İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Mikrofizyolojik sistemler, farmakokinetik ve insan vücudunun toksikolojik tepkisini ilgi alanlarına özgü tedavilere taklit etme yeteneğine sahiptir. Mikrofizyolojik sistemler, in vitro yöntemlerin öngörülebilir gücünü artırabileceği ve farmakokinetik ve toksikolojik çalışmaların maliyetini ve süresini azaltabileceğinden hayvan testlerinin yerini alma potansiyeline sahiptir. Test maddesi uygulamasından 24 saat önce, William ES ortamının 800 mikrolitrelik aliquot'unu iki organ yongasının daha büyük ve küçük bölmeleri arasında bölüştürün ve hazırlanan 24 kuyu plakasındaki her bağırsak bariyerinden bazolateral ve apikal ortamı aspire edin.

Steril forsepskullanarak, her iki organ yonga devresi başına bir kesici ucu daha büyük bölmeye entegre edin ve apikal tarafa 200 mikrolitre DMEMS ekleyin. Geniş delik ipuçları kullanarak, devre başına 20 karaciğer eşdeğerini iki organ çipinin daha küçük bölmesine entegre edin ve sistemi kontrol ünitesine bağlayın. Daha sonra kontrol ünitesini basınçlı hava beslemesine bağlayın ve basıncı yaklaşık olarak artı veya eksi 300 bara ve 0,3 Hertz pompalama frekansına ayarlayın.

Ertesi gün 12 mikromolar konsantrasyonstok asetaminofen çözeltisi seyreltmek. Sistemdeki ortamı değiştirmek için, iki organ çipindeki bağırsak bariyerinden bazolateral ve apikal ortam aspire edin ve organoid bazolateral taraftaki büyük bölmeye 500 mikrolitre taze uygun kültür ortamı ve küçük bölmeye 300 mikrolitre ekleyin. Kabarcıklar kontrol ettikten sonra, bağırsak kültürünün apical tarafında 12 mikromolar asetaminofen çözeltisi 200 mikrolitre eklenmesi ile oral uygulama öykünmek ekler ve kontrol ünitesine mikrofizyolojik sistem bağlayın.

Hem intestinal apikal hem de bazolateral kenarlardan ve belirtilen zaman noktalarında triplicate küçük bölmeden toplam hacmi toplamak. Tüm numuneler toplandığında, HPLC analizi için ilgili tüm parametreleri tabloda belirtildiği şekilde ayarlayın ve mobil fazı vakum altında 0,4 mikron membran filtresinden filtreleyin. Daha sonra numuneleri 0,22 mikron gözenek boyutunda PVDF şırınga filtresinden filtreleyin ve HPLC UV ölçümüne başlamadan önce numuneleri bir şişede saklayın.

Organoid canlılığını değerlendirmek için, her çoğaltma dan tüm 20 küresel oidleri 96 kuyu plaka bireysel kuyulara aktarın ve hücre kültürü 24 kuyu plaka bireysel kuyular ekler aktarın. Doku eşdeğerlerini yıkama başına taze DPBS ile üç kez yıkayın ve her deneysel kuyuya mililitre Başına bir miligram lık MTT çözeltisine 300 mikrolitre ekleyin. Hücre kültürü kuluçka üç saat kuluçka sonra, bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri MTT formazan ayıklamak için dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için iyi başına 200 mikrolitre izopropanol ile MTT çözeltisi değiştirin.

Ertesi sabah, 96 kuyu plaka uygun kuyuya her supernatant 200 mikrolitre aktarın ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında her zaman noktasının ortalama optik yoğunluğunu kullanarak MTT azaltmak için hücrelerin göreceli yeteneğini hesaplama sağlamak için 570 nanometre bir plaka okuyucu formazan okuyun. Örneklerin sitokimyasal ve histolojik analizi için, önce oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 0,1 molar PBS'de %4 paraformaldehitte bağırsak ve karaciğer eşdeğerlerini düzeltin. Kuluçka sonunda, tetrameethylrhodamine izothiocyanate phalloidin Alexa Flor 647 phalloidin oda sıcaklığında bir saat boyunca bağırsak ve karaciğer eşdeğerleri boyama önce, yıkama başına 10 dakika PBS beş kez organoidler yıkayın.

Kuluçka sonunda, sıvı nitrojen dokuları dondurma önce birkaç dakika için dondurucu ortama örnekleri aktarın. Daha sonra, 10 ila 12 mikron kalınlığında karaciğer küresel kriyo-kesitleri elde etmek ve konfokal floresan mikroskopi ile görüntüleme için DAPI ile montaj orta doku bölümleri monte etmek için bir kriyostat kullanın. Mitokondriyal ve nükleer boyama için, %5 karbondioksit içeren nemli bir atmosferde 37 derecede 15 ila 45 dakikalık bir kuluçka için numuneleri mitokondriyal boyama çözeltisi ile tamamen kapatın.

Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de %2-4 paraformaldehit ile boyama çözeltisini dikkatlice değiştirin. Sabitlemeden sonra, numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca nükleik asit boyama çözeltisi ile etiketlemeden önce hücreleri yıkama başına beş dakika boyunca taze PBS ile iki kez hafifçe durulayın. Kuluçka sonunda, numuneleri ışıktan korunan PBS'de üç, beş dakikalık yıkamalarla yıkayın ve uygun filtre setleri ile floresan mikroskoptaki mitokondriyal leke ifade eden hücrelerin sayısının ölçülmesini kolaylaştırmak için nükleik asit lekesini kullanın.

İnsan bağırsak bariyerini ve karaciğer eşdeğerinin iki organ çipi mikroakışkan cihazına entegre edilmesi, ilgi çekici tedavilerin farmakokinetik ve toksikolojik özelliklerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Tedaviden sonra, medya örnekleri HPLC ile analiz edilebilir. Organoidler gen ekspresyonu, trans-epitel elektriksel direnç değerleri, protein ekspresyonu ve aktivitesi ve morfolojik özellikleri açısından analiz edilebilir.

MTT analizi organoid canlılığı değerlendirmek için yapılabilir, yanı sıra asetaminofen tedavisine yanıt olarak çok erken toksik olayları tespit etmek için. Medya akışı önemli ölçüde asetaminofen emilimini etkilemez, önemli ölçüde karaciğer eşdeğer işlevselliğini artırır ise, insan bağırsak asetaminofen emilimi ve hepatik metabolizma bu mikrofizyolojik sistemde taklit edilebilir gösteren. Mikrofizyolojik sistemler, insan fizyolojisini daha iyi taklit ettikleri için ilaç geliştirme ve keşifteki hayvan modellerinin yerini alabilen ve daha yüksek hızda ilaç gelişimini teşvik etmek ve risk ve karmaşıklığa daha düşük maliyetle teşvik etmek için kullanılabilir.