Kesinlikle Anaerobik/Anoksik Koşullarda Mikroorganizmaların Yetiştirilmesi için Orta Hazırlık
15 Ağustos 2019
Zorunlu anaerobik organizmalar oksijene maruz kaldıktan sonra büyüyemedikleri için anaerobik kültür tekniklerinin kullanımı vazgeçilmezdir. Burada, medya hazırlığından gaz ve uçucu yağ asidi nicelleştirmesine kadar bir biyogaz bitkisinden elde edilen karışık bir kültürü yetiştirmek için basit ve etkili bir yöntem gösteriyoruz.
Aerobik organizmaların aksine, kesinlikle anaerobik mikroorganizmalar oksijen yokluğu gerektirir. Oksijen havada her yerde olduğu için, ekimi sırasında oksijensiz koşulları korumak anaerobik kültür için bir ön koşuldur. Uygulanan teknik sıvı kültürde karışık bir mikrobiyal popülasyon yetiştirmek için anoksik koşullar sağlamak için basit ve ucuz bir yöntem temsil eder.
Bu teknik saf kültürlerin yetiştirilmesinde de uygulanabilir. Ancak, yüksek oksijene duyarlı mikroorganizmalar için bu işlem geçerli olmayabilir. Uygun bir şişede orta malzemeyi tartarak başlayın ve damıtılmış su yarım hacim ile eriterek.
Sonra, REDOX göstergesi mililitre ekleyin, iz element çözeltisi vitaminler takip. Organizma nın gereksinimlerine göre pH'ı ayarlayın ve son hacmi distile su ile 1 litreye getirin. REDOX göstergesinin rengi pH'ya bağlıdır ve ayarlamak için biraz zaman gerekebilir.
120 mililitrelik serum şişelerini 50 mililitre orta ile doldurun, sonra sıvı fazdaki oksijenin çözünürlüğünü azaltmak için 100 derecelik bir su banyosunda 20 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kafa alanını nitrojenle temizle. Azot ile çalışırken uygun oda havalandırma dikkat edin.
Şişeleri butil kauçuk septa ile kapatın ve alüminyum kapakları düzeltin. Daha sonra, REDOX potansiyelini daha da azaltmak için her şişeye 0,1 mililitre azaltma maddesi ekleyin. Şişeleri 121 derecede 20 dakika boyunca otoklavlayın.
Bu protokol uygulanırken kapalı kapların sterilizasyonu için onaylı bir otoklav kullanılmalıdır. Aksi takdirde, sıcaklık artışından kaynaklanan aşırı basınç serum şişeleri patlamaya neden olabilir. Anaerobik digester inoculum hazırlamak için, bir şişe distile su 400 mililitre ekleyin ve kaynatın getirmek.
Kafa boşluğunu kalıcı olarak azotla yıkatarak yaklaşık 30 santigrat dereceye kadar soğutun. Seyreltme tayini için çamurun tam kütlesini kaydettiğinden emin olun, bir anaerobik digester türetilen çamur yaklaşık 100 gram ekleyin. Şişenin kafa alanını azotla değiştirin ve butil kauçuk septumla kapatın.
120 RPM'de şişeyi 30 dakika sallayın. Daha büyük çamur parçacıkları tortu sağlar, sonra inoculum 5 mililitre kaldırmak ve daha önce hazırlanmış bir serum şişesi içine enjekte etmek için bir şırınga ve kanula kullanın. Kuluçkaya yatan serum şişesini deney için uygun bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın, kuluçkaya başladıktan yaklaşık 15-30 dakika sonra sıcaklık artışının neden olduğu aşırı basıncı niçin boşaltın.
Kuluçka süresi boyunca biyo gaz üretimini ve bileşimini değerlendirmek için, mevcut atmosfer basıncını kaydedin ve şişe içindeki basıncı değerlendirmek için bir manometre hazırlayın. Şişeleri salla ve şırınga ve kanula kullanarak 1 mililitre kafa boşluğu gazını çıkarın. Gaz kromatografisi kullanarak hidrojen, oksijen, metan ve karbondioksit konsantrasyonu ölçün.
El yazması talimatlara göre tüm uzun yağ asitlerinin konsantrasyonlarını izlemek için şişeden 1 mililitre sıvı kullanın ve uygun sıcaklığa geri döndükten sonra şişeleri basınç üzerinden boşaltın. Bu protokol anaerobik sindirim yürüten minyatür biyoreaktörler oluşturmak için kullanılmıştır. Triptofan, tirozin, fenilalanin, et özü ve kazein 3 farklı konsantrasyonda eklendi ve metan üretimi 28 günlük kuluçka döneminde izlendi.
Metanojenler, metanogenezde bir elektron taşıyıcısı olan F420 koenziminin yayılarak görüntülenmiş ve maksimum 420 nanometre emilimi ile mavi-yeşil floresan sergiler. Gaz analizi ile eşzamanlı olarak, inkübasyon döneminde uçucu yağ asidi ve fenil asit konsantrasyonları için numuneler analiz edildi. Deney belirli bir noktada, belirli mikroorganizmaların bolluğunu ve/veya mikrobiyal topluluğun bileşimini hedefleyen moleküler biyolojik yöntemler, açıklanan prosedür kullanılarak uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu makale, bir biogaz tesisinden elde edilen anaerobik mikroorganizmaların kültüre edilmesi için basit bir yöntem sunmaktadır. Besiyeri hazırlama ile gaz ve uçucu yağ asitlerinin miktar tayini detaylandırılmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Biyoteknoloji
- Çevre Bilimi
Arka Plan
- Anaerobik organizmalar oksijen varlığında hayatta kalamazlar.
- Anoksik koşulların korunması, bu organizmaların kültürü için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, karışık mikrobiyal popülasyonlar için basit ve maliyet etkilidir.
- Ayrıca saf kültürler için de uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Anaerobik kültürleme için etkili bir protokol göstermek.
- Biyogaz üretimini ve uçucu yağ asitlerini nicel olarak belirlemek.
- Süreç boyunca metanojenleri görselleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- REDOX indikatörleri içeren anaerobik ortamların hazırlanması.
- Anaerobik sindiricilerden alınan çamur ile inokülasyon.
- Gaz kromatografisi kullanılarak gaz bileşiminin izlenmesi.
- İnkübasyon sırasında uçucu yağ asitlerinin analizi.
Temel Sonuçlar
- Anaerobik mikroorganizmaların başarılı bir şekilde kültürü gerçekleştirildi.
- Biyogaz üretimi 28 günlük bir süre boyunca izlendi.
- Metan ve uçucu yağ asitlerinin konsantrasyonları belirlendi.
- Metanojenler floresan teknikleri kullanılarak görselleştirildi.
Sonuçlar
- Tanımlanan yöntem, anaerobik kültürlerin yetiştirilmesi için etkilidir.
- Biyogaz üretiminin ve mikrobiyal topluluk kompozisyonunun değerlendirilmesine olanak tanır.
- Bu protokol, çeşitli anaerobik araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Katı anaerobik mikroorganizmaların güvenilir şekilde kültüre edilmesi, biyofarma Ar-Ge çalışmaları için temel önem taşımaktadır.&mikrobiyal metabolizmayı hedefleyen, sentetik biyoloji ve biyoproses inovasyonu odaklıdır. Bu protokol, oksijensiz ortamların tekrarlanabilir şekilde hazırlanmasına ve mikrobiyal çıktıların kantitatif olarak izlenmesine olanak tanıyarak anaerob odaklı iş akışlarında erken aşama keşifleri ve mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Yöntemin ölçeklenebilirliği ve standardizasyonu, kurumsal düzeydeki tarama ve translasyonel araştırma hatlarına entegrasyonu kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar&D
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Anaerobik metabolik yolların ve mikrobiyal fonksiyonun hipotez odaklı sorgulanmasına olanak tanır.
- Hassas hedefler için katı anoksik koşullar sağlayarak biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Biyoproses ve terapötik geliştirme ile ilgili mikrobiyal konsorsiyumların fonksiyonel validasyonunu kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt analizler için anaerobik ortamların standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir hazırlığını sağlar.
- Güvenilir bileşik değerlendirmesi için gaz ve metabolit çıktılarının kantitatif ölçümünü sağlar.
- Çeşitli anaerobik sistemlerde analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Mikrobiyal çıktıların, metan ve uçucu yağ asitleri gibi translasyonel biyobelirteçlerle hizalanmasını sağlar.
- Anaerob odaklı uygulamalarda, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Güçlü ve kantitatif veriler sağlayarak, mikrobiyal adayların geliştirilme sürecindeki riskleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, anaerobik kültivasyonu, erken keşif aşamasından öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik araştırmalara kadar temel bir yetkinlik olarak konumlandırmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Redoks ve oksijen seviyelerinin sıkı kontrolüne olanak sağlayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Gaz ve metabolit analizi için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sağlayarak analiz hazırlığını destekler.
- Analitikler: Mikrobiyal aktivitenin ve metabolik ürünlerin hassas ölçümü için gaz kromatografisi ve HPLC'yi entegre eder.
- Translasyonel Araştırma: Mikrobiyal çıktıları, biyoproses ve terapötik geliştirme ile ilgili preklinik son noktalarla uyumlu hale getirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: R genelinde anaerobik kültivasyon için yeniden kullanılabilir, standardize edilmiş bir iş akışı oluşturur&D programları.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Anaerobik sistem çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir anaerobik kültivasyon ve analiz sağlar.
- Stratejik Değer: Güçlü ve kantitatif veriler sağlayarak devam/tamamla kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Anaerobların yönlendirdiği varlıkların riskten arındırılmış önceliklendirmesini ve ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Anaerobik mikrobiyoloji ve aseptik teknik konusunda uzmanlık gerektirir.
- Gaz sızdırmaz flasklara, kapalı kaplar için otoklavlara ve analitik platformlara (GC, HPLC) erişim gereklidir.
- Anoksik koşulların ve tekrarlanabilirliğin korunması için ekipler arası titiz bir standardizasyon gerektirir.
- Yüksek düzeyde oksijene duyarlı suşlar veya alternatif model sistemler için adaptasyon gerekebilir.
- Basınçlı gazların ve azotun kullanımıyla ilgili güvenlik protokolleri esastır.
