldurun. AEC substrat stok çözeltisini hazırlamak için, 20 miligramlık bir AEC tabletini 5 mililitre N, N-Dimetilformamid içinde çözmek için bir cam pipet kullanın.Proteaz stok çözeltisini hazırlamak için, 200 mililitre PBS'de 7 miligram proteaz çözün. Durulama tamponu hazırlamak için 100 mililitre Ara 80 ila 990 mililitre PBS ekleyin ve homojen bir PBT-T çözeltisi oluşturmak için iyice karıştırın. Bir mikrotom kullanarak, beş mikrometre parafin bölümü yapın.Bölümü 38 santigrat derecede bir su banyosuna yükleyin ve cam slaytlara toplayın. Slaytları reaktife dayanıklı bir kalemle etiketleyin. Slaytları bir tepsiye yerleştirin ve bir saat boyunca 55 ila 60 santigrat derecede bir fırında eritin.Ardından, slaytları fırından çıkarın ve her biri 5 dakikalık 3 ardışık ksilen durulama kullanarak hemen deparaffinize edin. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, etanol seyreltmelerini deiyonize suya indirerek slayttaki bölümleri rehidratlayın. Slaytları proteolitik antijen alımı için 30 dakika boyunca proteazla tedavi edin, ardından slaytları PBS-T'de 10 dakika durulayın ve 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin.Bundan sonra, slaytları PBS-T ile 10 dakika boyunca tekrar yıkayın. Başlamak için, bir slaydı arabellekten çıkarın, diğerleri su altında kalırken aynı anda yalnızca bir slaydı işlediğinizden emin olun ve doku bölümünün etrafındaki fazla arabelleği lekelemek için bir kağıt havlu kullanın. Slaytları bir nem odasına yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca normal keçi serumu ile kuluçkaya yatırın.Daha sonra, nem odasındaki slaytları önceden belirlenmiş en uygun seyreltme birincil anti-kuduz antikoru ve negatif kontrol antikorları ile oda sıcaklığında 60 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Bundan sonra, slaytları PBS-T ile 10 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında biyotinillenmiş antikor ile bir nem odasında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları PBS-T ile 10 dakika boyunca tekrar yıkayın.Slaytları ve nem haznesini şerit bölmeli ve HRB kompleksini oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya bırakın ve PBS-T'yi 10 dakika yıkayın. Daha sonra, AEC ile oda sıcaklığında bir nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Slaytları deiyonize suda 10 dakika yıkayın ve Gill'in Hematoxilyn'i ile karşı çekim yapın, iki dakika boyunca deiyonize su ile bir ila iki kez seyreltin.Bundan sonra, fazla hematoksilinleri deiyonize suya daldırarak durulayın. Slaytları Scott'ın Musluk Suyu'nda 30 saniye durulayın ve 10 dakika deiyonize suda yıkayın. Slaytları teker teker çıkarın ve suda çözünür montaj ortamıyla monte edin.Ardından, slaytları okumak için hafif bir mikroskop kullanın. Bu çalışmada kudurmuş virüs antijeninin formalin-sabit dokular için alternatif tanı testi olarak saptanması için immünosik kimya testi gösterilmiştir. Beyin sapı, beyincik ve purkinje hücreleri ve hipokampus dahil olmak üzere farklı beyin dokularındaki pozitif ve negatif kontrol örneklerinin temsili immünostik kimya lekeleme sonucu burada gösterilmiştir.Mavi karşıt arka plana karşı AEC substratı kullanılarak renk gelişimini gösteren macenta kırmızısı lekelenme, kuduz antijenine karşı antikorların reaktivitesine bağlı. İmmünohistokmiyozda olumlu bir sonuç doku bölümlerindeki macenta kırmızısı lekeye karşılık gelir. Sitoplazmik inklüzyonların ve farklı büyüklükteki granüler inklüzyonların lekelenmeleri RABV enfeksiyonları için pozitif örneklerin göstergesidir.Hematoksilin nedeniyle spesifik kırmızı lekelenme veya sadece mavi arka plan gözlenmediği takdirde numuneler negatif kabul edilir. Pozitif lekelenmeye ek olarak, inklüzyonların dağılımı, örnekteki kuduz antijen seviyelerinin dolaylı olarak nicelleştirilmesini sağlayabilir ve bu da doku örneğinin viral yüküne karşılık gelebilir. Dağılım düzeylerinden bağımsız olarak, herhangi bir özel boyama, numuneyi RABV antijen tespiti için pozitif olarak sınıflandıracaktır.Dokular formalin içinde yeterince sabitlenmeli ve bu işlem sırasında dokuların donmasını önlemelidir. Kuduz antijeni IHC tarafından tespit edilir, daha sonra RNA dizi bilgilerine dayanarak Lyssavirus varyantını belirlemek için parafin bölümlerinde moleküler teknikler yapılabilir. Ksilen ve formalin gibi reaktifler duman kaputlarında ele alınmalıdır.Kanserojen olduğu için AEC ile ilgilenirken dikkatli olunmalıdır.

immunohistochemistry-test-for-lyssavirus-antigen-detection-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Bu video, enfekte fare beyin dokusunda kuduz virüsü antijeni tespiti için immünohistokimya boyamayı göstermektedir. Süreç, deparafinizasyon ve alkol tedavisini, ardından antijen erişilebilirliğini artırmak için proteolitik tedaviyi içerir. İmmünohistokimya boyama, doku bölümünde kuduz antijenlerinin varlığını doğrulayan kırmızı çökeltileri ortaya çıkarır.

Kuduz Virüsü Antijenlerinin Saptanmasına Yönelik Bir İmmünohistokimya Boyaması

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Bu hayvan modellerinin doku bölümleri içinde kalıcı bir DNA virüsü genomunun saptanması için in situ hibridizasyon protokolünde bir floresan kurulmuştur. Bu protokol, viral genomun codetection, kendi RNA ürünleri ve tek bir hücre içinde viral veya hücresel proteinleri tarafından enfeksiyon süreci üzerinde çalışırken sağlar.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Yeni, immünostasyon uyumlu doku Temizleme teknikleri gibi solvent temizlenmiş organların nihai 3D görüntüleme kuduz virüsü beyin enfeksiyonu ve karmaşık hücresel çevre 3D görselleştirme sağlar. Kalın, antikor etiketli beyin dokusu dilimleri, görüntüleme derinliğini artırmak ve konfetik lazer tarama mikroskobu ile 3D analizini sağlamak için optik olarak şeffaf hale gelmiştir.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

Bu protokol Tayvan yarasalar lyssavirus antijenlerin tanısal test için standart bir laboratuvar işletim prosedürü tanıttı.

Tayvan'da Yarasa Popülasyonunun Lyssavirus Gözetimi için Standart Çalışma Prosedürü

DsDNA enterkalasyon boya kullanarak bu gerçek zamanlı RT-PCR Lissavirüse enfeksiyonları teşhis etmek için uygundur. Yöntem, kuduz şüpheli ante-mortem veya post-mortem örneklerinden çıkarılan RNA ile başlar, ana karışım hazırlama, RNA ilavesi, gerçek zamanlı makinenin kurulumu ve sonuçların doğru yorumlanması hakkında ayrıntı.

Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR Rabies tanı için

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, bazı kuduz olmayan lizavirüsler ve lagomorflar için test performansını iyileştirmek için primer dizileri ve formülasyonlardaki güncellemeler de dahil olmak üzere, doku toplamadan sonuç yorumlamaya kadar pan-lizavirüs LN34 gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testini gösterir. Ayrıca, tek kuyulu LN34 çoğullanmış (LN34M) formatı için tahlil kurulumunu da gösteriyoruz.

Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, formalin-sabit beyin dokularında immunohistokimya kullanarak rabies virüsü antijeninin hassas ve spesifik tespitini. Bu yöntem, doku morfolojisi ile ilişkili antijen lokalizasyonu sağlar.

Formalin-Sabit Dokulardan Lyssavirüs Antijen Tespiti için İmmünohistokiniti Testi

Daha fazla video keşfet