İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi
18 Eylül 2019
İskelet kasının kardiyotoksin aracılı yaralanması ve kendi kendine teslim edilen siRNA enjeksiyonunun bir kombinasyonunu kullanarak uydu hücrelerinde belirli bir genin fonksiyonel kaybını araştırmak için in vivo yöntemini tanımlıyoruz.
Bu teknik yılan zehri kardiyotoksinin intramüsküler enjeksiyon kombinasyonu sağlar, kendi kendine teslim siRNA intramüsküler enjeksiyon, böylece iskelet kasıre analizine izin. Kendi kendine teslim siRNA uygulaması kas rejenerasyonu sırasında tek genlerin fonksiyonel kaybını araştırmak için zarif bir yoldur, böylece transgenik hayvanlar kaçınarak. Ayak çimdik yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, pençe diz den kranial alt bacak enjeksiyon alanı tıraş, ve herhangi bir gevşek saç kaldırmak.
Fareyi steril bir cerrahi bezle kaplı bir başlık yastığına supine durumuna yerleştirin ve kafatası alt bacağının enjeksiyon alanını dezenfekte etmek için %70 etanol kullanın. Sonra, 29-gauge iğne ile donatılmış bir insülin şırınga yük, 20 mikromolar kardiyotoksin 50 mikrolitre ve kas içine tam deri delmek, sadece diz distal. İğne yerinde olduğunda, kas Tam uzunluğu boyunca 10-20 saniyelik bir doğum süresi boyunca kardiyotoksin enjekte, ileri ve geri iğne hareket ederken, kardiyotoksin bile bir dağıtım sağlamak için, böylece tüm tibialis ön kas yaralanması.
Daha sonra fareyi tam yedek parçaya kadar izleyerek Bir ısıtma yastığı üzerinde kafesine geri döndürün. Ameliyattan üç gün sonra, az önce gösterildiği gibi enjeksiyon bölgesini dezenfekte edin. Az önce gösterildiği gibi, anestezili farenin tibialis ön kaslarına ilgi çekici hedefe yönelik 50 mikrolitreye kadar siRNA enjekte edin.
Daha sonra fareyi tam uygun bir şekilde izleyerek kafesine geri döndürün. Yaralı kas dokusutoplamadan önce, bir kalem etrafında folyo sarın ve bant ile kalem mühür, küf alt eşit, kapalı bir yüzey sağlar. Kalıp hazır olduğunda,% 70 etanol ile tüm hayvan dezenfekte ve ayak bileğinde cilt kaldırmak için ekstra keskin makas kullanın.
Kas hasat önce, yaralı bacak ayak bileğinde tibia kemik yanında fasya ile kapalı forceps çimdik için ince forceps kullanın, ve fasya yırtmak için diz doğru forceps hareket, tibialis anterior kas açığa. Tibialis anterior kas izole etmek için, distal tendon maruz, ve ince forceps ile tendon kapmak. Tendonu kesmek için bahar makası kullanın ve diz doğru kas çekmek için tendon kas kavramak.
Orta göbek bölgesinin analizini sağlamak için, orta göbek bölgesindeki tibialis anterior kasını eşit büyüklükte iki yarıya kesmek için düz makas kullanın ve kalem kalıbını donma solüsyonuyla yarıya kadar doldurun. Tibialis ön kasının iki yarısının donma kalıbına dik bir pozisyonda yerleştirin ve orta göbek bölgesi kalıbın dibine bakacak şekilde. Dondurucu kalıbı sıvı nitrojene yarıya aktarmak için forceps kullanın.
Dondurucu ortam saydamdan beyaza değiştiğinde ve katı hale geldiğinde, dondurucu kalıbı 80 derecelik bir dondurucuya veya gelecekteki işleme için buz kuruna aktarın. Kontrol kaslarında, miyoliflerin çevresinde çekirdeklerin lokalizasyonu ve interstisyel alan içinde mononükleli hücrelerin birikmemesi gözlendiği gibi, dokunun mimarisi bozulmadan kalır. Kardiyotoksin aracılı yaralanmadan yedi gün sonra, yeni miyolifler merkezi olarak konumlanmış çekirdekler tarafından işaretlenmiş olarak oluşur, ve çoğunlukla uydu hücrelerinden oluşan mononükleli hücrelerin birikmesi, ama aynı zamanda bağışıklık hücreleri gibi nonmiyojenik hücreler.
Dinlenme koşullarında, kırmızı pax7 boyama ile işaretlenmiş uydu hücreleri, bazal lamina altında bulunan, burada yeşil gösterilir. Yaralanmadan üç gün sonra uydu hücrelerinin sayısı artar ve uydu hücreleri artık bazal laminanın altında bulunmaz. Yaralanmadan sonraki 10.
Rejenerasyon sürecini daha fazla analiz etmek için, yeni oluşan miyolifler gelişimsel miyozine karşı antikorlarla boyanabilir. SiRNA ile enjeksiyondan iki gün sonra, uydu hücreleri floresan etiketli siRNA varlığı için analiz edilebilir. Bu temsili deneyde, yenileyici kasuydu hücrelerinin yaklaşık% 75 floresan etiketli siRNA için pozitif.
Ayrıca, tüm rejeneratif miyofiberlerin yaklaşık %74'ü floresan olarak etiketlenmiş siRNA için de olumluydu, bu da yenilen miyofiberlerin %74'ünün siRNA'yı kapladığını, siRNA-pozitif uydu hücrelerinin yeni miyofiberler oluşturmak için bir araya geldiğini ya da zaten mevcut olan miyofiberlerle füzyonun oluştuğunu düşündürmektedir. En kritik adım tibialis ön kas tam bir yaralanma elde etmektir. Histolojik analize ek olarak, iskelet kasının rejenerasyonunu fonksiyonel bir şekilde analiz etmek için üretilen kuvvet gibi parametreler kaydedilebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, kardiytoksin-aracılı yaralanma ve kendiliğinden teslim eden siRNA enjeksiyonu yoluyla uydu hücrelerinde belirli bir genin fonksiyonel kaybını araştırmak için bir in vivo yöntem sunar. Teknik, transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan kas rejenerasyonunun analizini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Rejeneratif Tıp
Arka Plan
- Uydu hücreler, kas rejenerasyonunda kritik bir rol oynar.
- Bu hücrelerdeki gen fonksiyonunu araştırmak, kas onarım mekanizmalarını anlamak için esastır.
- Geleneksel yöntemler genellikle sınırlayıcı olabilen transgenik modelleri içerir.
- Kendiliğinden teslim eden siRNA, in vivo gen susturma için yeni bir yaklaşım sunar.
Çalışmanın Amacı
- Kas rejenerasyonu sırasında uydu hücrelerinde gen fonksiyonunu değerlendirmek için bir yöntem geliştirmek.
- Kas yaralanmasını indüklemek ve gen analizini kolaylaştırmak için kardiytoksin kullanmak.
- Kendiliğinden teslim eden siRNA'nın spesifik genleri hedeflemede etkinliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kas yaralanmasını indüklemek için kardiytoksinin intramüsküler enjeksiyonu.
- İlgili geni hedefleyen kendiliğinden teslim eden siRNA'nın enjeksiyonu.
- Yaralanma sonrası kas dokusunun histolojik analizi.
- Uydu hücre aktivitesi ve miyofiber rejenerasyonunun değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Tibialis anterior kasına başarılı bir şekilde yaralanma uygulandı.
- Yaralanma sonrası uydu hücrelerin ve yenileyici miyofiberlerin artan varlığı gözlendi.
- Uydu hücrelerin yaklaşık %75'i ve yenileyici miyofiberlerin %74'ü floresan etiketli siRNA için pozitifti.
- Fonksiyonel analiz, etkili kas rejenerasyonunu gösterdi.
Sonuçlar
- Yöntem, kas rejenerasyonunda gen fonksiyonunu araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- Kendiliğinden teslim eden siRNA, in vivo gen susturma için etkili bir araçtır.
- Bu teknik, kas biyolojisi ve rejeneratif süreçler hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Direct in vivo interrogation of gene function in satellite cells during skeletal muscle regeneration addresses a critical gap in early discovery and target validation for muscle repair therapeutics. This method enables mechanistic de-risking and predictive confidence without reliance on transgenic models, accelerating portfolio triage and target prioritization. The approach supports enterprise R&D by providing a scalable, physiologically relevant system for functional genomics in regenerative medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional loss-of-gene studies in satellite cells under physiological regeneration conditions.
- Supports mechanistic de-risking by isolating gene-specific effects on muscle repair.
- Facilitates target validation in the absence of transgenic animal models.
- Provides predictive confidence for advancing gene targets in muscle regeneration pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo models for downstream screening of gene function.
- Delivers quantitative outputs via histological and functional muscle assessments.
- Enables reproducible siRNA delivery and uptake measurement in target cell populations.
- Supports assay standardization for gene silencing efficiency and regenerative outcomes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of muscle injury and repair.
- Maintains translational continuity from gene silencing to functional tissue regeneration.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on in vivo gene function data.
- Supports biomarker alignment through quantifiable regenerative endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling gene function analysis in regenerative contexts, supporting both early target validation and preclinical model development.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for muscle regeneration targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts of gene silencing and regenerative efficacy.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as siRNA uptake rates and histological regeneration markers.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in physiologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for functional genomics across diverse gene targets in muscle biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by eliminating the need for transgenic models and enabling scalable gene function studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust in vivo data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo muscle injury models and siRNA delivery techniques.
- Demands access to histological and functional muscle analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for injury induction and siRNA administration protocols.
- Adaptation may be needed for different muscle groups or species as supported by the protocol.
- Critical to achieve complete and reproducible muscle injury for consistent regenerative analysis.
