Name: Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: Öğrenin, biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, Gaucher hastalığı gibi durumların tanı ve tedavi takibinde kitinazı biyobelirteç olarak kullanmayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Amerikan Akciğer Derneği ve Amerikan Toraks Derneği ls ödülleri tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle Transgenik fare suşları sağlamak için Dr Jack Elias ve Dr Chun Geun Lee teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan işlemleri Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde IACUC onaylı bir protokol altında gerçekleştirildi.
1. Fare Örnek Toplama
<ol><li>
Anestezi
	<ol>
<li>Ketamin ve ksilazin kullanarak fareler anestezik (ketamin 100 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kan örneği toplama
	<ol>
<li>Anestezinin derinliğini bir parmak ucuna yanıt vermeyen bir şekilde onaylayın.</li>
		<li>Cerrahi kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu açın.</li>
		<li>Sol ventriküle 26,5 G iğne yerleştirin ve şırınganın içine kan toplayın. NOT: Tipik olarak, yaklaşık 0.5-1 mL kan sağlıklı bir 20-25 g fareden hasat edilebilir.</li>
		<li>Plazma toplama için heparinize tüplerde veya serum toplama için heparinize olmayan tüplerde kan toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bronkoalveolar lavaj sıvısı (BAL)
	<ol>
<li>BAL toplamak için, nefes borusunu ortaya çıkarmak için boyunda dikey bir kesik yapın.</li>
		<li>22 G kateter ile trakeayı kanüle getirin ve farenin burnundan sızmasını önlemek için bir ip kullanarak sıkıca sabitleyin.</li>
		<li>Yavaşça trakea yoluyla akciğerlere steril fosfat tamponlu salin iki aliquots enjekte (PBS, 0.75 mL her) ve geri almak.</li>
		<li>Havuz aliquots ve daha fazla analiz için buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biyolojik numuneleri işliyorum.
	<ol>
<li>Kan örneği: Ya taze (plazma) ya da 4 h (serum) için pıhtılaşmaya izin sonra, 10 dakika için 600 x g santrifüj. Supernatant alın ve depolama veya deneme için kullanmak için dondurun.</li>
		<li>BAL: Numuneyi 350 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant alın ve depolama veya deneme için kullanmak için dondurun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Chitinase Assay
NOT: Titrenin arkasındaki bilim nispeten basittir. Floresan olmayan bir substrat enzimatik olarak aktif kitinaz tarafından bir floresan ürün üretmek için ayrılır, daha sonra kitinaz aktivitesinin dolaylı bir belirteci olarak ölçülür. Örneklerin içindeki chitinases substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diasetylchitobiose 1x McIlvain tampon mevcut yıkmak. Bir floresan molekül 4-methylumbelliferyl serbest bırakılır. Her kuyunun toplam floresansını ölçerek, her numunedeki aktif kromozomun doğru bir ölçümlerini elde ediyoruz. Chitinin kitinaz tarafından bozulması hidrolitik bir reaksiyon olduğundan, durdurma tamponu, 0.3 M glisin ve NaOH karışımı (pH 10.6'da 12.0 g/L), enzimin çalışması için çok basit bir ortam oluşturarak kitin dökümünü sona erdirİr.
<ol><li>
Alt tabakaları, standartları ve çözümleri hazırlayın.
	<ol>
<li>McIlvain tamponhazırlayın. McIlvain Tampon u 5.2 pH 0.1 M sitrat ve 0.2 M fosfat oluşur. 1x McIlvain tampon için 1:1 oranında seyreltin.</li>
		<li>Her biri 500 μM'lik bir konsantrasyona kadar 1x McIlvain Tampon'da hem 4-metilumbelliferyl-D-N, N'-diasetilchitobiose hem de 4-metilumbellifßeryl-D-N, N', N"-triacetylchitotriose'u çözün. NOT: Stok çözeltisi daha fazla kullanım için -20 °C'de saklanabilir; en iyi aliquots saklanır.</li>
		<li>Standart eğri stok çözeltisini oluşturmak için standart, 4-metilumbelliferon,stop tamponunda 0,1 mM konsantrasyona (0,3 M glisin ve NaOH karışımı (pH 10,6'da 12,0 g/L)) çözün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çalışma çözümlerini oluşturun ve plakalayın.
	<ol>
<li>1x McIlvain Tampon ve chitin substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diasetylchitobiose çalışma çözümü oluşturmak için birleştirin. Her 10 örnek için 100 μL substrat ile 2,17 mL 1x McIlvain tamponu karıştırın. Örnek boyutuna dayalı ek hesaplamalar için Tablo 1'e bakın. NOT: İnsan örnekleri için 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N', N"-triacetylchitotriose kullanın. Her iki substrat insan veya fare enzimleri tarafından ayrılabilse de, dekolte 6'nın etkinliğinegöre insan veya fare örnekleri için atanmıştır.</li>
		<li>Pipet 95 μL çalışma çözeltisi 96 kuyuluk her kuyuya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biyonumune örneklerini çalışma çözümüne ekleyin.
	<ol>
<li>Daha sonra, her kuyuya test örneğinin (kan/BAL/doku lysate/diğer biyolojik sıvı) 5 μL'sini ekleyin.</li>
		<li>En doğru ve güvenilir sonuçlar için numuneyi çalışma çözümüne karıştırın. NOT: Örnekler, potansiyel kenar efektlerine özel önem verilmelidir. Kenar etkisini en aza indirmek için tüm numuneler önceden ısıtılmalıdır. Titre, numunedeki kitinalar ile çalışma çözeltisindeki substrat arasında bir reaksiyon içerdiğinden, ilk numunenin kaplanması ile son numunenin kaplanması arasındaki zaman farkını en aza indirmek için nispeten hızlı bir şekilde çalışmak en iyisidir. Çok kanallı pipet önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
37 °C'de kuluçkaya yatırın.
	<ol>
<li>Plakayı kapatın ve kısa bir süre sallayın (5 s).</li>
		<li>Plakayı 37 °C'de 15 dk kuluçkaya yatırın. Bu enzimatik reaksiyon gerçekleşmesini sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standart eğriyi hazırlayın.
	<ol>
<li>Örnekler kuluçka yakarken, enzim aktivitesinin florimetrik tayininde sıklıkla kullanılan bir standart olan 4-metilumbelliferon seri seyreltme hazırlayın.</li>
		<li>Dur tamponundaki standart çözeltinin stoğunu 5 μM'lik bir konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>Tablo2'de belirtildiği gibi bir dizi seyreltme gerçekleştirin. Bileşenleri belirtilen miktarda ekleyin ve iyice karıştırın. NOT: Standart eğri, ölçülen örneklerin standart eğrinin doğrusal aralığında düşmesini sağlamaya yardımcı olur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durdurma arabelleği ile reaksiyonu durdurun.
	<ol>
<li>Reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 200 μL stop arabelleği ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standartları plakalayın.
	<ol>
<li>Aynı plaka üzerindeki yinelemelere kuyu başına her standarttan 300 μL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Florometrik okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
	<ol>
<li>360 nm uyarma ve 455 nm bir emisyon plaka okuyun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Veri Analizi
<ol><li>
Boşlukları çıkarma
	<ol>
<li>4-metilumbelliferon olmayan yinelenen standart seyreltmelerin ortalama değerleri. Bu değeri diğer kaydedilen değerlerin tümünden çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teknik çoğaltmaların ortalamasını alın ve standartları çizin.
	<ol>
<li>Her konsantrasyon için ortalama iki okuma ve konsantrasyona göre ortalama okuma grafiği. NOT: Ortaya çıkan çizim doğrusal görünmeli ve 1'e yakın bir R2 değerine sahip olmalıdır. Yoksa, veri analizi kalitesini sağlamak için standartları yeniden yapmak ve plakayı yeniden okumak gerekebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Okuma değerlerini standartlaştırın.
	<ol>
<li>Çizilen standartlar verileri için en uygun çizgi oluşturun. Örneklerin okumalarını en uygun çizginin eğimine bölün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kontrol grubundan ve değişken grubundaki değerleri karşılaştırın.
	<ol>
<li>Gruplar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için ikiden fazla grup için bir t-testi veya ANOVA kullanın. Değerler nmol/mL·h birimlerini alacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

Kitinaz aktivitesi hastalığın şiddetini, hastalığın ilerlemesini, terapötik etkinliğini ve spesifik patojenlerin varlığını tahmin etmek için önemli bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır18. Chitinases rolü hakkında uzun postulated teorilerin çoğu deneysel olarak kanıtlanmamıştır rağmen19, Yeni çalışmalar çeşitli hastalıklarda proteinler gibi chitinases ve kitinaz rolü içine önemli bilgiler sağlamıştır2, 9,</...

Chitin selüloz sonra yeryüzünde ikinci en bol polisakkarit, böceklerin dış iskelet ilerlerken dahil olmak üzere organizmaların çeşitli önemli bir yapısal bileşeni olarak hizmet vermektedir, mantarlar, maya, ve yosun; bazı omurgalılar da chitin1var. Chitinases kitin yıkmak yeteneğine sahip enzimler bir aile ve son derece bakterilerden memelilere kadar türlerde evrim boyunca korunur2,3. Chitinases ek olarak, memeliler de chitin bağlamak için yeteneklerini chitinases benzer ama onlar chitin cleave enzimatik yeteneği eksikliği farklı olan kitinaz benzeri proteinler var4.
Her ne kadar chitin ve chitinases uzun incelenmiş olsa da-1900'lerin başına kadar uzanan araştırmalar ile-ana odak böcekler ve diğer omurgasızlar rollerini olmuştur. Aslında, 1960'lara kadar omurgalıların chitinases olduğu tespit edildi. Chitobiare bazlı bir test kullanılarak, kitinazların kertenkeleler ve karakuşlar da dahil olmak üzere omurgalıların sindirim sisteminde bulunduğu gösterilmiştir— bu gözlem, böcekler gibi kitin içeren organizmaların tüketimine bağlı olduğu varsayımına yol açtı5 .
Memelilerin iki enzimatik aktif kromozom formu vardır: asidik memeli kitinaz (AMCase; chit2 ve CHIA olarak da bilinir) ve kitotriosidaz (CHIT1)4. Bu proteinlerin her ikisi de kitin hidrolize yeteneğine sahiptir. Ancak, CHIT1 insanlarda daha enzimatik olarak aktiftir, hemen hemen tüm kitinaz aktivitesi CHIT1 türetilmiştir. 4 Farelerde, hem Chit1 hem de AMCase neredeyse eşitgenel kitinaz aktivitesine katkıda 6. Öte yandan, kitinaz benzeri proteinlerde kitinaz aktivitesi yok.
Chit1 esas olarak makrofajlar tarafından salgılanır ve genellikle chitin içeren patojenlere karşı bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir7. Enzim ayrıca substrat kitinvarlığıolmadan bile, hem M1 ve M2 makrofaj alt tipleri içine monositlerin olgunlaşmadahil olduğu gösterilmiştir 8 . Ayrıca, aynı zamanda T yardımcı tip 2 de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerinin olgunlaşma dahil olabilir (Th2) hücreleri ve eozinofiller—kriptokok akciğerenfeksiyonu9 durumda olduğu gösterilmiştir . Bu çalışmalar bağışıklık sisteminde chitinases karmaşık bir rolüne işaret.
Son yıllarda, Chit1 düzeyleri lisozomal depolama hastalıkları, bulaşıcı hastalıklar, solunum yolu hastalıkları, endokrinolojik hastalıklar, kardiyovasküler dahil olmak üzere 40'tan fazla farklı insan hastalığı için ilerleme önemli bir biyomarker olarak hizmet bulunmuştur hastalıklar, nörolojik hastalıklar vediğerleri (gözden 10). Bu hastalıkların çoğunda, Chit1 düzeyleri hastalığın şiddeti ve terapötik etkinliğigüçlübir belirleyici 10 vardır.
Chitinases Gaucher Hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda tıbbi durumlar için bir biyomarker olarak ün kazanmıştır gibi, araçlar ve tahliller chitinaz varlığı için test kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Eski yöntemler arasında Schales'in prosedürü, kan şekeri testinden uyarlanmış bir protokol ve 3,5 dinitrosalislik asit (DNS) yöntemi sayılabilir. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman duyarlı ve teknik olarak zor11. Bu testlerin her ikisi için de prosedür inorganik oksidanların azaltılmasını gerektirir, örneğin Schales prosedürü durumunda ferricyanide, sadece spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir renk değişikliği üreten. Ayrıca, her iki test de zaman alıcı ve renk12geliştirmekiçin gerekli bir ısıtma veya kaynama adım içerir 13 .
Burada açıklanan memeli örneklerinde kitinaz düzeylerini belirlemek için hızlı ve basit bir florimetrik test14,15. Burada kullanılan örneklerden ikisi serum ve bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL); kitinaz aktivitesi de anne sütü ve idrar örneklerinde ölçüldü ve teknik bu tür örneklerde yanı sıra diğer biyolojik sıvı16,17yapılabilir.

<table><tbody><tr><td>4-metilumbelliferon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Standardı: enzim aktivitesinin belirlenmesi için florimetrik tahlillerde yaygın olarak kullanılır</td></tr><tr>Fare örneklerinde kullanım için<td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>floresan kitinaz substratı İnsan örneklerinde kullanım</td></tr><tr>için<td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>floresan kitinaz substratı</td></tr><tr><td>Sitrik Asit-monohidrat</td><td></td><td></td><td>McIlvain Tampon</td></tr><tr><td>Glisininde</td><td></td><td></td> kullanım <td>için 0.3 M</td></tr><tr><td>Na2HPOsub<>4xH2O</td><td></td><td></td><td>konsantrasyonunda McIlvain Tamponunda kullanım için</td></tr><tr><td>12 g / L konsantrasyonda Durdurma Tamponunda kullanım için</td><td>NaOH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüş Plakası: Steril olmayan, işlenmemiş siyah 96 oyuklu plaka</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

biyolojik Örneklerde konitinaz aktivitesinin Ölçülmesi

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Chitinases kitin cleave enzimleridir. Hatta kitin yokluğunda, memeliler bazada da dahil olmak üzere vücutta mevcut chitinases önemli miktarda var. Konitinazın kesin rolü bilinmemektedir, ancak sırasıyla kitin içeren gıda ve patojenlere karşı sindirim ve konak savunmaönemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Son çalışmalar, bizim de dahil olmak üzere, konak bağışıklık ve alerjik hastalıklarda konitinaz ve konitinaz benzeri proteinlerin önemli bir rol göstermiştir. Daha da önemlisi, kitinaz aktiviteleri astım ve pulmoner fibrozis gibi tip 2 inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklarda hastalık şiddetinin önemli biyobelirteçleri olarak hizmet vermektedir. Benzer şekilde, Gaucher hastalığı gibi genetik bozuklukları olan hastalar önemli ölçüde yüksek kitinaz düzeyleri var, hangi sadece hastalığın şiddeti ile ilişkili değil, aynı zamanda terapötik etkinliği için güvenilir bir biyomarker olarak hizmet vermektedir. Burada özetlenen protokol, BAL veya fare lerin serum örneklerindeki kitinaz aktivitesini ölçmenin basit, hızlı ve basit bir yolunu açıklar ve enzimlerin yüksek derecede korunmuş doğası nedeniyle insan deneklere ve diğer model organizmalara yaygın olarak adapte edilebilir.

Burada gösterilen sonuçlar, yabani tip (C57BL/6) ve Chit1 transgenik farelerin (C57BL/6 arka planda) serum ve BAL örneklerinde (C57BL/6 arka planda) kitinaz aktivitesini ölçen ve Chit1 genini doksisiklin promotöründe aşırı eksprese eden bir çalışmadan elde edilebilmektedir. Verilerimiz hem serum hem de BAL örneklerinin bazal 698.2 ± 189.9 nmol/mL·h ve 485.7 ± 114 nmol/ml·h'de saptanabilir kitinaz aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. 4 hafta boyunca içme suyunda doksisiklin kullanılarak Chit1 geninin aşırı ekspresy...

Burada bronkoalveolar lavaj veya serum gibi biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçmek için basit bir yöntemdir.

Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Bu yöntem biyolojik numunelerde kitinaz aktivitesini ölçmek için daha etkili bir yol sağlar. Kitinaz aktivitesi çok sayıda durum ve hastalıklarda tanı ve terapötik etkinlik için iyi bir belirteç olarak hizmet ettiği gösterilmiştir. Kitinaz aktivitesinin ölçümü için daha önceki yöntemler genellikle zaman alıcı ve gerçekleştirmek zor, burada gösterilen tsurça tarafından çözülmüş olan her iki sorun.Bu teknik, kitinaz aktivitesinin ölçülmesini kolaylaştırarak tanısal ve terapötik belirteç olarak sahip oldukları potansiyel chitinas'ın yerine getirilmesine yardımcı olacaktır;örneğin, etkili tedavi sırasında şitinaz aktivitesinin azaldığı gösterilmiştir, çünkü Gaucher hastalığının tedavisini izlemek için kullanılabilir. Tayiyiz için yüzeyler, standartlar ve çözümler hazırlayarak başlayın. El yazması yönlere göre 1x McIlvain tampon hazırlayın ve her biri 500 mikromolar için chitin yüzeyleri seyreltmek için kullanabilirsiniz.Standart bir eğri stok çözeltisi oluşturmak için dur tamponunda 0,1 milimolar konsantrasyona 4-methylumbelliferone, standart çözünür. Her 10 örnek için, 2,17 mililitre 1x McIlvain tamponu ile 100 mikrolitre chitin substratını karıştırarak bir çalışma çözümü, ardından 96 kuyulu bir plakanın her kuyunun içine çalışan çözeltinin 95 mikrolitrepipe'ı yerleştirin. Her kuyuya test numunesinin beş mikrolitresini ekleyin ve çalışma çözeltisine karıştırın.Plakayı kapatın ve beş saniye sallayın, sonra enzimatik reaksiyonun gerçekleşmesini sağlamak için 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, beş mikromolar çalışma standart çözüm yapmak ve el yazmasına göre seyreltme bir dizi seyreltme hazırlayarak standart bir eğri oluşturmak için 4-methylumbelliferone stok çözeltisi seyreltmek. Beş mikromolar konsantrasyonu ile başlayın ve iyi her seyreltme karıştırın.Kuluçkadan sonra, reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 200 mikrolitre dur tamponu ekleyin. Aynı plakaya her standart 300 mikrolitre kopyaları ekleyin, sonra 360 nanometre bir uyarma ve 455 nanometre bir emisyon plaka okuyun. Bu protokol bronkoalveoler lavaj ve yabani tip ve chitotriosidaz aşırı ifade transgenik fareler serum sıvısında kitiyolaktiviteölçmek için başarıyla kullanılmıştır.Taht, farelerde CHIT-1 geninin aşırı ekspresyonunun kitinaz aktivitesinin artmasına neden olduğunu doğrular. Örneklerin floresansına göre konitinazı belirlemek için standart bir eğri kullanılmıştır. Protokolü ilk çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, numuneleri mümkün olduğunca hızlı ve verimli bir şekilde eklerken, tam olarak karıştırmaktır.İlk başladığınızda, daha kısa kuluçka süresi nedeniyle ölçümlerde doğruluğu sağlamak için her çalıştırma da daha az numune yapmak yararlı olabilir.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi...

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Bu videoda, çözünmeyen kromojenik biyokütle veya ICB kullanılarak bitki biyokütlesindeki kompleks polisakkaritlerin parçalanmasında etkili olan enzimlerin taranması için bir test gösterilmektedir. Enzimler, çözünür boyaya bağlı oligosakkaritleri serbest bırakmak için ICB'yi hidrolize eder ve enzim aktivitesi, reaksiyon ürününün kolorimetrik analizi ile değerlendirilir.

Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle Bazlı Enzim Taraması: Bitki Biyokütlesini Parçalayan Enzimlerin Bozunma Aktivitesini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu video, sentetik 4-Metilumbelliferil substratlar kullanılarak numunelerde α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz için enzim aktivitesinin in vitro ölçümünü göstermektedir.

α-Galaktosidaz A ve Asit α-Glukozidaz Enzim Aktivitesinin İn Vitro Ölçümü

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Bitki türevi ürünlerin antifungal etkilerini ölçmek için tasarlanmış modifiye edilmiş bir agar bazlı yöntemi açıklıyoruz. Antifungal aktiviteye hem uçucu hem de uçucu olmayan katkılar bu protokol ile değerlendirilebilir. Ek olarak, mantarlara karşı etkinlik tek bir deneysel kurulumda önemli gelişim aşamalarında ölçülebilir.

Biyokontrol Ürünlerin Uçucu ve Uçucu Olmayan Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu protokol, peptitlerin ve küçük moleküllü antifungal ajanlar gibi diğer bileşiklerin Candida albicans'a karşı antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için bir yöntemi açıklar. Büyüme inhibisyonunu ölçmek için koloni oluşturan birimleri saymak yerine optik yoğunluk kullanımı, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.

Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Bu yazıda, neotropikal anuran türlerinde biyobelirteçlerin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış ekotoksikolojik yöntemler sunulmuştur. Spesifik olarak, bu makale genetik, hücresel-histolojik, biyokimyasal, morfolojik ve bireysel seviyeler gibi farklı ekotoksikolojik değerlendirme ölçeklerinde çeşitli metodolojileri detaylandırmaktadır.

Neotropik Anuranlarda Biyobelirteçleri Farklı Ölçeklerde Değerlendirmek için Ekotoksikolojik Metodolojiler

Öğrenin, biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçme yöntemini. Bu teknik, Gaucher hastalığı gibi durumların tanı ve tedavi takibinde kitinazı biyobelirteç olarak kullanmayı kolaylaştırır.

Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet