Name: Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Keşfedin mikroakışkan kanser-on-chip modeli ile tek hücre düzeyinde kanser dinamiklerinin uzun süreli gerçek zamanlı nicel analizini. Bu yöntem, karmaşık tümör popülasyonlarının evrimsel davranışlarını incelemek için fizyolojik olarak daha uygun bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NSF PHY-1659940 tarafından desteklenmiştir.

1. Mikroakışkan cihazın imalatı
<ol><li>Bir düzen tasarım yazılımı kullanarak istenilen mikroakışkan deseni oluşturun (Bkz. Ek Malzemeler).</li>
	<li>Fotomaskeyi üret. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>Bir lazer yazar kullanarak, cr 100 nm ve photoresist AZ1518 500 nm ile kaplı bir soda-kireç cam plaka üzerinde desen yazın.</li>
		<li>60 s için geliştirici AZ300MIF ile photoresist geliştirin.</li>
		<li>Cr-7 Krom Etchant kullanarak fotodirençten korunmadan kromu uzaklaştırın.</li>
		<li>70 °C'de 45 dakika boyunca fotodirenç lisi kullanarak artık fotodirençten sıyırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Foto-dayandak desen. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>40 s için 4000 rpm silikon gofret üzerinde Spin ceket HMDS.</li>
		<li>40 s için 4000 rpm silikon gofret üzerinde Spin ceket photoresist AZ4330.</li>
		<li>Yumuşak fırında silikon gofret 95 °C 60 s.</li>
		<li>UV'yi silikon gofrete maruz bırakmak için maske hizalayıcısını kullan.</li>
		<li>4 dakika boyunca geliştirici AZ300MIF ile photoresist geliştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DRIE gravür gerçekleştirin. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>100 μm derinlikte Silikon Derin Reaktif Iyon Gravür (DRIE) sistemi kullanarak fotodirenç ile desenli gofret kuru-etch.</li>
		<li>Bir plazma etcher ile aseton ve plazma etch ile photoresist kapalı şerit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gofret oksidasyonu ve silanizasyon. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>1100 °C'de fırında kazınan silikon gofret üzerinde 1 saat termal oksidasyon gerçekleştirin.</li>
		<li>Silikon gofret soğumasını bekleyin ve sonra trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) birkaç damla gofret yakın küçük bir kapta damlamış bir desiccator içine gofret yerleştirin.</li>
		<li>60 dakika oda sıcaklığında 0,5 atm için kurutucu basıncı pompalayın. Silikon gofret kalıp uygun silanizasyon dan sonra hidrofobik haline gelmelidir, hangi gofret üzerine su birkaç damlacıkları ekleyerek test edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yumuşak litografi. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>Ağırlık oranına göre 10:1'de ön polimer ve çapraz bağlayıcıyı (polimetilsiloksane (PDMS) kitinden) karıştırın.</li>
		<li>Silanized silikon gofret kalıp üzerine yüksekliği 10 mm film oluşturmak için karışık PDMS dökün.</li>
		<li>Degas 30 dakika için bir kurutucu ortaya çıkan PDMS-silikon gofret sistemi 1 saat.</li>
		<li>PDMS'yi tedavi etmek için bir gecede 70 °C'lik bir kuluçka makinesinde PDMS-silikon gofret inkübün.</li>
		<li>PDMS iyileştikten sonra, SILIKON gofretinip pdfms filmini dikkatlice soyun.</li>
		<li>Biyopsi iğneleri kullanarak, PDMS'deki desenin konumuna göre giriş portlarında delik açmak ve 27 mm çapındaki talaşları kesmek için dairesel bir zımba kullanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS katman yapıştırma.<ol>
<li>Isı 27 mm PDMS silindir (desenolmadan) iki yığın kür, hangi rezervuar tabakası ve cihazın kapama tabakası olacak.</li>
		<li>Rezervuar tabakasındaki girişlerin etrafında 7 mm'lik iki daire kesin ve kapama katmanındaki giriş bağlantı noktalarında delikler açmak için biyopsi iğnesi kullan.</li>
		<li>Üç pdms destesini (desenli yığın, rezervuar tabakası, kapama tabakası) oksijen plazma sıyrıkile bağlayın.</li>
		<li>Biyopsi iğnesi ile, çıkışları ve cihazın merkezi bağlantı noktasında delik leri delin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Medya ve hücre hattı hazırlama
<ol><li>PC3-EMT ve PC3-EPI dahil olmak üzere PC3 hücre hatları, kültür ortamı için ortam hazırlayın: mix RPMI 1640 orta ile 10% fetal sığır serum (FBS) ve 1x antibiyotik-antimikotik. Daha önce açıklandığı gibi hücre hatları oluşturun14. NOT: PC3 hücre hatları 37 °C'de nemlendirilmiş kuvözlerde %5 CO2ile yukarıdaki ortamda muhafaza edilmektedir. Hücreleri ve alt kültürü her 3 günde bir % 100 biraraya gelmeden önce ayırın.</li>
	<li>Daha iyi görüntüleme için sitoplazmik etiketli floresan belirteçleri ile Transfect hücre hatları, daha önce açıklandığı gibi12, PC3-EMT sitoplazmik GFP ifade eder ve PC3-EPI sitoplazmik mCherry ifade eder. Teknolojinin floresan etiketli hücrelerin yanı sıra etiketlenmemiş hücrelerin parlak alan görüntülemesiyle de uyumlu olduğunu unutmayın.</li>
</ol>3. Deneysel kurulum
<ol><li>Metal plaka tutucu imalatı<ol>
<li>İşleme veya 3D baskı ile paralel deneyler için eşzamanlı gaz geçirilebilir kültür yemeklerini tutmak için yeterli olan bir plaka tutucu üretin. 3D CAD dosyası ("3-iyi plaka. FCStd") GitHub'da referans olarak bulunabilir (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Tutucunun(Şekil 2)bileşenlerini bir tornavida ile sökün. Bileşenleri UV ışınlarına maruz kalım yoluyla en az 1 saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın. NOT: Tutucu, hava akımına izin veren gaz kanalı girişleri ile termal denge ve ideal gaz bileşimleri için önemli koşullar sağlamak üzere tasarlanmıştır. Daha fazla bilgi bizim önceki çalışma12bulunabilir.</li>
		<li>Hücre kültürü zarının nispeten esnek olduğu en fazla üç gaz geçirilebilir kültür yemeği hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre hattı tohumlama<ol>
<li>Denemenin başlamasından 24 saat önce, 5 dakika için trypsinization tarafından PC3-EPI ve PC3-EMT hücreleri hasat. Önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin, sonra santrifüj 150 x g 3 dakika için ve supernatant atın.</li>
		<li>Her PC3-EPI ve PC3-EMT'nin hücrelerini hemositometre kullanarak sayın ve her gaz geçirgen kültür yemeği için her hücre tipinden toplam 2,5 x 104'ü izole edin.</li>
		<li>Kültür medyasının 2 mL'lik iki hücre türünü karıştırın ve yeniden askıya alın ve hücreleri gaz geçirgen kültür çanağının her birine yerleştirin.</li>
		<li>Hücrelerin bağlanması için tüm plaka tutucuyu bir gecede kuvözde bırakın.</li>
		<li>PDMS cihazlarını UV ışınları ile en az 1 saat dezenfekte edin ve steril bir ortamda bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Termal kontrol ünitesi ve gaz besleme sisteminin kurulması<ol>
<li>Şekil 3'tegösterildiği gibi, hem CO2 hem de O2 kontrol üniteleri, gaz pompası, gaz karıştırma odası, nemlendirici veya kabarcık ve üç ayrı gaz vanası ve basınç ölçer setinden oluşan bir gaz besleme sistemi kurmak. Daha fazla bilgi bizim önceki çalışma12bulunabilir.</li>
		<li>CO2 ve O2 kontrol ünitelerini, CO 2 ve N2 tanklarından ve O2 kaynağından gelen gazın karıştırma hızını ayarlayabilen şekilde ayarlayın. Alternatif olarak, normoksia koşulu altında gaz sağlayan herhangi bir gaz besleme sistemi çalışacaktır.</li>
		<li>Karıştırma odasında birleştirilen ve bir kabarcık tarafından nemlendirilen gazın bağıl nem oranının %85'e kadar arttırIldiğinden (bağıl nem monitöründen okunduğu gibi) ve gazın basınç göstergelerine sahip üç bağımsız gaz vanasına yol açtığından emin olun plaka tutucuda gaz akış hızını kontrol edin ve izleyin.</li>
		<li>Tüm plaka tutucuyu, kapak ve alt plaka için ayrı ısıtma alt üniteleri ile 37 °C olarak ayarlanmış bir kademeli kuluçka termal kontrol ünitesine yerleştirin. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikroakışkan cihazın kurulumu. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol>
<li>Şekil 2'deolduğu gibi, 3 kuyulu plaka tutucunun ayrıntılı bileşenlerinin sırayla olduğunu belirleyin. Her üç kuyu nun her biri aynı ve bağımsızdır ve her kuyu için bir çift gaz kanalı vardır. Her kuyuda gaz geçirilebilir kültür çanak tutucusu, BIR PDMS yonga tutucu, cam pencere tutucu ve 35 mm cam pencere bulunmaktadır. Bu bileşenler, monte edilmiş vidalar kullanılarak monte edilebilir. NOT: Cam pencereler, gaz geçirgen kültür membranı ile kuyu arasında ısıyalıtımlı bir boşluk olmasını sağlar, bu sayede arayüzdeki sıcaklık farklılıkları nedeniyle su yoğuşması oluşmaz. 3 kuyunun bağımsız olduğunu ve 3 denemenin ayrı olarak yapılabileceğini unutmayın.</li>
		<li>37 °C'de sıcak öncesi kültür ortamı ve 20 dk.lık bir vakum odasında gaz gaz.</li>
		<li>Hidrofililiği korumak için PDMS yongalarını 30 s'lik oksijen plazma sistemi kullanarak tedavi edin.</li>
		<li>Şırınga sistemini kur. Büyüme ortamı ve diğer iki şırınga ile birlikte iki şırıngayı istenilen reaktifle (medya, ilaçlı medya, vb.) yavaşça yükleyin. Her bir şırıngayı 50 cm'lik bir boruya (0,020" x 0,060"OD) 23 G dağıtım iğnesi ile tek bir içi boş çelik iğneye bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın.</li>
		<li>Boruyu asallayın ve çelik pimi kapama katmanı üzerinden her PDMS yongasına takın. Rezervuar katmanını doldurun ve PDMS desen katmanı deseni ortamla ıslayın. Rezervuar tabakası mikroakışkan desen içine girmesini hava kabarcıkları önlemek için bir çip kabarcık tuzak olarak çalışır.</li>
		<li>Kültür ortamı ile 1 mL şırınga yükleyin. Şırıngayı 5 cm'lik bir boruya (0,020" x 0,060"OD) 23 G dağıtım iğnesi ile içi boş bir çelik iğneye bağlayın. Tüpün diğer ucuna içi boş bir çelik pim takın ve boruyu asal.</li>
		<li>Çipin orta deliğine içi boş çelik pimi yerleştirin, talaş sızdırmazlık işlemi sırasında talaştan daha sonra aşırı ortam çıkarılabilir.</li>
		<li>Her PDMS cihazı bir şırınga pompasına yüklenen dört adet 10 mL şırınga gerektirdiğinden, ön güvertedeki talaş başına iki adet 10 mL şırınga yükleyin. Diğer iki şırıngayı şırınga sisteminin geri çekilme güvertesine yerleştirin.</li>
		<li>Çipi doğrudan gaz geçirilebilir kültür zarlarının üzerine yerleştirin (zaten zarlara yapışmış hücrelerle). Mikrokabarcıkları mikroakışkan desene sokmamak için, 1 mL önceden ısıtılmış ve gazsız ortamı montajdan önce 35 mm gaz geçirgen kültür kabına dağıtın ve ardından çipin sıvı yüzeye 15 derecelik eğim açısıyla yaklaştırdığından emin olun.</li>
		<li>PdMS yonga tutucusu PDMS cihazını aşağı doğru iterek, her bir çip için gaz geçirilebilir kültür çanağı ve kuyuyu sıkın.</li>
		<li>PDMS cihazının üstüne bir fırıncı kağıdı bantlayın ve çipin kurumasını önlemek için PDMS yonga tutucusuyla kenetleyin.</li>
		<li>Dizi nin etrafındaki ortam akış hızını 20 μL/h olarak ayarlayın.</li>
		<li>Tüm plakayı sahnedeki inkübatörde ters bir mikroskobun motorlu aşamasında ayarlayın. Gaz besleme sistemini gaz kanallarına bağlayın ve cihazın sızdırmazkalmasını sağlamak için gaz geçirilebilir kültür membranını kurulu PDMS çipe karşı basınçlandırın. Gösterge basıncını 0,2 psi (1,4 x 104 Pa) koruyun.</li>
		<li>Orta deki delikten 1-mL şırıngayı kullanarak çipteki aşırı ortamı yavaşça ayıklayın. Ortamı ayıklarken mikroskop altında çipi gözlemleyin ve talaş mühürlendiğinde çıkarmayı bırakın. Hücrelerin bir kısmı mikro yapılar tarafından ezileceği için talaş sızdırmazlığı belirgin olmalıdır.</li>
		<li>Sahnedeki inkübatörün sıcaklık algılama ünitesini 3 kuyulu plakaya bağlayın ve 37 °C'ye ayarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tek hücreli zaman atlamalı görüntüleme
<ol><li>Ters görüntü elde etmek için ters bir mikroskop kullanarak görüntüleme yazılımı ayarlayın. Bir EA deneyi için tam motorlu x-y aşaması, odak düğmesini, deklanşörünü ve filtre küplerini içeren ters floresan mikroskobun gerekli olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Bir tur otomatik netlemeden sonra otomatik görüntü dikişi ile her bir yonga için 10kat büyütme de iki kanal boyunca görüntü elde etmek için yazılım yapılandırın. Perfect Focus gibi otomatik düzeltme sistemlerinin tatmin edici görüntü kalitesini garanti etmediğini unutmayın. Daha fazla yonga genelinde otofokus veya manuel odaklama dayalı uzun vadeli görüntü edinimi için özelleştirilmiş bir odak yüzeyi oluşturmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Her saat fotoğraf çekmek ve deneme hafta zaman ölçeğinde çalışan bırakın. Görüntü kalitesini günlük olarak izleyin ve gerekirse odak yüzeyini güncelleyin.</li>
	<li>Daha önce açıklandığı gibi, sonraki immünofloresan analizi için PDMS çip ve gaz geçirilebilir kültür çanak hazırlayın13.</li>
</ol>5. Görüntü işleme ve analizi
<ol><li>Deneysel işlem sonrası<ol>
<li>Fiji/ImageJ kullanan görüntü işleme ve ölçümler için görüntüleri TIFF biçimine dönüştürün.</li>
		<li>Daha fazla görüntü işleme kolaylığı için TIFF dosyalarını sıkıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiji/ImageJ analizi<ol>
<li>Hücreleri tanımlamak için, hücre konumu algılama ve otomatik hücre sayma için floresan parlak noktaları tanımlamak için Arka Plan Çıkarma ve Parçacık Analizi gerçekleştirin.</li>
		<li>Hücre hareketliliğini ve geçişini analiz etmek için eklentileri (Manuel İzleme, Kemotaksis, Geçiş Aracı, Trackmate) kullan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analogy+between+the+evolution+of+drug+resistance+in+bacterial+communities+and+malignant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).</li>
<li>Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+penetration+of+anticancer+drugs+through+tumor+tissue%3A+a+potential+cause+of+resistance+of+solid+tumors+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).</li>
<li>Grantab, R. H., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+anticancer+drugs+through+tumour+tissue+as+a+function+of+cellular+packing+density+and+interstitial+fluid+pressure+and+its+modification+by+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib.</a> BMC Cancer. 12, 214(2012).</li>
<li>Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Heterogeneity+in+Drug+Concentrations+Can+Facilitate+the+Emergence+of+Resistance+to+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy.</a> PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142(2015).</li>
<li>Bogorad, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microvessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).</li>
<li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine%3A+From+chip+to+the+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li>
<li>Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-vessel-on-a-chip+models+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery.</a> Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li>
<li>Wu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+hot+and+cold+genes+and+chemotherapy+resistance+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).</li>
<li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+and+mesenchymal+prostate+cancer+cell+population+dynamics+on+a+complex+drug+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Convergent+Science+Physical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape.</a> Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001(2017).</li>
<li>Lin, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heterogeneous+environment+and+docetaxel+gradient+in+the+emergence+of+polyploid%2C+mesenchymal+and+resistant+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).</li>
<li>Roca, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+OVOL1+and+OVOL2+induce+the+mesenchymal+to+epithelial+transition+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer.</a> PloS One. 8 (10), e76773(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trackmate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Caballero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-chip+models+of+cancer+metastasis+for+future+personalized+medicine%3A+From+chip+to+the+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient.</a> Biomaterials. 149, 98-115 (2017).</li>
<li>Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flaws+and+human+harms+of+animal+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cambridge+Quarterly+of+Healthcare+Ethics%22%5BJournal%5D)">The flaws and human harms of animal experimentation.</a> Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li>
<li>Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+in+vitro+microvessel+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Review: in vitro microvessel models.</a> Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).</li>
<li>Zañudo, J. G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+control+of+cellular+decision-making+networks+in+the+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).</li>
<li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+population+solitary+waves+can+defeat+rings+of+funnels%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels.</a> New Journal of Physics. 19 (3), 035002(2017).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmemiş.

Konvansiyonel hücre kültürü neredeyse bir yüzyıl önce geliştirilen ve biyomedikal araştırmalarda en sık kullanılan preklinik modeli kalır, kanser klinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen17. Hayvan modelleri en yüksek fizyolojik alaka ve insanlar için makul genetik benzerlik sunuyoruz, ama uzun insan sonuçları tahmin önemli sınırlamalar olduğu kabul edilmiştir18. Tüm mevcut preklinik modeller arasında, mikroakışkan kanser-on-çip modelleri kans...

Kanser giderek mutasyona uğramış hücre popülasyonlarının sürekli disregülasyon değil, aynı zamanda kanser hücreleri ve konak mikroçevre arasındaki hayati etkileşimlere bağlıdır karmaşık bir ekosistem olarak kabul edilmiştir. Bu anlamda, kanser, heterojen bir tümör mikroçevre ve konak hücrelerin çeşitli ile crosstalk da dahil olmak üzere faktörlerin bir kombinasyonu ile tezahür adaptif bir manzara üzerinde gelişir, tüm bunlar daha fazla genetik veya daha fazla seçici baskılar katkıda epigenetik değişiklikler1,2,3. Solid tümörler bağlamında, kefireutics ve diğer kaynak gradyanlarının düzensiz dağılımı moleküler heterojenitelerine katkıda bulunur ve ilaç direncigelişiminde rol oynayabilir, belirli tümöre anjiyogenez artmış alt popülasyonlar ve hatta metastaz4,5,6. Konvansiyonel in vitro 2D hücre kültürü çalışmaları, büyük ölçekli, uygun deneysel kapasiteye sahip iken, ortalama alan sağlar, üniforma, ve sabit koşullar, genellikle gerçekten gerekli hassas mekansal ve zamansal çevresel kontrol yoksun in vivo tümör dinamikleri taklit. Bu nedenle, kanser insidansının daha iyi tahmin edilebilmesi ve dinamik stres içindeki ilaçlara verilen tepkilerin daha iyi tahmin edilebilmesi için, ilaç geliştirme boru hattındaki hayvan modellerinden önce tümör mikroçevresini yeniden üretmek için daha fazla temsili ex vivo modeline ihtiyaç vardır. Manzara. Mikroakışkanlar 2D hücre kültürü çalışmaları ve kontrol edilebilir kantitatif çalışmaları desteklemek mümkün olmayabilir vivo hayvan çalışmaları daha karmaşık arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir7,8,9.
Kanser hücre dinamiklerini karakterize etmek için ideal bir in vitro sistem, bir tümörde meydana gelen adaptif hücresel yanıtları taklit etmek için heterojen bir mikroortam oluşturma yeteneğine sahip olmalıdır, hem de bu dinamiklerin gözlem için izin tek hücreli çözünürlük. Bu makalede, bir mikroakışkan hücre kültür platformu, bir PDMS tabanlı cihaz "Evrim Hızlandırıcı" (EA), hücresel çözünürlükte kanser hücre dinamikleri paralel in vitro çalışmalar için izin veren bir gerçek zamanlı veri toplama üzerinde hafta ders, stably kültür manzara genelinde stres degradeleri korurken. Bu platformun tasarımı, metapopülasyondaki organizmaların evrimsel dinamiklerinin10,11hızlandırılabildiği önceki çalışmamıza dayanmaktadır. Özellikle, bir düzeyde etkileşim mekansal olarak ayrılmış popülasyonlar bir grup, heterojen bir stres manzara maruz kaldığında, en uygun türler daha hızlı büyük bir tektip nüfus ile karşılaştırıldığında yerel bir popülasyonhakim olabilir. Avantajlı türler daha sonra kaynak ve uzay arayışı içinde komşu mikrohabitatlara göç eder ve sonunda tüm popülasyona hükmeder. Şekil 1'degösterildiği gibi, mikroakışkan EA yongasının deseni (i) taze ortam sirkülasyonu sağlayan ve kimyasal difüzyon için sabit sınır koşulları oluşturan bir çift serpantin kanaldan ve (ii) altıgen hücre kültür bölgesinden oluşur. merkezde 109 birbirine bağlı altıgen ve 24 yarı altıgen odaktan oluşan petek yapısına benzer. Çip 100 μm derinliğindedir. Medya kanalları ve hücre kültürü bölgesi, doğrudan medya akışını ve hücre kültürü alanında ortaya çıkan kesme stresini önleyen küçük kilerek (yaklaşık 15 μm genişliğinde) bağlanır, ancak yine de kimyasalların küçük kerektonlar aracılığıyla dağılmasına ve besin alışverişine izin verir, metabolik atık, vb. Kimyasal degradelerin üretimi Şekil 1B'degösterilmiştir, bir medya kanalı 0.1 mM floresan içerirken diğer kanalfloresan içermez. Hücreler, mikroyapılar tarafından çipe karşı membran üzerindeki pozitif geri basınç yoluyla kapsüllenen, geçirilebilir bir gaz membranı üzerinde kültürlenir. Cihaz tutucunun bileşenleri Şekil 2'degösterilmiştir ve deneysel kurulum Şekil 3'tegösterilmiştir , burada kültür 37 °C'de ters bir mikroskop üzerinde korunur, %85'in üzerinde bağıl nem ile ve normoksia gaz bileşimi.
Bu sistem, brightfield ve floresan kanallar aracılığıyla lokalize hücresel etkileşimlerin ayrıntılı gözlemini sağlar ve immünoffloresan, Batı lekeleri veya kütle spektrometresi gibi mekansal olarak çözülmüş downstream tahlillerine olanak sağlar. Daha önce epitel ve mezenkimal PC3 prostat kanseri hücrelerinin uzun vadeli ortak kültür bu mikroakışkan kanser-on-chip modelinin bir kanıtı olarak göstermiştir12 yanı sıra ilaca dirençli poliploid dev ortaya çıkması epitel PC3 hücre hattı13kullanarak kanser hücreleri . Biz docetaxel bir stres gradyanı altında epitelyal PC3 ve mezenkimal prostat kanseri hücrelerinin spatiotemporal dinamikleri anlamak için bu platformun uygulama sunarken, mikroakışkan sistem kolayca hücre hatlarının herhangi bir kombinasyonu uygulanabilir ve kaynak (yani, ilaç, besin, oksijen) degradeler.

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Luer-Lok uçlu şırıngalar</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x anti-anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Fotorezist geliştirici</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Fotorezist</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Fotorezist</td></tr><tr><td>Cr Krom Aşındırıcı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ lazer yazıcı</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66 +</td> <td>Yazma fotoğraf maskesi</td></tr><tr><td>Heksametildisilazan (HMDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Fotorezist yapışma geliştirme için</td></tr><tr><td>İçi boş çelik pimler</td><td>Yeni İngiltere Küçük Tüp</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp;. 025 OD .017 ID x .500 uzun / tip 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Isıtma Sistemi, Çok Kuyulu Plakalar, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>Sahne üstü inkübatör&nbsp;</td></tr><tr><td>Luer-Lok 23 G dağıtım iğnesi</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Şırıngaları ve boruları bağlamak için</td></tr><tr><td>Lumox kabı 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Gaz geçirgen hücre kültürü kabı</td></tr><tr><td>Mikropozit Sökücü 1165</td><td>Dow Elektronik Malzemeler</td><td>Mikropozit Sökücü 1165</td><td>Fotorezist sıyırıcı</td></tr><tr><td>Microseal B Yapıştırıcı</td><td>Mühürleyen Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>Yapıştırıcı mühürleyici</td></tr><tr><td>O-Ring (Lumox plaka sızdırmazlığı için)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Çizgi No. 27; 1-5/16" Kimlik x 1-7/16" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>O-Ring (alt cam pencere sızdırmazlığı için)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Gösterge Paneli No. 20; 7/8" Kimlik x 1" OD; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Plazma Temizleme/Aşındırma Sistemi</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>Oksijen plazma sistemi</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco</td><td>RIE800iPB</td><td>Derin reaktif iyon aşındırma sistemi</td></tr><tr><td>Suss MA6 maske hizalayıcı</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td><td>Maske hizalayıcı&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS elastomer</td></tr><tr><td>TePla M4L plazma aşındırıcı</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>Plazma aşındırıcı</td></tr><tr><td>Trikloro-1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil-silan (PFOTS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Silikon gofret silanizasyonu için</td></tr><tr><td>Tygon mikro delikli tüp (0.020 "x 0.060")</td> <td>Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td>Borular Medya teslimi için</td></tr></tbody></table>

gerçek zamanlı gözlem için mikroakışkan evrim hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında heterojen İlaç gradyanların Üretimi

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

Konvansiyonel hücre kültürü en sık kullanılan preklinik model olmaya devam etmektedir, kanserklinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen. Mikroakışkan kanser-on-chip modelleri, güvenilir ve tekrarlanabilir kantitatif sonuçlar üretmek için sınırlı yeteneği olan aşırı basitleştirilmiş konvansiyonel 2D kültürler ve daha karmaşık hayvan modelleri arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir. Burada, karmaşık bir tümör mikroortamının temel bileşenlerini kapsamlı bir şekilde üreten, ancak kanser dinamiklerinin sağlam kantitatif açıklamalarını sağlayacak kadar basit olan mikroakışkan kanser-on-chip modelini salıyoruz. Bu mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı," heterojen kemoterapötik stres manzara oluştururken tümör mikroortamların birbirine bağlı bir dizi içine kanser hücrelerinin büyük bir nüfus ayırır. İlerleme ve ilaç gradyan yanıt olarak kanser evrimsel dinamikleri gerçek zamanlı olarak haftalarca izlenebilir, ve çok sayıda downstream deneyler deneyleri boyunca alınan zaman atlamalı görüntüleri tamamlayıcı yapılabilir.

Çipte optimum hücre büyümesinin doğrulanması Deney platformunun temel amacı, karmaşık bir tümör mikroortamında ki temel bileşenleri ve etkileşimleri kapsamlı bir şekilde yeniden üretmektir, ancak nicel, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlayacak kadar basittir. Bu amaca ancak fiziksel ve biyokimyasal çevresel faktörlerin tam kontrolü ne olursa olsun ulaşılabiliyor. İstenmeyen faktörleri dışlamalı veya popülasyon davranışlarını doğru yorumlamak için kontrol edileme...

Tek hücreli de iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamikleri uzun vadeli gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlayan bir mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı" teknolojisi saiyoruz Düzey. Bu teknolojinin temel araştırma veya klinik öncesi ilaç geliştirme için bir in vitro model olarak çalışması beklenmektedir.

Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Evrim hızlandırıcı dediğimiz bu mikroakışkan on-chip modeli, tek bir hücre düzeyinde iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamiklerinin uzun vadeli, gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlar. Bu teknoloji, kanserin evrimsel dinamiklerini tümör benzeri bir stres ortamında araştırmamızı sağlıyor. Morfoloji, popülasyon, hareketlilik ve hücresel düzeyde zaman içinde göç gibi bilgileri sağlar.İyi kontrollü stres gradyanları altında karışık tümör popülasyonlarının davranışlarını kontrol etme ve izleme becerisi ile teknolojimiz klinik öncesi ilaç gelişimi için fizyolojik olarak daha uygun bir model sunabilir. Sunulan basınçlı sızdırmazlık paketleme yöntemi, ortam gazı bileşiminin ve aşağı akım deney kapasitesinin sofistike ayarını gerektiren diğer mikroakışkan sistemlerde de uygulanabilir. Uzun süreli bir deneyi başarıyla gerçekleştirmenin anahtarları, fiziksel ve biyokimyasal olarak istikrarlı bir ortamı güvence altına almaktır.Sıcaklık, nem ve gaz bileşimi gibi faktörler her zaman izlenmelidir. Başlamak için, bir 3D baskı makinesi üzerinde eşzamanlı gaz geçirilebilir kültür yemekleri tutmak için yeterli bir plaka tutucu imal. Vidalı sürüc

generation-heterogeneous-drug-gradients-across-cancer-populations-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, iyi tanımlanmış mikroçevresinin mekansal ve zamansal degradeleri üretebilir degrade üreten mikroakışkan cihaz mikroimalat için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, degrade üreten mikroakışkan cihaz yönlendirilmiş hücre göçü, embriyogenez, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı çalışma için kullanılabilir.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

Biz heterojen tümör mikroçevrelerde yeniden bir mikroakışkan cihazın imalat ve operasyon için prosedür...

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

Primer multipl miyelom hücreleri için yüksek verimli bir ilaç duyarlılık testi tanımlıyoruz. Çok kuyulu plakalarda kemik iliği mikro çevresinin (hücre dışı matriks ve stroma dahil) yeniden yapılandırılmasından ve hücre canlılığının uzunlamasına ölçülmesi için invaziv olmayan bir yöntemden oluşur.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

Kimyasal ve oksijen gradyanlarının kontrolü hücre kültürleri için esastır. Bu makale, hücre göçü çalışmaları için kimyasal ve oksijen gradyanlarının kombinasyonlarını güvenilir bir şekilde üretebilen ve karmaşık enstrümantasyon olmadan biyolojik laboratuvarlarda pratik olarak kullanılabilen bir polidimetilsiloksan-polikarbonat (PDMS-PC) mikroakışkan cihazını bildirmektedir.

Hücre Göç Çalışmaları altında Dik Kimya ve Oksijen Gradyanların için polidimetilsiloksan-polikarbonat mikroakışkan Cihazlar

Hastalık göstergeler çok çeşitli, daha fizyolojik ilgili modelleri gelişmiş ve içine uygulanan ilaç bulma programları davranıyorsun. Burada açıklanan yeni modeli sistemi pulcuklarının kültürlü ve yeni Onkoloji uyuşturucu aramak için bir yüksek üretilen iş 1536-şey plaka tabanlı sistem festivalde nasıl üç boyutlu tümör göstermektedir.

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Hipoksi tümör mikroçevriminin ayırt edici özelliğidir ve kanserin ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar. Bu makalede, hipoksiye bağlı bir kanser patolojisini yeniden canlandırmak için 3D hücre baskı teknolojisine dayanan çip üzerinde hipoksik bir kanserin fabrikasyon süreci açıklanmaktadır.

Katı Kanserin Patolojik İlerlemesinin Yeniden Kapsüllenilmesi için Çip Üzerinde 3D Hücre Baskılı Hipoksik Kanser

Keşfedin mikroakışkan kanser-on-chip modeli ile tek hücre düzeyinde kanser dinamiklerinin uzun süreli gerçek zamanlı nicel analizini. Bu yöntem, karmaşık tümör popülasyonlarının evrimsel davranışlarını incelemek için fizyolojik olarak daha uygun bir platform sunar.

Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi

Daha fazla video keşfet