Name: Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Öğrenin, dev unilamellar hibrid veziküllerin elektroformasyon ile elde edilmesini ve mikropipet aspirasyon ile mekanik özelliklerinin ölçümünü. Bu yöntem, membran esnekliği ve kararlılığı hakkında güvenilir veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle mali destek (ANR Sysa) için ANR kabul.

1. Mikropipetlerin imalatı
NOT: Burada iç çapı 6 ila 12 mm arasında değişen ve 3-4 mm civarında konik uzunluğu olan mikropipetler gereklidir. Mikropipet in iã§in ayrÄ±ntÄ±lÄ± bir yöntem aşağıda veå tirilere tanÄ±mlanmÄ±Å tÄ±r.
<ol><li>Borosilikat cam kılcal yerleştirin çekmece çekmecesine ve bir ucunu knob sıkarak düzeltmek.</li>
	<li>Bardağı ısıtıcı haznesinin kenarındaki deliklerden dikkatlice kaydırın.</li>
	<li>Diğer uçtaki kelepçeucunu sıkın.</li>
	<li>İstenilen özelliklere ulaşmak için ucun boyutunu ve konik uzunluğunu kontrol edin. Bunun için, ısıtma sıcaklığı, çekme, hız, gecikme ve basınç gibi teknik parametreleri optimize edin. Burada kullanılan bir program örneği: Isı: 550 °C Çekme: 10 (Makinenin menzili: 0-255 rasgele birimler) Hız: 30 (Aralık: 0-255 rasgele birimler) Gecikme: 1 (Aralık: 0-255 rasgele birimler) Basınç: 500 (Menzil: 0-999 rasgele birimler)</li>
	<li>Program tarafından tanımlanan olayları yürütmek için PULL'yi tıklatın. Kılcal damar daha sonra boyutları bir mikroforge kullanılarak ayarlanması gereken iki mikropipete ayrılır.</li>
	<li>Mikropipeti mikroforgenin metal pipet tutucuya yerleştirin (bkz. Şekil 1). 10x hedefi kullanarak, pipet ucu cam boncuk yüzeyine yakın olana kadar mikroskop aşamasını ve pipet manipülatörü (dikey ve yatay hareket) ayarlayın.</li>
	<li>Cam boncuk eritmek için ayak anahtarı basın. Ucu düşürün ve erimiş cam boncuk ile temas koydu. Erimiş cam kılcal eylem ile pipet içine akar. Erimiş camın seviyesi Şekil 1'inekinde gösterildiği gibi belirli bir yüksekliğe ulaşana kadar birkaç saniye bekleyin.</li>
	<li>Ayak anahtarındaki basıncı kaldırarak ısıtmayı durdurun ve keskin bir kırılmaya neden olmak için dikey pipet manipülatörü kullanarak ucu hızla çekin.</li>
	<li>İstenilen çap elde edilene kadar (6-12 μm) 1,7 ve 1,8 adımlarını tekrarlayın. NOT: Çap ölçümünün doğruluğunu artırmak için, son adımda, bir dürbünle donatılmış 32x nesnel kullanın.</li>
</ol>2. BSA (sığır serum albumin) ile kaplama pipet uçları
<ol><li>Saf suda %1 wt. BSA içeren 0,1 M glikoz çözeltisi hazırlamak.<ol>
<li>Tartmak 180 glukoz tozu mg, bir yer 15 mL polipropilen konik tüp ve saf su 10 mL ile tamamlandı.</li>
		<li>0,1 g BSA tozu ekleyin ve test tüpü döner mikseri kullanarak iyice çırpın, tamamen çözünene kadar (yaklaşık 4 saat).</li>
	</ol>
</li>
	<li>İğne ile donatılmış 10 mL tek kullanımlık Luer şırınga ile çözeltiyi alın. Doldurulduğunda iğneyi çıkarın ve 0,22 m asetat selüloz filtresi tökezleyin. Ucu batırmak için kullanılacak birkaç polipropilen mikro santrifüj tüpü (1,5 mL) doldurun.</li>
	<li>Kılcal damarları dikey olarak tutuculara yerleştirin. Tutucuyu indirin ve ucu bir gecede glikoz/BSA çözeltisine batırın. Çözelti kılcal etki ile yaklaşık 1 cm yüksekliğinde yükselmelidir.</li>
	<li>Pipet ucunu glikoz/BSA çözeltisinden çıkarın. 5 mL 0,1 M glukoz çözeltisi (5 mL saf suda 90 mg glikoz tozunu seyreltin) hazırlayın ve 0,22 m asetat selüloz filtreden filtre uygulayın.</li>
	<li>Esnek erimiş silika kılcal damar ile donatılmış 500 μL cam şırınga kullanarak pipeti glikoz çözeltisi ile doldurun. Daha sonra, geri emerek tüm glikoz çözeltisi çıkarın ve atın (Şekil 2). Sınırsız BSA'yı kaldırmak için bu adımı birkaç kez tekrarlayın.</li>
</ol>3. Elektroformasyon ile GUVs ve GHUV oluşumu
NOT: Elektroformasyon Angelova9tarafından geliştirilen yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bir elektroformasyon odası elde etmek, bir lipid veya polimer film yatırmak (veya Her ikisi de GHUVs (Dev Hibrid Unilamellar Veziküller) ve alternatif bir elektrik alanı altında film nemlendirmek için prosedürler aşağıdaki açıklanmıştır. Elde edilen GUV toplamak için prosedür de açıklanmıştır.
<ol><li>Amphiphile, sakaroz ve glikoz çözeltisi hazırlama<ol>
<li>1 mg/mL konsantrasyonda bir amphipile çözeltisi hazırlayın. Tartmak 10 mg amphiphile ve kloroform 10 mL çözünür. Çözücü buharlaşmasını önlemek için çözeltiyi mühürlü şişelerde saklayın.</li>
		<li>Kloroformda 1 mg/mL'de1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-fosfoetanolamine-N-(lissamine rodamin B sülfonil) (DOPE-Rhod) bir stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Amphipile çözeltisine 10 μL floresan lipid çözeltisi ekleyin. Çözücü buharlaşmasını önlemek için çözeltileri mühürlü şişelerde saklayın.</li>
		<li>Sakaroz ve glikoz çözeltilerini sırasıyla 0,1 M. Weigh 342 mg ve 180 mg sakaroz ve glikoz konsantrasyonunda hazırlayın ve 10 mL saf suda çözün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroformasyon odasının hazırlanması NOT: Elektroformasyon cihazı yapmak için farklı iletken malzemeler kullanılabilir (örn. platin teller10, paslanmaz iğneler11). Elektroformasyon odası, diyafram oluşturmak için bir tarafta kesilmiş bir O-halka kauçuk spacer ile ayrılmış iki ITO slayttan oluşur. Slaytlar iki elektrik teli(Şekil 3 ve Şekil 4A)ile bir gerilim jeneratörüne bağlanır.<ol>
<li>ITO slaytlarını organik çözücü (örn. kloroform) ile temizleyin. Bir ohmmetre kullanarak iletken yüzeyi tanımlayın.</li>
		<li>Elektrik kablolarını iletken tarafa yapışkan bant kullanarak takın.</li>
		<li>Amphipile çözeltisi birikimi<ol>
<li>Bir kılcal damarı, kılcal etki ile seviyesi artana kadar çözeltiye batırın ve çözeltinin yaklaşık 5 μL'sini toplayın.</li>
			<li>Kapilleri İTO cam plakanın merkeziyle temas altına alayın ve çözeltiyi yavaşça yayın. Tam çözücü buharlaşmasını sağlamak için 10 saniye bekleyin(Şekil 4A).</li>
			<li>Her iki taraf için bu yordamı 3 kez tekrarlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Açılan O-ring spacer her iki tarafında silikonsuz gres bir tabaka ekleyin. İfade alanının etrafına koy. İkinci ITO cam plakanın iletken yüzünü boşluk tabakasının üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Organik çözücü izlerini gidermek için elektroformasyon odasını 3 saat vakum altına yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektroformasyon prosedürü<ol>
<li>Elektrik kablolarını jeneratöre bağla.</li>
		<li>Jeneratör için aşağıdaki ayarları kullanın: Alternatif sinüzoidal gerginlik Frekans: 10 Hz Genlik: 2 Vtepeden tırnak NOT: Her sistem için optimum gerilim frekansı ve süresi bulunmalıdır.</li>
		<li>Çözeltinin hazneye enjeksiyonundan önce gerilimin uygulandığından emin olun.</li>
		<li>Hazneyi doldurmak için 0,8 mm iç çaplı iğneile şırınga kullanarak 1 mL çözelti enjekte edin. Nihai kabarcıklar kaldırın.</li>
		<li>75 dk(Şekil 4B)için uygulanan gerilim/frekans altındaki hazneyi bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GUVs hasat<ol>
<li>Jeneratörü kapatın.</li>
		<li>0,8 mm iç çaplı iğne ile 1 mL şırınga kullanarak, oda içinde bir hava kabarcığı üretmek için çözeltinin küçük bir kısmını emmek. Bu kabarcık oda içinde hareket yapmak için biraz oda yatırın. Bu, GUV'ların ITO yüzeyinden ayrılmasına yardımcı olabilir (Şekil 4C).</li>
		<li>Tüm çözeltiyi emerek 1 mL plastik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Telleri çıkarın ve ITO slaytlarını organik çözücülerle (toluen sonra kloroform) temizleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mikromanipülasyon kurmak
NOT: Mikropipet aspirasyonunun prensibi, bir depresyon uygulayarak cam mikropipet ile tek bir vezikül emmektir. Pipet içindeki dilin uzunluğu emme basıncının bir fonksiyonu olarak ölçülür. BSA ile pipet kaplama, daha önce açıklanan, önlemek veya vezikül membranlar ve pipet arasındaki herhangi bir yapışmayı en aza indirmek için gereklidir.
Protokol aşağıda gösterilmiştir.
<ol><li>Pipet ve su dolu rezervuar bağlantısı NOT: Su dolu tank ve mikrometre sürgülü bir plakaya sabitlenir. Mikrometre kafalı dijital sayaç, cihazın 0 ila 2,5 cm aralığında dikey olarak yer değiştirmesine ve 1 μm. doğrulukla alüminyum optik ray boyunca 1 metreye kadar uzunluğa kadar yer değiştirmesine olanak tanır. Silikon boru, rezervuarı ve kılcal tutucuyu bağlar (Şekil 5A).<ol>
<li>Tankı saf suyla doldurun. Tek kullanımlık 5 mL şırıngasilikon boru ve aspire ile kapiller metal tutucuya bağlayarak tanktan tutucuya bir su akışı oluşturun.</li>
		<li>Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için tüpü hafifçe dokunun. Aynı anda, pozitif bir basınç oluşturmak için su tankı yükseltmek. 5 mL şırınga hala tutucuya bağlıdır.</li>
		<li>Daha önce açıklanan kaplama ve temizleme adımlarını (bkz. adım 2), sonunda bir damla oluşana kadar bir kılcal damarı glikoz çözeltisi ile doldurun. Sonunda hafif bir su akışı oluşturmak için metal tutucudan şırınga boruçıkarın.</li>
		<li>Kılcal damarı ters çevirin ve glikoz damlasını tutucudan gelen su akışına bağlayın. Kılcal damarı ve tutucuyu birbirine vidalayarak düzeltin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir pipet konumlandırın NOT: Bu işlem sırasında, su tankı hala pozitif bir basınç korumak için alüminyum demiryolu üzerinde konumlandırılmış.<ol>
<li>İki cam slayt (daha önce etanol ile temizlenmiş) ile donatılmış ev yapımı alüminyum sahne alın ve her iki tarafta vakum gres ile yapıştırın. Mikroskop aşamasına töforve şekil 5B,C'degösterildiği gibi 0,1 M glukoz içeren 1 mL şırınga kullanarak iki slayt arasında menisküs oluşturun.</li>
		<li>Pipeti ve tutucuyu mikromanipülatörün motor ünitesine yerleştirin ve sıkma bileni sıkın.</li>
		<li>Glikoz menisküs yakınındaki mikropipeti düşürmek için kaba modda kontrol paneli joystick kullanın. İnce modu kullanarak ucun konumunu menisküs ortasına ayarlayın.</li>
		<li>Dış ve iç yüzeyini temizlemek için birkaç dakika glukoza daldırılmış ucu tutun (pozitif basınç korununca, su akışı kaplanmamış BSA'yı çıkarmak için pipetin iç yüzeyini durular).</li>
		<li>Ucun konumunu mikromanipülatör klavyede saklayın ve menisküsten çekin.</li>
		<li>Glikoz menisküs çıkarın ve taze bir ile değiştirin. 20 μL mikropipet kullanarak 0,1 M sakarozda 2 μL GUVs suck ve taze glikoz menisküs koyun. Dic modunda (diferansiyel girişim kontrastı) sakaroz (özellikle GUVs içinde) ve glikoz (özellikle GUVs dışında) arasındaki yoğunluk farkı nedeniyle alt kısmında bulunan GUVs gözlemleyin.</li>
		<li>Veziküller hafifçe söndüğünde, emme pipetini yeniden takın ve uca odaklanın. Basınç neredeyse 0 olan su tankının H0 yüksekliğini ayarlayın. Bunun için, çözeltide doğal olarak bulunan küçük veziküllerden veya parçacıklardan yararlanın ve bu parçacıkların hareketi durdurulana kadar su tankı yüksekliğini ayarlayın.</li>
		<li>Bu noktada, su buharlaşmasını önlemek için mineral yağ ile menisküs çevreleyen, Şekil 5Dbakın. NOT: Oda sıcaklığı klima kullanılarak 20-22 °C arasında kontrol edilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikropipet aspirasyon deneyi<ol>
<li>Pipet ucunu (6-12 μm çapında) düşürüp vezikül (15-30 μm çapında) aspire etmek için küçük bir emme (-1 cm) oluşturun. Seçilen vezikül membranı hafifçe dalgalanmalı olmalı ve görünür bir kusur (tomurcuk veya filament yok) olmamalıdır(Şekil 6).</li>
		<li>Mikromanipülörü kullanarak aspire vezikülleri diğer veziküllerden izole etmek için pipeti daha yüksek bir seviyeye yükseltin ve tüm deney boyunca bu konumu koruyun.</li>
		<li>Su dolu tankı yaklaşık -10 cm'ye indirerek vezikülü önceden geri çekin, ardından ilk değerine (-1 cm) dönmek için basıncı düşürün. Membran fazlalığı ve membrandan küçük kusurları gidermek için bu adımı birkaç kez tekrarlayın.</li>
		<li>Su tankının konumuile tanımlanan -0,5 cm yükseklikten, membranın dalgalandığı bir rejime ulaşmak için mikrometre ile emme basıncını yavaşça düşürün. Daha sonra önemli bir projeksiyon uzunluğu (birkaç mikron) ile ucu bir dil açıkça görselleştirmek için basıncı artırmak. NOT: En küçük membran projeksiyon uzunluğunu (L 0) emmeyi sağlayan en düşük uygulanan basınç(P0)α0 (Şekil 7A)referans noktasını tanımlar. Eğrinin tüm noktaları bu referansa göre ölçülecektir (ΔL = L-L0 ve ΔP = P-P0).</li>
		<li>0,5 -0,8 mN/m'ye ulaşana kadar mikrometre ile emme basıncını adım adım artırın. Her adımda, 5 s bekleyin ve dilin bir anlık çekin. Düşük gerilimde bu işlem bükme modülünün belirlenmesini sağlar.</li>
		<li>Emiş basıncını 0,5 mN/m'den kopma gerilimine, rayüzerinde kayan suyun yüksekliğini (-2 ila -50 cm) ayarlayarak artırmaya devam edin(Şekil 7B-D). Yüksek gerilim rejimindeki bu deneyden alan sıkıştırılabilirlik modülü, lysis gerilimi ve lysis gerilimi ölçülecektir.</li>
		<li>Önemli istatistikler elde etmek için yaklaşık 15-20 vezikülleri esnetin. Her mikropipet aspirasyon deneyi 7 ila 10 dakika sürer. Dilin projeksiyon uzunluğunu, veziküllerin çapını ve kılcal damar yarıçapını ölçmek için LASAF yazılımını kullanarak görüntü analizi yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bükme modülü, alan sıkıştırılabilirlik modülü, lysis gerilimi ve lysis gerilme ölçümü<ol>
<li>Bu parametrelere erişmek için, E. Evans12tarafından kurulan formalizmi kullanın. Denklem 1'den membran üzerine uygulanan emme basıncını hesaplayın: Δ P = ρwg (h−h0) (1) g'nin yerçekimi ivmesi (9.8 m−s−2),ρw suyun yoğunluğudur (ρ = 1 g¡cm−3),h su tankının konumudur ve h0 basıncın sıfıra eşit olduğu ilk konumdur.</li>
		<li>Laplace denkleminden membran gerilimini hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq1.jpg">(2) ΔP mikropipet üzerindeki emme basıncı, Rp ve Rv sırasıyla mikropipet ve vezikül yarıçapı (mikropipet dışında) vardır. Membranın yüzey alanı (α) aşağıdaki gibi tanımlanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq2.jpg">(3) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq3.jpg">alt emme basıncında vezikül membran alanı olmak.</li>
		<li>Denklem 412'yegöre kapiller uç içindeki vezikülün projeksiyon uzunluğu ΔL'deki artıştan α'yı hesaplayın : <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq4.jpg">(4)</li>
		<li>Çok düşük bir gerilim rejimi altında, termal bükme undulations yumuşatma belirgin genişleme hakimdir. Çizim ln(σ) vs α. Düşük σ değerlerinde (genellikle 0.001-0.5 mN.m−113),eğimi bükme modülüne bağlı düz bir çizgi verir, Kb (denklemin ilk terimi 5)14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60199/60199eq5.jpg">(5) NOT: Yüksek gerilimlerde (&gt; 0.5 mN.m−1),membran undülasyonları tamamen bastırılır ve moleküller arasındaki boşluk artışı sonucunda membran alanı artar. Bu rejimde, denklem 5'in ikinci terimi hakimdir ve alan sıkıştırılabilirlik modülü Ka 'ya erişim sağlar (Şekil 8 ve Şekil 9).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+univalent+ions+across+the+lamellae+of+swollen+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.</a> Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).</li>
<li>Discher, D. E., Eisenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymer vesicles.</a> Science. 297 (5583), 967-973 (2002).</li>
<li>Hammer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+vesicles+from+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: vesicles from block copolymers.</a> Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).</li>
<li>Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+polymer%2Flipid+vesicles%3A+state+of+the+art+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives.</a> Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).</li>
<li>Schulz, M., Binder, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+Hybrid+Lipid%2FPolymer+Vesicles+as+a+Novel+Membrane+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform.</a> Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).</li>
<li>Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+fluctuations+of+large+quasi-spherical+bimolecular+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+De+Physique%22%5BJournal%5D)">Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles.</a> Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).</li>
<li>Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+the+field+of+bending+rigidity+measurements+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).</li>
<li>Rodríguez-García, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+smart+vesicles+of+tunable+rigidity+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability.</a> Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions+of+the+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+giant+polymer+and+lipid+vesicles+obtained+by+electroformation+and+pva+gel-assisted+hydration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+A%3A+Physicochemical+and+Engineering+Aspects%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).</li>
<li>Pereno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+Stainless+Steel+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+omega%22%5BJournal%5D)">Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes.</a> ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).</li>
<li>Evans, E., Rawicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy-driven+tension+and+bending+elasticity+in+condensed-fluid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes.</a> Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+separation+at+the+micron+scale+and+nanoscale+in+giant+polymer%2Flipid+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs).</a> Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).</li>
<li>Helfrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+properties+of+lipid+bilayers%3A+theory+and+possible+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments.</a> Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).</li>
<li>Dao, T. P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+block+copolymers+and+phospholipids+to+form+giant+hybrid+unilamellar+vesicles+%28GHUVs%29+does+not+systematically+lead+to+%26%2334%3Bintermediate%27%27+membrane+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to &#34;intermediate'' membrane properties.</a> Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).</li>
<li>Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+Studies+of+Lipid+Vesicles+in+the+L%CE%B1+and+L%CE%B1-Gel+Coexistence+Regimes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes.</a> Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).</li>
<li>Longo, M. L., Ly, H. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongo%2C+ML+%22Methods+in+Membrane+Lipids%22">Methods in Membrane Lipids</a>. Dopico, A. M. , Humana Press. 421-437 (2007).</li>
<li>Chen, D., Santore, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+copolymer-phospholipid+vesicles%3A+phase+separation+resembling+mixed+phospholipid+lamellae%2C+but+with+mechanical+stability+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control.</a> Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).</li>
<li>Mabrouk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+material+properties+of+giant+liquid+crystal+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes.</a> Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).</li>
<li>Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+behavior+of+membranes+with+sterols%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Universal behavior of membranes with sterols.</a> Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).</li>
<li>Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+Tension+Effect+of+Ethanol+on+Lipid+Bilayer+Rigidity%2C+Stability%2C+and+Area%2FMolecule%3A%E2%80%89+A+Micropipet+Aspiration+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule:  A Micropipet Aspiration Approach.</a> Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).</li>
<li>Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Bilayer+Thickness+on+Membrane+Bending+Rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity.</a> Langmuir. 20, 540-543 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikropipetin kaplaması güvenilir ölçümler elde etmek için önemli noktalardan biridir. Mikropipet vezikül yapışması önlenmelidir, ve bir kaplama yaygın literatürde kullanılır17,18,19,20,21, BSA ile, β-kazein veya surfasil. Kaplama prosedürünün ayrıntıları nadiren belirtilir.
BSA'nın çözülmesi iyi bir isolifleşme sağlanabilmesi için a...

Fosfolipidlerden elde edilen dev veziküller (lipozomlar) 1970'lerden beri temel hücre zarı modeli1olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. 1990'ların sonlarında, kopolimerlerin kendi kendine biraraya gelen vesiküler morfolojileri, lipid analoglarına referans olarak polimeromlar olarak adlandırılan2,3, hızla zayıf mekanik stabilite ve zayıf modüler kimyasal işlevselliğe sahip lipozomlara ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, ikinci fosfolipidler oluşur beri onların hücre biyomimetik karakteri oldukça lipozomlar ile karşılaştırıldığında sınırlıdır, hücre zarının ana bileşeni. Ayrıca, düşük membran geçirgenliği, zar dan türlerin kontrollü difüzyonunun gerekli olduğu ilaç dağıtımı gibi bazı uygulamalarda sorun olabilir. Son zamanlarda, blok kopolimerler ile fosfolipidlerin ilişki melez polimer-lipid veziküller ve membranlar tasarımı çalışmaların artan sayıda konu olmuştur4,5. Ana fikir sinerjik her bileşenin yararları birleştirmek varlıklar tasarlamaktır (biyo-işlevsellik ve polimer membranların mekanik istikrar ve kimyasal çok yönlülük ile lipid bilayers geçirgenlik), hangi farklı uygulamalarda istismar edilebilir: kontrollü ve hedefli ilaç teslimatı, tanı için biyosensörler içinde biyomoleküler tanıma, yapay hücreler için fonksiyonel membranlar, biyo-ilham mikro-nano-reaktörlerin geliştirilmesi.
Günümüzde, farklı bilimsel topluluklar (biyokimyacılar, kimyagerler, biyofizikçiler, fiziko-kimyagerler, biyologlar) daha gelişmiş bir hücre zarı modelinin geliştirilmesine olan ilgiartmaktadır. Burada, amacımız, mümkün olduğunca ayrıntılı olarak, mevcut metodolojileri (elektroformasyon, mikropipette aspirasyon) elde etmek ve dev veziküllerin mekanik özellikleri ve hibrid polimer lipid dev veziküller olan son "gelişmiş" hücre zarı modelleri karakterizesunmaktır 4,5.
Bu yöntemlerin amacı, membranın alan sıkıştırılabilirliğinin ve bükülme modulisinin güvenilir bir şekilde ölçülmesinin yanı sıra, membranın lysis gerilimi ve gerilmelerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlamaktır. Dev bir vezikül bükme sertliğini ölçmek için mevcut en yaygın tekniklerden biri dalgalanma analizi6,7, doğrudan video mikroskop gözlemdayalı; ancak bu büyük görünür membran dalgalanması gerektirir ve kalın membranlar (örn. polimeromlar) üzerinde sistematik olarak elde edilmez. Alan sıkıştırılabilirlik modülü deneysel Langmuir Blodgett tekniği kullanılarak belirlenebilir ama en sık bir monolayer8. Mikropipet aspirasyon tekniği, bir deneyde dev unilamellar vezikül (GUV) oluşturan iki katmanlı bir modüler in ölçülmesine olanak sağlar.
Aşağıdaki yöntem, iki katmanlı ve dolayısıyla elektroformasyon ile veziküller oluşturabilen tüm amfilik moleküller veya makromoleküller için uygundur. Bu elektroformasyon sıcaklığında iki katmanlı bir sıvı karakteri gerektirir.

<table><tbody><tr><td> mikropipet tasarımı için gerekli ekipman ve malzemeler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Cam Kılcal Damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B100-4</td><td>sırasıyla 1 mm ve 0,58 mm dış ve iç çap.</td></tr><tr><td>Filament Sutter</td><td>Instrument Co.'</td>yu kurdu<td>FB255B</td><td>2.5mm * 2.5mm Kutu Filament</td></tr><tr><td>Alevli / Kahverengi Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modeli: P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>NARISHGE Co.</td><td>MF-900</td><td>iki objektifle donatılmış (10x ve 32x)</td></tr><tr><td>Pipet uçlarını BSA</td><td></td><td></td><td></td> ile kaplamak için</tr> <tr><td>malzemelerSığır Serumu Albümin Fraksiyonu V (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık 1 ml şırınga Luer Uçlu</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık 10 ml şırınga Luer Uçlu</td><td>Codan</td><td>626616</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık 5 ml şırınga Luer Ucu</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık asetat selüloz filtre</td><td>Cluzeau Info Labo</td><td>L5003SPA</td><td>Gözenek boyutu: 0.22 ve mikro; m, çap: 25mm</td></tr><tr><td>Esnek Sigortalı Silika Kılcal Boru</td><td>Polimikro Teknolojileri.</td><td>TSP530660</td><td>İç Çap 536 & mikro; m, Dış Çap 660 ve mikro; m,</td></tr> <tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 500 ve mikro; L luer Kilidi GASTIGHT</td><td>Hamilton Şırınga Şirketi</td><td>1750</td><td></td></tr><tr><td>Test tüpü döner karıştırıcı</td><td>Labinco</td><td>28210109</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülasyon Kurulumu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Optik Ray, 1000 mm Uzunluk, M4 dişler, X48 Serisi</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sönümlü Optik Tabla</td><td>Newport</td><td></td><td>Dış titreşimleri önlemek için mikroskop desteği olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP 2</td><td>Modül ünitesi (X, Y ve Z hareketi için motor ünitesi) bir adaptör vasıtasıyla ters çevrilmiş mikroskop üzerine monte edilir.</td></tr><tr><td></td><td>Mikrometre Mitutoyo Corporation</td><td>350-354-10</td><td>Digimatic LCD Mikrometre Kafası 25,4 mm Kapsam 0,001 mm</td></tr><tr><td>Pleksiglas su haznesi (100 ml)</td><td>Rezonans</td> tarayıcı ve suya daldırma objektifi (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I) ile donatılmış ev yapımı <td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 ters konfokal mikroskop (DMI6000).</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X48 Ray Taşıyıcı 80 mm Uzunluk, 1/4-20, 8-32 ve 4-40 dişli</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sükroz ve amfifil çözeltisi hazırlama malzemeleri<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/substance/2oleoyl1palmitoylsnglycero3phosphocholine760082685331611" target="_blank"> 2-Oleoil-1-palmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin</a></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>VWR</td><td>22711.244</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidiletanolamin-N- (lissamin, rodamin B sülfonil)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810146C</td><td>Rodamin etiketli lipid</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Elektroformasyon Kurulum< / Güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ve Mikro; L cam kılcal kapaklar</td><td>Hirschmann</td><td>9600110</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık 1 ml şırınga Luer Tip</td><td>Codan</td><td>62.1612</td><td></td></tr><tr><td>H Gres</td><td>Apiezon</td><td>Apiezon H Gres</td><td>Silikon içermeyen gres</td></tr><tr><td>İndiyum kalay oksit kaplı cam slaytlar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>703184</td><td></td></tr><tr><td>İğne</td><td>Terumo</td><td>AN2138R1</td><td>0.8 x 38 mm</td></tr><tr><td>Ohmmetre (Multimetre)</td><td>Voltcraft</td><td>VC140</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>VWR</td><td>28676.297</td><td></td></tr><tr><td>Gerilim jeneratörü</td><td>Keysight</td><td>33210A</td><td></td></tr></tbody></table>

dev unilamellar hibrid veziküllerin elektroformasyon ile obtention ve mikropipet aspirasyon ile mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Obtention of Giant Unilamellar Hybrid Vesicles by Electroformation and Measurement of their Mechanical Properties by Micropipette Aspiration

Fosfolipidlerden ve kopolimerlerden elde edilen dev veziküller farklı uygulamalarda kullanılabilir: kontrollü ve hedefli ilaç dağıtımı, tanı için biyosensörler içinde biyomoleküler tanıma, yapay hücreler için fonksiyonel membranlar ve biyoilham mikro/nano-reaktörlerin geliştirilmesi. Tüm bu uygulamalarda membran özelliklerinin karakterizasyonu temel önemtaşımaktadır. Mevcut karakterizasyon teknikleri arasında, E. Evans'ın öncülük ettiği mikropipet aspirasyonu, membranın alan sıkıştırılabilirlik modülü, bükme modülü ve lysis gerilimi ve gerilme gibi mekanik özelliklerinin ölçülmesine olanak sağlar. Burada, bir lipid veya kopolimerin ince filmden (veya her ikisinden) dev veziküller elde etmek için tüm metodolojileri ve ayrıntılı prosedürleri, mikropipetlerin üretim ve yüzey işlemesini ve daha önce bahsedilen tüm parametrelerin ölçülmelerine yol açan aspirasyon prosedürünü saklı atıyoruz.

Yukarıda belirtilen protokolle, biz farklı sentetik dev unilamellar vezikül inceledik (GUV), bir fosfolipid elde: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC), bir triblok kopolimer: Poli (etilenoksit)-b-Poli(dimethylsiloxane)-b-Poly(etilenoksit) (PEO12-b-PDMS43-b-PEO12) bir önceki çalışmada sentezlenen13, ve bir diblock kopolimer Poli(dimethylsiloxane)-b-Poly( etilenoksit...

Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Giant vesicles obtained from phospholipids and copolymers can be exploited in different applications: controlled and targeted drug delivery, biomolecular ...

Bu protokol, mikropipet aspirasyon tekniği kullanılarak sentetik ve gerçek polimer lipid vezikülmembran mekanik özelliklerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini kolaylaştırmaktadır. Bu, membran esnekliği ve kararsızlığının tek deneylerde değerlendirilmek üzere gerilmesine izin veren tek tekniktir. Bu protokol vezikül hazırlığından mekanik değerlendirmeye kadar bir dizi prosedür içerir.Sabırlı olmak ve ortaya çıkan her türlü teknik sorunu çözmek çok önemlidir. Bu teknikler üzerinde görselleştirme nasıl düzgün kılcal yüzey tedavi ve nasıl zorunlu prestress adım gerçekleştirmek için anlamak için önemlidir. Vezikül'ün hatasız ortaya çıkmasın.Gösterme prosedürü Martin Fauquignon, laboratuvar hibrid polimer lipid veziküllerin geliştirilmesi üzerinde çalışan bir doktora öğrencisi olacaktır. İşleme başlamadan önce soğuk cam mikropipet kılcal damarları dikey olarak tutuculara yerleştirin. Ve ipuçları bir gecede taze hazırlanmış glikoz sığır serum albumin çözeltisi batırılır kadar sahipleri düşürün.Ertesi sabah çözelti kılcal eylem ile ipuçları içine yaklaşık bir santimetre artmış olmalıdır. Esnek erimiş silika kılcal damar ile donatılmış 500 mikrolitrelik cam şırınga kullanarak, glikoz çözeltisi ile her pipet doldurun. Daha sonra her pipetten çözeltiyi aspire edin, pipetleri taze glikoz solüsyonu yla doldurmadan önce serumun tamamı çıkarılıncaya kadar birkaç kez.Bir elektroformasyon odası hazırlamak için, ilk uygun organik çözücü ile ITO slaytlar temiz ve bir Ohmetre ile iletken yüzeyi belirlemek. Yapışkan bantla her slaydın iletken tarafına elektrik telleri takın. Çözeltinin yaklaşık 5 mikrolitre kılcal eylem tarafından toplanana kadar ampivial çözelti içine bir kılcal daldırma.Yüklü kılcal damarı bir cam ITO plakasının ortasına yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça slayta doğru yayın. Çözücü tamamen buharlaştığında, çözeltiyi az önce gösterildiği gibi iki kez daha uygulayın. biriktirme alanı etrafında açılan O-ring spacer her iki tarafında silikonsuz gres tabakası eklemeden önce.Daha sonra, ikinci bir ITO cam plakanın iletken yüzünü boşluk tabakasının üstüne yerleştirin ve elektroformasyon odasını 3 saat vakum altına yerleştirin ve organik çözücü izlerini giderin. Dev Unilamellar Veziküllerin elektroformasyonu için elektrik kablolarını jeneratöre takın. Jeneratör frekansını 10 Hertz'e, genliğini 2 Volt'a ayarlayın.Voltaj ayarlandığında, 0,8 milimetrelik iç çaplı iğneyle donatılmış bir şırınga kullanarak hazneye 0,1 molar sakaroz çözeltisi mililitre enjekte edin ve odayı uygulanan voltaj ve frekansın altında 75 dakika bekletin. Elektroformasyonun sonunda jeneratörü kapatın. Ve bir mililitreşşonu kullanarak odanın içinde bir hava kabarcığı üretilene kadar küçük bir çözelti hacmini aspire edin.Kabarcığı odaya taşımak ve veziküllerin slayt yüzeyinden ayrılmasına yardımcı olmak için odayı hafifçe yatırın. Ve çözeltinin tüm hacmini şırıngaya aspire edin. Sonra, bir mililitreplastik tüp içine vezikül çözeltisi aktarın.Mikromanipülasyon için malzeme kurmak için, bir su akışı oluşturmak için aspire, saf su tankı, bir tutucu. Ve herhangi bir hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için tankı yükseltirken hafifçe dokunun, ve pozitif basınç oluşturmak için. Ucunda bir damla oluşana kadar taze glikoz çözeltisi ile serum kaplı kılcal doldurun.Tutucunun sonunda hafif bir su akışı oluşturmak için şırınga boruyu metal tutucudan çıkarın ve glikoz damlasını su akışına bağlamak için kılcal damarı ters çevirin. Sonra, kılcal ve tutucuyu birbirine vidalayın. Pipeti konumlandırmak için, vakum gresi ile birlikte özel yapım alüminyum sahneden iki cam slayt tutkal.Ve slaytları mikroskop aşamasına töyorum. Bir mililitrelik pipet kullanarak, 0.1 molar glikoz ile iki slayt arasında bir menisküs oluşturur. Pipeti ve tutucuyu mikromanipülatörün motor ünitesine yerleştirin.Sıkma tonunu sıkın ve kontrol paneli joystick'ini kaba modda kullanın. Glikoz menisküs yakın mikropipet indirin. Menisküs merkezine ucun konumunu ayarlamak için ince modu kullanın.Dış ve iç yüzeyleri temizlemek için glikoz ucu batırın. Birkaç dakika sonra, menisküs kılcal geri çekin ve taze bir menisküs ile glikoz değiştirin. 20 mililitrelik mikropipet ucuna 0,1 azı sakaroziçinde iki mikrolitre Dev Unilamellar Vezikülasi aspire edin.Vezikülleri menisküse sok. Slayt odasının altındaki vezikülleri gözlemlemek için mikroskobu kullanın. Veziküller hafifçe söndüğünde, emme pipetini yeniden takın ve pipetin ucuna odaklanın.Daha sonra su tankının taban çizgisi yüksekliğini parçacıkların hareketinin durdurulduğu basınca ayarlayın. Buharlaşmayı önlemek için menisküsleri mineral yağile çevreleyin. Bir mikropipet aspirasyon deneyi yapmak için, pipet ucunu menisküsiçine indirin.Bir vezikül aspire emme basıncı küçük bir miktar oluşturun. Seçilen vezikül membranı hafifçe dalgalanmalı ve görünür bir kusur bulunmamalıdır. Diğer veziküllerden aspire vezikül izole etmek için pipet daha yüksek bir seviyeye yükseltmek için mikromanipülatör kullanın.Suyu yaklaşık 10 santimetreye düşürerek vezikülün ilk değerine geri döndürmek için tankı yükseltmeden önce veziküle uygulayın. 0,5 santimetre yükseklikten, membranın dalgalandığı bir basınca kadar emme basıncını yavaşça düşürün. Sonra açıkça ucu, birkaç mikron projeksiyon uzunluğu bir dil görselleştirmek için basıncı artırmak.Bükme modülbelirlemek için, emiş basıncını artırın, adım adım bir şekilde bir seferde bir mikrometre. Metre başına 0,5 ila 0,8 miliNewton'a ulaşıncaya kadar. Beş saniye beklemek ve her adımdan sonra dilin fotoğrafını çekmek.Alan sıkıştırılabilirlik modülasyon belirlemek için, ve lysis gerginlik ve gerinim kopma gerilimi ulaşılıncaya kadar metre başına 0,5 miliNewton'dan emme basıncını artırmaya devam eder. Bu temsili deneyde POPC için alan sıkıştırılabilirlik modülü ve lysis zorlanma literatürden beklenen ile mükemmel bir uyum vardı. Bu tabloda elde edilen polimeromlar için tipik değerler gözlemlenebilir.Diblok kopolimerlerden elde edilen membranın tokluğunun triblok kopolimerden elde edilenlerden çok daha büyük olduğunu unutmayın. İlginçtir, diblock kopolimer kullanarak, bir Dev Hibrid Unilamilar Lipid Polimer Veziküller elde etmek mümkündür lipozomlar için ölçülen daha sağlam bir tokluk göstermek. Bu protokol, örneğin asmatik şok yoluyla membranın geçirgenliğini ölçmek için bir pipet ile vezikülölçümü için yararlı olabilir.Özellikle tribün bağlantısını kurarken her adımı titizlik ve hassasiyetle tamamladığınızdan emin olun. Bu teknik, modifiye veziküllerde ana sınırlardaki çizgi geriliminin ölçülmesi yoluyla membran fizyonunun fiziksel kökenini anlamak için kullanılmıştır.

obtention-giant-unilamellar-hybrid-vesicles-electroformation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Desteklenen lipid çift katmanlarının hazırlanması ve atomik kuvvet mikroskobu ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Ayrılmış faz dev unilamellar veziküller (GUVs) üzerinde deneyler sık fizyolojik çözüm koşulları ihmal. Bu çalışma yüksek tuzluluk arabellek etkisi ücret uygulamasının GUVs trans-membran çözüm asimetri ve sıcaklık sıvı-sıvı faz ayrılmaya bir fonksiyonu olarak çalışmaya yaklaşımlar sunar.

Şarj edilmiş veziküller Floresans mikroskobu ile izlenen simetrik ve asimetrik çözüm koşullarda davranışını faz

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Bu yeni başlayanlar kılavuzu, damlacık transfer yöntemi yoluyla Dev Tek Katmanlı Veziküllerin (GUV'ler) hazırlanması için genel bir protokol sunar, kritik adımları tartışır ve sentetik biyoloji ve mikrorobotik dahil olmak üzere farklı uygulamalar için gerekli olası ayarlamalara yardımcı olacak bilgiler sağlar.

Dev tek katmanlı vezikülleri güvenilir bir şekilde hazırlamak için damlacık transfer yöntemini kullanma

Öğrenin, dev unilamellar hibrid veziküllerin elektroformasyon ile elde edilmesini ve mikropipet aspirasyon ile mekanik özelliklerinin ölçümünü. Bu yöntem, membran esnekliği ve kararlılığı hakkında güvenilir veri sağlar.

Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü

Daha fazla video keşfet