İskelet Kas Rejenerasyonu Sırasında Kardiyotoksin Yaralanması ve Kendi Kendine Teslim SiRNA In Vivo Enjeksiyonu Sırasında Uydu Hücre Fonksiyonuanalizi

Bu teknik yılan zehri kardiyotoksinin intramüsküler enjeksiyon kombinasyonu sağlar, kendi kendine teslim siRNA intramüsküler enjeksiyon, böylece iskelet kasıre analizine izin. Kendi kendine teslim siRNA uygulaması kas rejenerasyonu sırasında tek genlerin fonksiyonel kaybını araştırmak için zarif bir yoldur, böylece transgenik hayvanlar kaçınarak. Ayak çimdik yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, pençe diz den kranial alt bacak enjeksiyon alanı tıraş, ve herhangi bir gevşek saç kaldırmak.

Fareyi steril bir cerrahi bezle kaplı bir başlık yastığına supine durumuna yerleştirin ve kafatası alt bacağının enjeksiyon alanını dezenfekte etmek için %70 etanol kullanın. Sonra, 29-gauge iğne ile donatılmış bir insülin şırınga yük, 20 mikromolar kardiyotoksin 50 mikrolitre ve kas içine tam deri delmek, sadece diz distal. İğne yerinde olduğunda, kas Tam uzunluğu boyunca 10-20 saniyelik bir doğum süresi boyunca kardiyotoksin enjekte, ileri ve geri iğne hareket ederken, kardiyotoksin bile bir dağıtım sağlamak için, böylece tüm tibialis ön kas yaralanması.

Daha sonra fareyi tam yedek parçaya kadar izleyerek Bir ısıtma yastığı üzerinde kafesine geri döndürün. Ameliyattan üç gün sonra, az önce gösterildiği gibi enjeksiyon bölgesini dezenfekte edin. Az önce gösterildiği gibi, anestezili farenin tibialis ön kaslarına ilgi çekici hedefe yönelik 50 mikrolitreye kadar siRNA enjekte edin.

Daha sonra fareyi tam uygun bir şekilde izleyerek kafesine geri döndürün. Yaralı kas dokusutoplamadan önce, bir kalem etrafında folyo sarın ve bant ile kalem mühür, küf alt eşit, kapalı bir yüzey sağlar. Kalıp hazır olduğunda,% 70 etanol ile tüm hayvan dezenfekte ve ayak bileğinde cilt kaldırmak için ekstra keskin makas kullanın.

Kas hasat önce, yaralı bacak ayak bileğinde tibia kemik yanında fasya ile kapalı forceps çimdik için ince forceps kullanın, ve fasya yırtmak için diz doğru forceps hareket, tibialis anterior kas açığa. Tibialis anterior kas izole etmek için, distal tendon maruz, ve ince forceps ile tendon kapmak. Tendonu kesmek için bahar makası kullanın ve diz doğru kas çekmek için tendon kas kavramak.

Orta göbek bölgesinin analizini sağlamak için, orta göbek bölgesindeki tibialis anterior kasını eşit büyüklükte iki yarıya kesmek için düz makas kullanın ve kalem kalıbını donma solüsyonuyla yarıya kadar doldurun. Tibialis ön kasının iki yarısının donma kalıbına dik bir pozisyonda yerleştirin ve orta göbek bölgesi kalıbın dibine bakacak şekilde. Dondurucu kalıbı sıvı nitrojene yarıya aktarmak için forceps kullanın.

Dondurucu ortam saydamdan beyaza değiştiğinde ve katı hale geldiğinde, dondurucu kalıbı 80 derecelik bir dondurucuya veya gelecekteki işleme için buz kuruna aktarın. Kontrol kaslarında, miyoliflerin çevresinde çekirdeklerin lokalizasyonu ve interstisyel alan içinde mononükleli hücrelerin birikmemesi gözlendiği gibi, dokunun mimarisi bozulmadan kalır. Kardiyotoksin aracılı yaralanmadan yedi gün sonra, yeni miyolifler merkezi olarak konumlanmış çekirdekler tarafından işaretlenmiş olarak oluşur, ve çoğunlukla uydu hücrelerinden oluşan mononükleli hücrelerin birikmesi, ama aynı zamanda bağışıklık hücreleri gibi nonmiyojenik hücreler.

Dinlenme koşullarında, kırmızı pax7 boyama ile işaretlenmiş uydu hücreleri, bazal lamina altında bulunan, burada yeşil gösterilir. Yaralanmadan üç gün sonra uydu hücrelerinin sayısı artar ve uydu hücreleri artık bazal laminanın altında bulunmaz. Yaralanmadan sonraki 10.

Rejenerasyon sürecini daha fazla analiz etmek için, yeni oluşan miyolifler gelişimsel miyozine karşı antikorlarla boyanabilir. SiRNA ile enjeksiyondan iki gün sonra, uydu hücreleri floresan etiketli siRNA varlığı için analiz edilebilir. Bu temsili deneyde, yenileyici kasuydu hücrelerinin yaklaşık% 75 floresan etiketli siRNA için pozitif.

Ayrıca, tüm rejeneratif miyofiberlerin yaklaşık %74'ü floresan olarak etiketlenmiş siRNA için de olumluydu, bu da yenilen miyofiberlerin %74'ünün siRNA'yı kapladığını, siRNA-pozitif uydu hücrelerinin yeni miyofiberler oluşturmak için bir araya geldiğini ya da zaten mevcut olan miyofiberlerle füzyonun oluştuğunu düşündürmektedir. En kritik adım tibialis ön kas tam bir yaralanma elde etmektir. Histolojik analize ek olarak, iskelet kasının rejenerasyonunu fonksiyonel bir şekilde analiz etmek için üretilen kuvvet gibi parametreler kaydedilebilir.