Name: Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan çip kullanarak tek hücreli ortak kültürlerin deterministik oluşturulması ve dinamik izleme yöntemini. Bu teknik, hücre-hücre etkileşimlerini gerçek zamanlı analiz ederek yüksek yakalama verimliliği sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (105-2628-E-400-001-MY2) ve Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp Doktora Programı, Ulusal Chung Hsing Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Yumuşak litografi ile gofret kalıbının imalatı
NOT: Maske deseni verileri önceki yayınımızda mevcuttur14.
<ol><li>120 °C'lik fırında 15 dakika boyunca 4 inçlik silikon gofret kurutun.</li>
	<li>Spin kat 4 g SU-8 2 negatif photoresist üzerine 4-inç silikon gofret üzerine 1.000 rpm için 30 s 5 μm kalınlığında tabaka (katman #1) oluşturmak için.</li>
	<li>Yumuşak fırın tabakası 1 dk için 65 ° C hotplate üzerinde #1 ve daha sonra 3 dakika için 95 ° C ocak için #1 katman aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığına #1 serin tabaka, yarı otomatik maske hizalayıcısının tutucusu üzerine yerleştirin ve #1 krom kaplama fotoğraf maskesi (yakalama-site katmanı) ile hizalayın.</li>
	<li>150 mJ/cm2dozda 365 nm UV ışığı ile #1 tabakasını teşledin.</li>
	<li>1 dk. Transfer tabakası #1 1 dk. 1 dk. 1 dk. #1</li>
	<li>Oda sıcaklığına #1 serin tabaka. Bir propilen glikol monometil eter asetat çözeltisi 2 dakika boyunca kesişmemiş fotodirenç yıkamak için batırın #1.</li>
	<li>Bir yapışkan bant ile katman #1 hizalama işareti kapağı, spin kat 4 g SU-8 10 negatif photoresist katman üzerine #1 1.230 rpm 30 s için 25 μm kalınlığında bir tabaka oluşturmak için #2.</li>
	<li>Bant çıkarın, yumuşak fırın tabakası 3 dakika için 65 ° C hotplate #2, ve daha sonra 7 dakika için 95 ° C hotplate #2 katman aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığına #2 serin katman, katman #2 yarı otomatik maske hizalayıcısının tutucusu üzerine yerleştirin ve katmanı krom kaplama fotoğraf maskesi (bypass kanal katmanı) #2 hizalama #1 hizalama işaretine hizalayın.</li>
	<li>200 mJ/cm2dozda 365 nm UV ışığı ile #2 tabakasını teşledin.</li>
	<li>1 dk boyunca 65 °C'lik bir ocakta hizalayıcıdan #2 ve fırından sonra çıkarın ve #2 95 °C'lik bir ocak tan 3 dk aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığına #2 serin katman ve yapıştırıcı bantla hizalama işareti#1 katmanı kaplayın. Spin kat 4 g SU-8 2050 negatif photoresist katman üzerine #2 1.630 rpm için 30 s bir 100 μm kalınlığında tabaka #3 oluşturmak için.</li>
	<li>5 dk 65 °C hotplate üzerinde bant, yumuşak fırın tabakası #3 çıkarın ve daha sonra 20 dk için 95 ° C hotplate #3 katman aktarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığına #3 serin katman, katman #3 yarı otomatik maske hizalayıcısının tutucusu üzerine yerleştirin ve katmanı krom kaplama fotoğraf maskesi (kültür odası katmanı) #3 hizalama #1 hizalama işaretine hizalayın.</li>
	<li>240 mJ/cm2dozda 365 nm UV ışığı ile #3 tabakasını teşledin.</li>
	<li>5 dk. Transfer tabakası #3 10 dk. 95 °C'lik bir ocak tasniki için 65 °C'lik bir ocak tatabınüzerindeki #3 ve pasta sonrası olarak hizalayıcıdan çıkarın.</li>
	<li>Oda sıcaklığına #3 serin tabaka. 10 dakika boyunca kesişmemiş fotodirençleri yıkamak için propilen glikol monometil eter asetat çözeltisine daldırın ve azot gazıyla hafifçe kurulayın.</li>
</ol>2. Birden fazla tek hücre yakalama için PDMS cihaz hazırlama
<ol><li>Gofret kalıbını ve 100 μL triklorosilane içeren tartı kabını bir kurutucuya yerleştirin (sadece silanizasyon için) ve 15 dakika boyunca bir vakum (-85 kPa) uygulayın. NOT: PdMS dökümden önce hidrofobik yüzey özellikleri oluşturmak için triklorosilane ile gofret yüzeyini silanize edin, böylece gofret PDMS kalıbından zahmetsizce soyulabilir.</li>
	<li>Vakumu durdurun ve daha sonra en az 1 saat boyunca 37 °C'de kurutucudaki gofret kalıbını (sadece silanizasyon için) silanize edin.</li>
	<li>PDMS tabanını ve PDMS kür aracıyı 10:1 oranında karıştırın. 15 cm'lik bir tabaktaki gofret kalıbının üzerine toplam 20 gr karışık PDMS dökün.</li>
	<li>Bir kurutucu içine 15 cm çanak yerleştirin ve 1,5 dakika vakum (-85 kPa) uygulayın. Daha sonra 15 cm'lik tabağı kurutucudan çıkarın. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin. Son olarak, azot gazı ile PDMS artık hava kabarcıkları kaldırın.</li>
	<li>PDMS'yi tedavi etmek için 15 cm'lik kabı 65 °C'de 2-4 saat fırında pişirin.</li>
	<li>PDMS kopyasını gofret kalıbından çıkarın ve 1,5 mm iç çapı ve 0,5 mm iç çaplı zımba layıcı kullanarak PDMS'de 1,5 mm giriş ve 0,5 mm çıkış noktası nı delin (Şekil 1C).</li>
	<li>PDMS çoğalmasını ve slayt yüzeyini çıkarılabilir bantla temizleyin ve yüzeyi oksijen plazması ile tedavi edin (14 s için 100 W).</li>
	<li>PDMS yinelemelerini slaytla el ile hizalayın ve birbirleriyle temas edin.</li>
	<li>PDMS slaytını 1 gün boyunca 65 °C'lik bir fırına yerleştirin. NOT: Aygıt oluşturmak için slayt ve PDMS yinelemesi arasında kalıcı bağ sağlanır.</li>
	<li>PDMS cihazını fosfat tamponlu salinle dolu bir kapta batırın ve kurutucuya yerleştirin. Sonra vakum uygulayın (-85 kPa) için 15 dk hava kabarcıkları kaldırmak için.</li>
	<li>PDMS cihazını bir hücre kültürüne yerleştirin ve cihazı UV ışığı (ışık dalga boyu: 254 nm) ile 30 dakika sterilize edin.</li>
	<li>PDMS cihaz tamponu orta (DMEM-F12 bazal orta %1 antibiyotik ve %10 fetal sığır serumu içeren) ile değiştirin ve PDMS cihazını 4 °C'de 1 gün kuluçkaya yatırın. Bu, hücrelerin PDMS yüzeyine yapışmasını önler.</li>
</ol>3. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
NOT: Hücre tipleri insan lenfatik endotel hücreleri (LECs), insan OSCC TW2.6 hücreleri WNT5B-spesifik shRNA (WNT5B sh4) ve vektör kontrolü (pLKO-GFP) olan önceki çalışma15elde ifade içerir. Ayrıntılı yetiştirme adımları için lütfen önceki yayınımıza bakın.
<ol><li>Hücreler %70-80 birleştiğinde kültür ortamını kaldırın. Daha sonra hücreleri 5 mL steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın.</li>
	<li>WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerine 1 mm floresan boya içeren 1 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin (LED'ler için MV2 ortamı kullanın) ve daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: LEC'ler yeşil klorometilflorescein diasetat (CMFDA) Boya, WNT5B sh4 hücreleri mavi 7-amino-4-kloromtilcoumarin (CMAC) Boya ve pLKO-GFP hücreleri ile boyanmış kırmızı Dil floresan boya ile boyanmıştır.</li>
	<li>Hücreleri 5 mL steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve 2 mL %0,25 Tripsin-EDTA ekleyin (%0,05 LEC'ler için Trypsin-EDTA).</li>
	<li>Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın ve sonra yavaşça hücrelerin ayrılmasıteşvik etmek için doku kültürü çanak dokunun.</li>
	<li>WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerini dağıtmak için 4 mL DMEM-F12 ortamı ekleyin (LEC'ler için 3 mL MV2 orta ve 1 mL tripsin nötrleştirici çözeltisi kullanın). Daha sonra hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 00 0 0'da santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatant'ı çıkarın ve hücre peletini 1 mL DMEM-F12 ortasında hafifçe yeniden askıya alın. Standart Trypan Mavi dışlama yöntemi16kullanarak hemositometredeki canlı hücre sayısını sayın. DMEM-F12 ortamlarında 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonunda 1 mL hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre agregasını önlemek için hücreleri buzda tutun. NOT: Tek hücreli yakalama verimliliğini artırmak için, tek hücreli süspansiyonun iyi ayrıştırılmış olarak dikkatli hazırlanması gerekmektedir.</li>
</ol>4. Birden fazla tek hücreli yakalama ve üçlü tek hücrekültürü
<ol><li>Cihazın çıkışı ile şırınga pompası arasında bir poli-tetrafloroethene (PTFE) tüp bağlayın. Ortamı çıkarın ve PDMS cihazının girişine 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonla 1 μL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun 0,3 μL/dk akış hızında bir şırınga pompası ile cihaza yüklenmesi(Şekil 2A). Akış yönü girişten çıkışa kadardır. NOT: Hücre sedimantasyonunu önlemek için hücre süspansiyonunu girişe ekledikten hemen sonra yükleyin.</li>
	<li>4.2.Adımdan sonra PDMS cihazının girişine 1 μL DMEM-F12 ortamı ekleyin.DMEM-F12 ortamını 0,3 μL/dk akış hızında bir şırınga pompası ile cihaza yükleyin (Şekil 2B). Akış yönü girişten çıkışa doğru akıyordu.</li>
	<li>Cihaza 0,3 μL DMEM-F12 ortamını 10 μL/dk akış hızında bir şırınga pompası ile yükleyin (Şekil 2C). Akış yönü çıkıştan girişe doğru akıyordu.</li>
	<li>Diğer hücre türlerini aygıta yüklemek için 4,1 ile 4,4 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Hücre yakalama tamamladıktan sonra, her kültür odası görüntü 4x lens ile bir mikroskop kullanın. NOT: Hücrelerin floresan emisyonları, her kültür odasındaki tek tek hücrelerin sayısını belirlemek ve saymak için kullanılmıştır.</li>
	<li>PTFE tüpünü çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için giriş ve prizini pololefin bantla kapatın.</li>
	<li>PDMS cihazını 10 cm'lik bir kültür kabına taşıyın ve cihazın buharlaşmasını önlemek için PDMS cihazının etrafına 10 mL steril PBS ekleyin.</li>
	<li>Kültür çanamasını üçlü tek hücreli kültür için bir kuluçka makinesine (37 ° C, %5 CO2 ve %95 nem) aktarın.</li>
	<li>Mikroskopik gözlemlemek ve fotoğraf hücre büyüme her 12 saat.</li>
</ol>

<ol><li>Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+systems+and+technologies%3A+taking+synthetic+biology+to+the+next+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065(2014).</li>
<li>Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Poisson+distribution+and+beyond%3A+methods+for+microfluidic+droplet+production+and+single+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456, 804(2008).</li>
<li>Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+manipulation+and+analysis+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Single-Cell+Trapping+And+Imaging+Using+Microwell+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+platform+for+stem+cell+niche+co-cultures+and+downstream+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 340(2015).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+droplet-based+co-encapsulation+and+pairing+of+microparticles+via+active+sorting+and+downstream+merging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging.</a> Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+single+cell+co-culture+microenvironments+isolated+by+two-phase+flow+with+continuous+nutrient+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).</li>
<li>Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+level+co-culture+platform+for+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell level co-culture platform for intercellular communication.</a> Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+TCR+T+cell+screening+using+single-cell+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).</li>
<li>He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+shuttling+for+deterministic+high-efficiency+multiple+single-cell+capture+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+WNT5B+modulates+in+vitro+lymphangiogenesis+via+induction+of+partial+endothelial-mesenchymal+transition+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells.</a> Oncogene. 36, 1503(2016).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).</li>
<li>Kim, J. B., Stein, R., O'hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).</li>
<li>Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic+co-culture+system+for+investigation+of+bacterial+cancer+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting.</a> Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Tümör mikroortamında çeşitli hücrelerin hücreler arası etkileşimleri tümörün ilerlemesinde önemli bir rol oynamaktadır17. Hücre-hücre etkileşimlerinin mekanizmasını anlamak için ortak bir analitik yöntem olarak ortak kültür sistemleri kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla hücre tipleri ve hücrelerin heterojenliği deneysel karmaşıklık ve analitik zorluklara yol açmıştır.
Hidrodinamik kapatma çipi, seyreltme yöntemi ve mikrokuyu platformundaki Poisson dağıtım sınırlaması ...

Farklı tipte tek hücrelerin verimli bir şekilde yakalanması ve yeterli kültür alanı sağlanması, tek hücreli birden fazla hücre türünden oluşan tek hücre ortak kültür deneyleri için gereklidir1. Seyreltme sınırlandırılması, gerekli ekipman düşük maliyet nedeniyle, bu tür deneyler için tek hücreleri hazırlamak için en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Ancak, Poisson dağıtım sınırlaması nedeniyle, maksimum tek hücre edinimi olasılığı sadece% 37, deneysel operasyon zahmetli ve zaman alıcı2yapma. Buna karşılık, floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanarak yüksek verimli tek hücreleri hazırlamak için Poisson dağıtım sınırlaması üstesinden gelebilir3. Ancak, facs pahalı enstrümantasyon ve bakım maliyeti nedeniyle bazı laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Mikrofabrikasyon cihazlar son zamanlarda tek hücreli yakalama için geliştirilmiştir4, tek hücre eşleştirme5, ve tek hücre kültürü uygulamaları. Bu aygıtlar, tekhücreleridoğru bir şekilde manipüle etme, yüksek işlem denemeleri yapma veya numune ve reaktif tüketimini azaltma yeteneklerine bağlı olarak avantajlıdır 6. Ancak, mevcut mikroakışkan cihazlar ile birden fazla hücre türleri ile tek hücreli co-kültür deneyleri gerçekleştirmek hala Poisson dağılımı1sınırlama nedeniyle zor ,7,8, veya yetersizlik tek hücre4,5,6,9,10ikiden fazla tür yakalamak için cihazlar .
Örneğin, Yoon ve ark. hücre-hücre etkileşimçalışması11için bir mikroakışkan cihaz bildirdi. Bu cihaz, hücreleri tek bir odadaki çiftleri eşleştirmek için olasılıksal yöntemi kullanır. Ancak, aygıt yapısındaki geometrik kısıtlamalar nedeniyle yalnızca iki farklı hücre türünün eşleşmesini sağlayabilir. Lee ve ark. başka bir rapor yakalamak ve tek hücreleri eşleştirmek için deterministik bir yöntem gösterdi12. Bu cihaz deterministik yöntemle eşleştirme verimliliğini artırır, ancak hücreleri eşleştirmek için gereken uzun çalışma süresi ile sınırlıdır. Özellikle, ikinci hücre yakalama sadece ilk yakalanan hücre yüzeye sonra 24 h. Zhao ve ark. tek bir hücre13iki tür yakalamak için bir damlacık tabanlı mikroakışkan cihaz rapor sonra yapılabilir. Damlacık bazlı mikroakışkan cihazın hala Poisson dağılımıile sınırlı olduğunu ve sadece bağlı olmayan hücrelerde kullanılabileceğini ve ekim işlemi sırasında kültür çözümünü değiştirmenin mümkün olmadığını bulduk.
Daha önce, kültür odasına tek hücreli birden fazla türde yakalamak için deterministik hidrodinamik kuvvetleri kullanan ve daha sonra analiz etmek için hücre ortak kültür deneyi gerçekleştirebilen bir mikroakışkan "hidrodinamik kapatma çipi" geliştirdik. hücre-hücre etkileşimleri altında tek tek hücre geçiş davranışı14. Hidrodinamik kapatma çipi, her biri serpantin by-pass kanalı, bir yakalama alanı ve bir kültür odası içeren dizili bir birim kümesinden oluşur. Serpantin by-pass kanalı ile kültür odası arasındaki akış direnci farkı ve özel olarak tasarlanmış bir işlem prosedürü kullanılarak, farklı tipte tek hücreler tekrar tekrar kültür odasına yakalanabilir. Özellikle, kültür odasının geniş alanı sadece hücre yakalama sırasında fışkıran hücre önlemek değil, aynı zamanda hücrelerin yayılması için yeterli alan sağlamak, çoğalmak ve göç, canlı tek hücreetkileşimleri gözlemlemek için izin. Bu makalede, bu cihazın üretimi ve ayrıntılı protokol adımları üzerinde duruluyor.

<table><tbody><tr><td>3M Gelişmiş Poliolefin Teşhis Mikroakışkan Tıbbi Bant</td><td>3M Şirketi</td><td>9795R</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamin-Penisilin-Streptomisin</td></tr><tr><td>AutoCAD yazılımı</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>Parça No. 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>CellTracke Mavi CMAC Boya</td><td>Invitrogen</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Yeşil CMFDA Boya</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Konvansiyonel fırın</td><td>YEONG-SHIN şirketi</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>Bel-Art Ürünleri</td><td>F42020-0000</td><td>Yerden tasarruf sağlayan vakumlu kurutucu 190 mm beyaz taban</td></tr><tr><td>DiIC12(3) hücre zarı boyası</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Hücre izleyici olarak kullanılır</td></tr><tr><td>DMEM-F12 orta</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 700 serisi Cam şırınga (0.1 ml)</td> <td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 & mikro; L, Model 710 RN SYR, Küçük Çıkarılabilir NDL, 22s ga, 2 inç, nokta stili 2</td></tr><tr><td>Harris Tek Çekirdekli zımba</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15075</td>, <td>1,5 mm iç çaplı</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core zımba</td><td>ile Ted Pella, Inc.</td><td>15071</td>, <td>0,5 mm iç çaplı</td></tr><tr><td>Ocak gözü</td><td>ile YOTEC şirketi</td><td>: YS-300S,</td><td></td></tr><tr><td>Msak hizalayıcı</td>, <td>Deya, Optronic, CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen plazması</td><td>NORDSON MARCH</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Tezgah Üstü Plazma Arıtma Sistemi</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) kiti</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Poli-tetrafloroeten (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>iç çap, 0,51 mm; dış çap, 0,82 mm</td></tr><tr><td>Çıkarılabilir bant</td><td>3M Company</td><td>Scotch Çıkarılabilir Bant 811</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret</td><td>Eltech kurumsal</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Spin kaplayıcı</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2 "~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 negatif fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 negatif fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 negatif fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştirici</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Propilen glikol monometil eter asetat</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard</td><td>Aparatı 703007</td><td></td></tr><tr><td>Triklorosilan</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil. Tehlikeli. Solunum yollarını aşındırır, su ile şiddetli reaksiyona girer.</td></tr><tr><td>Tripsin Nötrleştirici Çözelti</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroakışkan Çiple deterministik bir Şekilde tek hücreli ortak kültürlerin oluşturulması

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Hücre ortak kültür tahlilleri yaygın kanser de dahil olmak üzere hastalıkların biyolojisini daha iyi anlamak için farklı hücre tipleri arasındaki hücre-hücre etkileşimleri incelemek için kullanılmıştır. Ancak, geleneksel eş kültür sistemlerini kullanarak son derece heterojen hücre popülasyonlarında hücreler arası etkileşimlerin karmaşık mekanizmasını netleştirmek zordur, çünkü hücre alt popülasyonunun heterojenliği ortalama değerler tarafından gizlenmektedir; geleneksel ortak kültür sistemleri sadece nüfus sinyalini tanımlamak için kullanılabilir, ancak tek tek hücre davranışını izlemekten acizdir. Ayrıca, konvansiyonel tek hücreli deneysel yöntemler Poisson dağılımı nedeniyle hücre manipülasyonu düşük verimlilik var. Mikrofabrikasyon cihazlar tek hücreli çalışmalar için yeni gelişen bir teknolojidir, çünkü tek hücreleri yüksek iş seviyesinde doğru bir şekilde manipüle edebilirler ve numune ve reaktif tüketimini azaltabilirler. Burada, birden fazla tek hücreli ortak kültür için bir mikroakışkan çip in konseptini ve uygulamasını açıklıyoruz. Çip, bir kültür odasında birden fazla hücre türünü verimli bir şekilde yakalayabilir (%~46) ve tek hücre düzeyinde hücre-hücre etkileşimi altında hücrelerin davranışlarını (örneğin, göç, çoğalma, vb.) incelemek için yeterli bir kültür alanına sahiptir. Lenfatik endotel hücreleri ve oral skuamöz hücreli karsinom, çoklu tek hücreli etkileşim çalışmaları için mikroakışkan platformüzerinde tek hücreli ortak kültür deneyi yapmak için kullanıldı.

Cihaz, kesilmiş bir PDMS aygıtının kesit fotoğrafından gösterildiği gibi üç katmanlı bir yapıya sahiptir(Şekil 1A). İlk katman, kültür odasını ve by-pass kanalını birbirine bağlayan bir yakalama alanı (6,0 μm genişliğinde ve 4,6 m yüksekliğinde) içerir. Kültür odası ve by-pass kanalı arasındaki akış direnci farkı hücrelerin yakalama konumuna akmasına ve küçük yolun girişini doldurmasına neden olur. Bir hücre yakalama konumunda yakalandıktan s...

Bu rapor, birden fazla hücrenin yüksek verimli eşleştirme ve mikroskobik analizinin sağlanabileceği tek bir hücre kültürü deneyi kurmak için mikroakışkan çip tabanlı bir yöntem tanımlanmaktadır.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Hücre-hücre etkileşiminin hücre davranışları üzerindeki etkisini anlamak için yakalama verimliliğini dinamik canlı hücre görüntü gözlemi ile etkili bir şekilde birleştirmek çok önemlidir. Bu tüp, daha büyük bir odada birden fazla tek hücreyi verimli bir şekilde yakalayabilir ve birden fazla tek hücreli etkileşim davranışının dinamik takibi için yeterli kültürleri temellendirebilir. PDMS aygıtını hazırlayarak başlayın.Bir kurutucu triklorosilane 100 mikrolitre ile tartım çanak bir gofret kalıbı yerleştirin ve 15 dakika boyunca bir vakum uygulayın. Vakum durdurun ve en az bir saat boyunca 37 santigrat derece de kurutucu gofret kalıbı salisil. PDMS tabanını ve PDMS kür ajanını 10'a 1 oranında karıştırın, ardından 15 santimetrelik bir tabaktaki gofret kalıbına toplam 20 gram karışımı dökün.Bir kurutucu içine 15 santimetre çanak yerleştirin ve bir buçuk dakika için bir vakum uygulayın. Sonra kurutucu dan çanak çıkarın ve azot gazı ile PDMS artık hava kabarcıkları ortadan kaldırmak. 2-4 saat boyunca 65 santigrat derece bir fırında çanak yerleştirerek PDMS Cure.Bittiğinde, gofret kalıbından PDMS kopyasını çıkarın ve PDMS'de 1,5 milimetrelik giriş ve 0,5 milimetrelik bir çıkış noktasını delin. PDMS yinelemesini ve slayt yüzeyini çıkarılabilir bantla temizleyin. Oksijen plazma ile yüzey tedavi edin.Ardından, PDMS yinelemesini slaytla el ile hizalayın ve birbirleriyle temas edin. PDMS slaytını 65 derece santigrat fırında bir gün bekletin. Ertesi gün, PDMS aygıtını PBS ile dolu bir kapta batırın.Kurutucuiçine yerleştirin ve 15 dakika vakum uygulayın. Cihazı bir hücre kültürüne taşıyın ve UV ışığıyla 30 dakika sterilize edin. PDMS cihaz arabelleği orta ile değiştirin ve bir gün için dört derece santigrat de inkübün.Hücreler %70 ila %80 biraraya geldiğinde, kültür ortamını çıkarın ve beş mililitre PBS ile yavaşça üç kez yıkayın. WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerine bir mikromolar floresan boya içeren bir mililitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra hücreleri beş mililitre steril PBS ile üç kez hafifçe yıkayın, PBS'yi çıkarın ve %0.25 Tripsin-EDTA'dan iki mililitre ekleyin.Oda sıcaklığında dört dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın, sonra yavaşça hücre müfrezesini teşvik etmek için kültür çanağı dokunun. WNT5B sh4 ve pLKO-GFP hücrelerini dağıtmak için dört mililitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 xg'de üç dakika santrifüj edin. Süpernatant'ı çıkarın ve hücre peletini bir mililitre DMEM/F-12 orta sında yavaşça yeniden askıya alın.Mililitrede mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve hücre agregasını önlemek için buzda tutun. Polytetrafloroetilen tüpü cihazın çıkışı ile şırınga pompası arasında bağlayın. Ortamı çıkarın ve hazırlanan hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini PDMS aygıtının girişine ekleyin.Daha sonra, dakikada 0,3 mikrolitre akış hızında bir şırınga pompası kullanarak cihaza hücre süspansiyon yükleyin. Cihazın girişine bir mikrolitre DMEM/F-12 ortamı ekleyin, ardından bir şırınga pompası kullanarak ortamı cihaza yükleyin. Dakikada 10 mikrolitre akış hızında şırınga pompası ile cihaza 0,3 mikrolitre DMEM/F12 ortamı yükleyin.Hücreler yüklendikten sonra tüpü çıkarın ve kapalı bir kültür sistemi oluşturmak için giriş ve çıkışı pololefin bantla kapatın. PDMS cihazını 10 santimetrelik bir kültür yemeğine taşıyın ve ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafına 10 mililitre steril PBS ekleyin. Kültür çanamasını üçlü tek hücreli kültür için bir kuvöze aktarın.PDMS aygıtı, kültür odasına ve bypass kanalına bağlanan bir yakalama sitesi olan üç katmanlı bir yapıya sahiptir. Kültür odası ve bypass kanalı arasındaki akış direnci farkı hücrenin yakalama konumuna akmasını sağlar, bu da aşağıdaki hücrenin bypass kanalından bir sonraki yakalama bölgesine geçmesine neden olur. Reflü adımı hücreyi yakalama alanından serbest bırakmak ve kültür odasına göndermek için kullanılır.Bu protokolün hücre yakalama etkinliği üç farklı hücre tipinde değerlendirildi. İnsan lenfatik endotel hücreleri, veya LECs, insan oral skuamöz hücreli karsinom T2.6 hücreleri WNT5B-spesifik kısa saç tokası RNA ifade hücreleri, ve pLKO-GFP vektör kontrol hücreleri. Gösterilen üç hücrenin tek hücreli yakalama etkinliği LEC'ler için yaklaşık %71, WNT5B sh4 hücreleri için %74 ve pLKO-GFP hücreleri için %78 idi.Üçlü tek hücreli yakalama verimi %48 idi Bu yöntem lenfatik endotel hücreleri ve skuamöz kanser hücrelerinin birden fazla tek hücreli ko-kültürleri için kullanılabilir ve hücrenin çoğalması ve morfolojisi mikroskop altında gözlemlenebilir. Hazırlanan hücre süspansiyonlarının en az hücre agregasına sahip olduğundan emin olmak önemlidir, çünkü hücre agregaları sadece tek eşleştirme verimliliğini azaltmakla kaynıp mikro kanalları tıkayabilir. Tek tek hücreler arasındaki hücre-hücre etkileşimi hücre davranışlarının kontrolünde önemli bir rol oynar.Yöntemimiz, araştırmacıların hücre-hücre etkileşimini tek bir hücre düzeyinde incelemelerine yardımcı olmak için etkili bir araç sağlayabilir, bu da nüfusa dayalı çalışmalardan kolayca elde edilemeyen yeni mekanizmaların keşfedilmesine yol açabilir.

establishing-single-cell-based-co-cultures-deterministic-manner-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, mikro-biyoreaktörler hücrelerin üç boyutlu ekimi için çip tabanlı platform açıklar. Bir çip 10 milyon kadar ev. steril, kapalı bir dolaşım döngü içinde sıvı akışı, oksijen basıncı vb ilişkin kesin olarak tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen hücreler.

Perfüze Mikro-biyoreaktörler Chip tabanlı üç boyutlu Hücre Kültürü

Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Bu protokolde, prokaryotik mikroorganizmaların tek hücreli analizi için bir mikroakışkan pikolitre biyoreaktörün (PLBR) üretimi, kurulumu ve temel çalışması tanıtılmaktadır. Endüstriyel olarak ilgili mikroorganizmalar, geleneksel yöntemlerle neredeyse imkansız olan, belirli zaman dilimlerinde büyüme hızı, morfoloji ve fenotipik heterojenlik hakkında bilgi sahibi olmaya izin veren ilke kanıtı olarak analiz edildi.

Mikrobiyal Tek Hücreli Analiz için Mikroakışkan Pikolitre Biyoreaktör: Fabrikasyon, Sistem Kurulumu ve Çalışması

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Burada, birincil hücreleri, doku modellerini ve punch biyopsilerini 28 güne kadar mikroakışkan çok organlı bir çipte kokültür yapmak için bir protokol sunuyoruz. İnsan dermal mikrovasküler endotel hücreleri, karaciğer agregatları ve deri biyopsileri ortak bir besiyeri dolaşımında başarılı bir şekilde birleştirildi.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Tek hücreli de iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamikleri uzun vadeli gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlayan bir mikroakışkan kanser-on-çip modeli, "Evrim Hızlandırıcı" teknolojisi saiyoruz Düzey. Bu teknolojinin temel araştırma veya klinik öncesi ilaç geliştirme için bir in vitro model olarak çalışması beklenmektedir.

Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi

1500 kültür ünitesi, bir dizi gelişmiş peristaltik pompa ve yerinde karıştırma modülünden oluşan karmaşık yaşam makineleri üzerinde yüksek verimli çalışmalar için mikroakışkan bir sistem sunuyoruz. Mikroakışkan çip, vivodaki son derece karmaşık ve dinamik mikro çevresel koşulların analizini sağlar.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Mikroakışkan bir çip üzerinde fare embriyonik dokusunun kültürü ve manipülasyonu için bir protokol sağlanır. Yol modülatörlerinin darbelerini uygulayarak, bu sistem fare somitogenezinin fonksiyonel araştırması için sinyal salınımlarını harici olarak kontrol etmek için kullanılabilir.

Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı

Öğrenin, mikroakışkan çip kullanarak tek hücreli ortak kültürlerin deterministik oluşturulması ve dinamik izleme yöntemini. Bu teknik, hücre-hücre etkileşimlerini gerçek zamanlı analiz ederek yüksek yakalama verimliliği sağlar.

Mikroakışkan Çiple Deterministik Bir Şekilde Tek Hücreli Ortak Kültürlerin Oluşturulması

Daha fazla video keşfet