Name: Glioblastomada İşlevsel İlişkili MiRNAların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Keşfedin, yapay DNA kümeleri oluşturarak glioblastoma hücrelerinde birden fazla miRNA'yı aynı anda modüle etme yöntemini. Bu hesaplamalı biyoinformatik protokol, gen tedavisi uygulamaları için esnek bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar destek ve yapıcı eleştiri için Harvey Cushing Nöro Onkoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS tarafından desteklenmiştir K12NS80223 ve K08NS101091 P. P.

1. Glioblastoma'da Fonksiyonel İlişkili MiRNA'ların Karakterizasyonu
<ol><li>Glioblastoma vs beyinde geniş diferansiyel miRNA ekspresyonunun analizi
	<ol>
<li>İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA'ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir:<ol>
<li>Mine Kanser Genom Atlası, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga bulunan, veri sıralama için11.</li>
			<li>Taze bir operatif numuneden mikrodizi analizi yapın12.</li>
			<li>Daha önce yayımlanmış veri kümelerini kullanın13. NOT: Hangi yöntem seçilirse seçilsin, çıktı, ekspresyonu tümör biyolojisi ile istatistiksel olarak ilişkili (doğrudan veya ters) miRNA'ların toplu kümesini sağlar. Bu ilk grup, aşağıda açıkıldığı gibi ifade değişikliklerinin daha dinamik bir çözümlemesi gerçekleştirerek en sıkı işlevsel ilişkilendirmeyi görüntüleyen bir miRNA alt kümesinin tanımlanması için daha fazla analiz edilen miRNA'lar havuzunu oluşturur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Koşula özel miRNA ifade analizi
	<ol>
<li>Hücre farklılaşmasının indüksiyonu:<ol>
<li>Tek katmanlı bir kültürün oluşmasını sağlamak için önceden kaplanmış poli-D-lizin (PDL) plastik tabaklar kullanın. Bulaşık kaplaması için PDL'yi 100 μg/mL konsantrasyonda suda çözün. 25 cm2 yüzeyde 1 mL çözelti kullanın. PDL çözeltisi uygulamasından sonra PBS 6 h ile 2x durulayın.</li>
			<li>Eşit miktarlarda insan nöral kök hücreleri (100.000 hücre/5 mL) ya kök hücre orta (nörobazal orta + B27 takviyesi + 20 ng/mL EGF/FGF), astrositik farklılaşma ortamı (DMEM + 10% FBS) veya nöronal diferansiyasyon ortamı (nörobazal orta + B27 ek, + 2 μM retinoik asit)14. Oligodendrocyte farklılaşma protokolü IGF-1 eklenmesini gerektirir (200 ng / mL) EGF/ FGF kaldırmasonra 14,15.</li>
			<li>Hücre kaplamasonra, 37 °C, 5% CO21 hafta boyunca inkübatör yerleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>RNA çıkarma:<ol>
<li>7 gün sonra, kuvözhücreleri çıkarın ve orta çıkarın.</li>
			<li>Hücreleri PBS (5 mL) ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri lyse ve bir hücre kazıyıcı kullanarak 1,5 mL microfuge tüp içine hücreleri kazımak için lysis reaktif (Malzemeler Tablosubakınız) 1 mL ekleyin. Lysed hücreleri içeren tüpleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin.</li>
			<li>Üreticinin yönergelerini izleyerek toplam RNA yalıtımına devam edin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>miRNA ifade analizi:<ol>
<li>Gerçek zamanlı PCR ile üç farklılaşma deseni arasında 1.1 adımda tanımlanan belirli miRNA'ların diferansiyel ifadesini, TaqMan probları kullanarak ve ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyon için üreticinin protokollerini izleyerek ölçün ( Şekil 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>MiRNA kümelerinin strese özel zorluklara göre doğrulanması
	<ol>
<li>Kültür G34 glioblastoma nörobazal ortamda kök benzeri hücreler + B27 takviyesi + 20 ng/mL EGF/FGF. 25 cm2 düşük eki şişede 5 mL'lik 1 x 106 hücre ile başlayın.</li>
		<li>Kaplamadan sonra 48 saat başlayarak, dna alkilleyici ajan temozolomide (TMZ) her 5 günde bir iki katına ekleyin, aşağıdaki gibi:<ol>
<li>5 gün boyunca 5 μM ile başlayın. 5 gün sonra, orta kaldırmak ve temozolomide olmadan taze orta ile değiştirin, hayatta kalan hücrelerin kurtarmak için izin vermek için. 48 saat sonra, 10 μM TMZ ekleyin ve başka bir 5 gün kuluçka.</li>
			<li>Tekrar adım 1.3.2.1, en az 100 μM konsantrasyonu ulaşılır ve hücreler ilaca dirençli hale gelene kadar, her zaman IKI katına TMZkonsantrasyonu 10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Paralel bir deneyde, G34 hücrelerini aşağıdaki gibi ışınla:<ol>
<li>25 cm2 düşük ek şişede 5 mL'de 1 x 106 hücrenin kaplamadan 48 saat sonra başlayan hücrelere 2 Gy enerji ile ışınlanır (foton emisyonu sağlayan herhangi bir ışınlayıcı kabul edilebilir). Hücreleri kuvöze geri ver ve rahatsız etmeyin. 48 saat sonra, ek 2 Gy enerji ile hücreleri tekrar ışın.</li>
			<li>Toplam 10 Gy enerji verilene kadar 1.3.3.1 4x adımını tekrarlayın.</li>
			<li>Hücreleri kuvöze geri verin ve aşağı analizden önce en az 5 gün boyunca taze ortamda iyileşmelerine izin verin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Direnç indüksiyonundan sonra, lysis reaktifi kullanarak hücreleri lyse ve üreticinin protokolüne göre toplam RNA ayıklayın.</li>
		<li>1.1-1.2 bölümlerinde tanımlanan belirli miRNA'ların ifadesini adım 1.2.1'de açıklandığı gibi analiz edin (Şekil 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Kümelenmiş miRNA'ların işlevsel yakınsamasının karakterizasyonu
	<ol>
<li>miRNA hedefleme tahmin araçları kullanılarak elde edilen 1.2-1.3 bölümlerinde tanımlanan her bir miRNA'nın öngörülen targetome'sini elde edin. NOT: Algoritması periyodik olarak16olarak güncelleştirilir gibi biz genellikle TargetScan başvurmak. Ek tahmin araçları miRanda17, miRDB18, ve DIANA-miRPath19vardır. Tüm bu programlar ücretsiz, web tabanlı uygulamalardır.<ol>
<li>Targetscan'ın ön sayfasından, önceden doldurulan açılır menüden ilgi miRNA'sını seçin. Gönder düğmesini tıklatın.</li>
			<li>İndirme tablosu bağlantısını kullanarak ortaya çıkan hedefler listesini elektronik tablo olarak indirin (Ek Şekil 1).</li>
			<li>Yanlış pozitif tahminler olasılığını azaltmak için, alt akış analizlerinde yalnızca korunan siteler sütunundaki hedefleri içerir. Ayrıca, ek miRNA tahmin programları (yukarıya bakın) kullanılarak ve yalnızca tüm algoritmalarda ortak olan hedefler de dahil olmak üzere daha fazla sıkılık elde edilebilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elde edilen targetomeleri, her miRNA'da yaygın olan yolların zenginleşmesini değerlendirmek için ToppGene Suite20 kullanarak Gene Ontoloji kategorilerine göre sınıflandırın.<ol>
<li>Giriş türü olarak HGNC sembolü kullanılarak "Eğitim gen kümesi" penceresinde 1.4.1 adımdan elde edilen hedeflerin listesini yapıştırın. Gönder > Başlat'ıtıklatın. Program genlerin girilen listesi için en önemli "Git" kategorilerini gösteren bir çıktı tablosu sağlayacaktır(Ek Şekil 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sonunda ortak bir yol veya hücresel sürecin düzenlenmesi (bu durumda, kromatin düzenleme) düzenlenmesi için her miRNA katkısını kurmak için, belirli hücresel süreç dahil genlerin tam listesi ne karşı adım 1.4.1 elde edilen her targetome kontrol ( yani, kromatin regülasyonu), Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinde sağlanan Venn diyagramı işlevini kullanarak http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. NOT: Bu program aynı anda birden fazla grubun kesişmesine izin verir (Şekil 3). Her miRNA tarafından sağlanan belirli benzersiz hedefler daha sonra açıklamalı ve downstream fonksiyonel deneyler için seçilir.<ol>
<li>Programın ön sayfasında, her bir miRNA veya ilgili pencerelere ilgi için hedef mRNA'lar varsa listeyi yükleyin veya kopyalayın/yapıştırın. Her listeyi benzersiz bir tanımlayıcıyla adlandırın.</li>
			<li>Gönder'itıklatın. Program, her sektördeki gen lerin sayısının yanı sıra her alt küme ve kesişme kombinasyonları için mRNA'ların tam listesini içeren bir Venn diyagramının görsel çıktısını sağlayacaktır.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. MiRNA Modüllerinin PoliksitRonik Transgenik Kümeye Montajı
<ol><li>
MiR-17-92 küme lokusuna göre transgenik iskele hazırlanması
	<ol>
<li>Ensembl genomtarayıcı21miR-17-92 kümesinin nükleotit dizisini edinin. Locusun altı kodlanmış miRNA saç tokasını ve çekirdek dizisinin hem yukarı (5') hem de aşağı akım (3') dizilerini kapsayan ~800 baz çifti "çekirdek" dizisini seçin.</li>
		<li>Yukarıdaki sırayı herhangi bir sözcük düzenleme programına yapıştırın.</li>
		<li>MiRBase22'dealarak altı doğal saç tokasının her birinin dizisini tanımlayın. Bu dizilerin her birini daha önce tanımlanmış "çekirdek" dizisinin açıklığı içinde işaretleyin. Her saç tokası arasındaki tüm diziler, transgenin doğru işlenmesi için önemli olan spacer dizilerini temsil eder.</li>
		<li>Her saç tokasının 5' ve 3' uçlarında 3-5 nükleotit hariç, "çekirdek" dizisinden doğal saç tokası dizilerini çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Birden fazla miRNA'yı kodlayan yeni bir transgen oluşturma
	<ol>
<li>MiRBase'den transjende aşırı ifade edilmesi amaçlanan miRNA'ların saç tokası dizilerini edinin. Mikroişlemci bölünmesinin olduğu belirli nükleotitleri dikkatlice not edin.</li>
		<li>Çıkarılan saç tokalarını (adım 2.1.4) adım 2.2.1'de elde edilen istenilen miRNA'ların saç toka dizileri ile değiştirin.</li>
		<li>Transgenin her iki yan bölgesine de istenilen kısıtlama dizilerini ekleyerek, tercih edilen teslimat vektörlerine ikame etmeyi kolaylaştırın. Seçilen kısıtlama dizilerinin dizinin içinde bulunmadığını doğrulayın.</li>
		<li>Negatif kontroller için, her olgun miRNA'nın doğal 20 nükleotit dizisini değiştirmek için 20 nükleotit şifreli diziler kullanın. bu karışık dizileri https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence gibi çevrimiçi bir aracı kullanarak oluşturun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transgenin iki boyutlu yapısını doğrulama
	<ol>
<li>RNA yapı tahmin yazılım programı RNAweb Fold23içine tam transgenik sırasını kopyalayın.</li>
		<li>Standart program ayarlarını kullanarak Devam et'itıklatın.</li>
		<li>Özellikle iyi tanımlanmış saç tokalarının varlığı ve mikroişlemci dekolte bölgesine yakın en az 11 nükleotit li çift iplikli kök yapının varlığı için grafik çıktısını analiz edin. Ayrıca, saç tokası dizileri içinde dallanma noktalarının yokluğuna bakın (Şekil 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNA Sentezi ile Transgen elde edilmesi
<ol><li>İmrital miRNA kümesinin tasarımı ndan ve silico doğrulamasından sonra, ticari satıcılardan DNA sentezi kullanarak çalışma sırasını elde edin24 ve aşağı akım klonlama ile vektörler ve transgen teslimi ile devam edin. İn vitro doğum için lentiviral vektörler10 ve in vivo intrakranial doğum için adeno-ilişkili virüsler (AAV) kullandık25.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.

Bu protokol, miRNA'ların izole olarak çalışmak yerine, biyolojik olarak gruplar halinde çalışarak ilgili olduğu ve bu grupların transkripsiyon olarak belirli hücresel bağlamlar tarafından belirlendiği fikrine dayanmaktadır26. Bu yaklaşımı çevirisel açıdan haklı göstermek için, hücrelerde/dokularda bu çoklu miRNA deseninin rekreasyonuna olanak tanıyan bir takip protokolü getirilmiştir. Bu miRNA'ların nispeten basit biyogenezinden yararlanarak mümkündür, böylece karakteristik miRNA saç tokasının mik...

miRNA'lar birçok hastalığa geniş bir gen terapisi yaklaşımının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyoruz1,2,3, kanser dahil4,5. Bu küçük boyutu6dahil olmak üzere bu biyolojik moleküllerin çeşitli benzersiz özellikleri dayanmaktadır, basit biyogenez7, ve ilişki içinde işlev doğal eğilim8. Birçok hastalık genellikle karmaşık biyolojik fonksiyonların düzenlenmesi üzerinde yakınsama belirli miRNA ekspresyon desenleri ile karakterizedir9. Bu yöntemin amacı ilk olarak belirli hücresel fonksiyonlar için sinerjik olarak ilgili miRNA gruplarını tanımlamak için bir strateji tanımlamaktır. Sonuç olarak, bu tür miRNA kombinasyonlarının downstream çalışmalarda ve uygulamalarda yeniden kurulması için bir strateji sağlar.
Bu yöntem, birden fazla miRNA'nın aynı anda fonksiyonel analizini sağlar, çok sayıda mRNA'yı eşzamanlı olarak hedeflemelerinden yararlanarak hastalıkların karmaşık manzaralarını özetlemektedir. Bu yaklaşım son zamanlarda üç miRNA'lardan oluşan bir grubu tanımlamak için kullanılmıştır ki 1) aynı anda beyin kanserinde göz denir ve 2) sinirsel farklılaşma sırasında güçlü bir ko-ekspresyon paterni göstermek yanı sıra radyasyon veya bir genotoksik strese yanıt olarak DNA alkilleyici ajan. Üç miRNA'dan oluşan bu modülün, aşağıda açıklanan kümeleme yöntemi ile kombinatoryal yeniden ekspresyonu, kanser hücrelerinin biyolojisi ile derin bir girişimle sonuçlanır ve klinik öncesi çalışmalar için gen terapisi stratejisi olarak kolayca kullanılabilir10. Bu protokol miRNA araştırmave çeviri uygulamaları dahil olanlar için özel ilgi olabilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.4 düşük erime sıcaklığı agaroz &</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & M steril filtre ünitesi</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Mikrosantrifüj tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu plakalar&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Atimik fareler (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sıyırıcı, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum 137 ışınlayıcı&nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Çekirdek Tesisi (Harvard Tıp Okulu)</td><td></td></tr> <tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, piruvat ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' S Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y çözümü&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>İnsan primer glioma kök benzeri hücreleri (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Dr. EA Chiocca (Brigham ve Kadınlar ' s Hastanesi, Boston, MA)</td></tr> <tr><td>İnsan primer glioma kök benzeri hücreler (MGG4)</td><td></td><td></td> <td>Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) tarafından sağlanmıştır</td></tr> <tr><td>Lentiviral vektör pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>Sistemi Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 & nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj soğutmalı</td><td>Eppendorf</td><td>model no. 5424 R, kat. no.5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Yüksek Hızlı Polikarbonat Yuvarlak Tabanlı Santrifüj Tüpleri&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Nöral Progenitör hücreler (NPC)</td><td></td><td></td><td>Dr. Jakub Godlewski (Brigham ve Kadınlar s Hastanesi, Boston, MA)</td></tr> <tr><td>Nörobazal Ortam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti motorlu floresan mikroskop sistemi</td><td>Nikon, Japonya</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpleri&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kapları 94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan EGF&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-temel&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA Miniprep Kiti</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termal Döngüleyici&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Görüntü Kılavuzlu Mikro Işınlayıcı&nbsp;</td><td>Xstrahal Yaşam Bilimleri, Birleşik Krallık</td><td>Çekirdek tesisi (Dana-Farber Kanser Enstitüsü, Boston, MA)</td><td></td></tr> <tr><td>Sorvall WX+ Ultrasantrifüj ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>SterilGARD biyogüvenlik kabini&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomide</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optimum kesme sıcaklığı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Lizis reaktifi</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>Amerikan Tipi Kültür Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower Lentivector İfade sistemi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Su, HPLC sınıfı</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

glioblastoma'da İşlevsel İlişkili mirna'ların ve bunların mühendisliğinin gen tedavisi İçin yapay kümelere dönüştürülmesi

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

MikroRNA'ların (miRNA'ların) sağlık ve hastalıktaki biyolojik önemi, tek bir miRNA'nın eylemi yerine aynı anda deregüle edilmiş birçok miRNA'nın belirli kombinasyonlarına dayanır. Bu özel miRNA modüllerinin karakterizasyonu, tedavide kullanımlarını en üst düzeye çıkarmada temel bir adımdır. Bu son derece alakalıdır, çünkü kombinatoryal öznitelikleri pratik olarak kullanılabilir. Burada açıklanan glioblastoma onkojenik kromatin represörlerin kontrolü ile ilgili belirli bir miRNA imza tanımlamak için bir yöntemdir. Yaklaşım ilk olarak tümörlerde normal dokuya göre deregulated olan genel bir miRNA grubunu tanımlar. Analiz, diferansiyel kültür koşullarına göre daha da rafine edilerek, belirli hücresel durumlar sırasında aynı anda ifade edilen miRNA'ların bir alt grubunun altını çizer. Son olarak, bu filtreleri karşılayan miRNA'lar, doğal olarak var olan miRNA kümelerinin genlerinin bir iskelesine dayanan ve daha sonra bu miRNA modüllerinin alıcı hücrelere aşırı ekspresyonu için kullanılan yapay bir polikistronik transgende birleştirilir.

Bu yöntem, beyin tümörlerinde sürekli olarak aşağı teregüle edilen ve özellikle nöronal farklılaşma sırasında(Şekil 1)birlikte ifade edilen ve daha sonra tümör sağkalım yanıtında yer alan üç miRNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağladı. tedavi (Şekil 2). Bu karmaşık bir onkojenik kromatin baskıcı yolu düzenleyerek gerçekleştirilir. Bu ko-ifade deseni bu üç miRNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi (<stro...

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Bu protokol ökaryotik hücrelerde birçok mikro RNA eşzamanlı modülasyonu sağlar ve moleküler klonlama adımları en aza indirgeyen çok basit ve esnek bir yönteme dayanmaktadır. Bu teknik in vitro mikro RNA fonksiyonel etkileşimlerin çalışması için etkileri vardır, ama daha da önemlisi tedavide mikro RNA daha etkili bir kullanım için bir platform sağlar. Biz esas olarak geliştirdik ve beyin kanseri bağlamında kullanılan, ancak gen ekspresyonunun birden fazla değişiklik söz konusu olan herhangi bir hastalık için geçerlidir.Yapay trans genlerimizi meme ve tiroid kanseri çizgileri gibi bu tekniğin tekrarlanabilirliğini gösteren diğer modellerde test ettik. Biyoinformatik ve mikro RNA biyolojisi temel bilgi bu protokol için yararlıdır, ancak vazgeçilmez değildir. Biyoinformatik yaklaşımı, ilgili mikro RNA kombinasyonlarını ve TRK-11'i tanımlamak için önemlidir, ancak mikro RNA işlemeye aşinalık ölçülebilir bir şekilde bu farklı mikro RNA'ların belirli hücrelere stabil hale geldiklerinde başarılı bir şekilde işlenebilen yapay DNA kümeleri halinde nasıl biraraya getirilebildiğini anlamak için önemlidir.Çanak kaplama için, ilk mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda suda poli-D-lizin eritin. 25 santimetre kare yüzeybaşına bir mililitre çözelti miktarında çözeltiyi tabağa dökün. Tüm çanak kapsama emin olmak için çanak girdap.Altı saat sonra poli-D-lizin çözeltisini aspire edin ve PBS ile iki kez durulayın. Orta hücre orta, astrositik farklılaşma orta veya nöronal farklılaşma orta ya da orta beş mililitre başına 100, 000 hücre miktarında plaka insan nöral kök hücreleri. Hücre kaplamasonra, bir hafta boyunca 37 derece santigrat ve yüzde beş karbondioksit bir kuvöz de çanak yerleştirin ve el yazmasına göre mikro RNA ifade analizi gerçekleştirmek için devam edin.Kültür IÇIN GBM-34 glioblastoma kök benzeri hücreler, bir kez on beşinci hücreler ve nörobazal orta beş mililitre ile 25 santimetre kare düşük eki şişe başlar. Şişeyi 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte bir kuvöze yerleştirin. Kaplamadan 48 saat sonra, her yedi günde bir DNA alkilleyici ajan temozolomid konsantrasyonlarını iki katına ekleyin.Beş gün boyunca beş mililitre orta takviye beş mikromolar TMZ eklenmesi ile başlayın. Beş gün sonra, orta kaldırmak ve temozolomide olmadan taze orta ile kalan hücrelerin kurtarmak için izin vermek için değiştirin. 48 saat sonra, başka bir beş gün için 10 mikromolar temozolomide ve kuluçka ekleyin.En az 100 mikromolar konsantrasyonu ulaşılana ve hücreler ilaca dirençli hale gelene kadar katlama temozolomid tedavisini tekrarlayın. Direnç indüksiyonundan sonra, 1 mililitre Lysis reaktifi kullanarak yalan hücreleri. Toplam RNA ayıklayın ve el yazmasına göre spesifik mikro RNA'ların ekspresyonunu analiz edin.Daha önce tanımlanan her mikro RNA'nın öngörülen targetome'sini elde etmek için mikro RNA hedefleme tahmin araçlarını kullanın. TargetScan'ın ön sayfasından, önceden doldurulmuş açılır menüden ilgi çeken mikro RNA'yı seçin. Gönder düğmesini tıklatın.İndirme tablosu bağlantısını kullanarak ortaya çıkan hedef listesini elektronik tablo olarak indirin. Yanlış pozitif tahmin olasılığını azaltmak için, yalnızca korunan siteler sütunu ve akış aşağı analizi içindeki hedefleri içerir. Ek mikro RNA tahmin programları daha fazla sıkılık elde ve sadece tüm algoritmalar için ortak hedefleri içerir.Sonra, ToppGene 20'yi aç. Her mikro RNA'da ortak olan yolların zenginleşmesini değerlendirmek için, eğitim gen kümeleri penceresinde elde edilen hedeflerin listesini yapıştırın. Giriş türü olarak HGNC Sembolü'ne tıklayın.Gönder ve başlat'ı tıklatın. Program genlerin girilen listesi için en önemli GO kategorilerini gösteren bir çıktı tablosu sağlar. Sonunda ortak bir yol veya hücresel sürecin düzenlenmesi için her mikro RNA katkısını kurmak için, Biyoinformatik ve Evrimsel Genomik web sitesinde sağlanan venn-diyagram fonksiyonu açın.Elde edilen her targetome'yi belirli hücresel süreçte yer alan genlerin tam listesine karşı kontrol edin. İlgi çeken her mikro RNA'lar için hedef haberci RNA'ları ilgili pencerelerdeyse, listeyi kopyala-yapıştır'ı yükleyin. Her listeyi benzersiz bir tanımlayıcıyla adlandırın.Gönder'i tıklatın. Program her sektörde genlerin numaraları ile bir venn-diyagram görsel bir çıkış yanı sıra her alt küme ve kesişim kombinasyonları için haberci RNA tam bir listesini sağlar. Seçilen mikro RNA'ları fonksiyonel trans gende gruplandırmak için miR-17-92 küme lokusu temel alınarak transgenik bir iskele elde edin.Topluluklu genom tarayıcısından nükleotit dizisini edinin. Lokusun altı kodlanmış mikro RNA saç tokasını ve çekirdek dizisinin hem akıntıya hem de aşağı akışına kadar en az 200 nükleotit yan dizisini kapsayan yaklaşık 800 baz çifti çekirdek dizisini seçin. Sırayı herhangi bir sözcük düzenleme programına yapıştırın.MiR tabanında nisasında alarak altı doğal saç piminin her birinin dizisini tanımlayın. Bu dizilerin her birini daha önce tanımlanmış çekirdek dizisinin açıklığı içinde işaretleyin. Her saç tokası arasındaki tüm diziler spacer dizilerini temsil eder.Daha sonra, miR tabanından trans genifade edilmesi amaçlanan mikro RNA'ların saç tokası dizilerini elde edin. Mikro işlemci bölünmesi nin olduğu yerlerdeki spesifik nükleotitleri dikkatlice not edin. Yeni saç tokaları için bir kabul olarak hizmet edecek her saç tokası hem beş ve thee biter üç ila beş nükleotitler hariç çekirdek dizisinden yerli saç tokası dizileri silin.Daha önce silinmiş saç tokaları yerine istenilen mikro RNA'ların saç tokası dizilerini yapıştırın. Trans geninin her iki yan bölgesine de istenilen kısıtlama dizilerini ekleyerek alt klonlamayı tercih edilen teslim vektörlerine ekleyin. Seçilen kısıtlama dizilerinin dizinin içinde bulunmadığını doğrulayın.Trans genin iki boyutlu yapısını doğrulamak için, tam transgenik sırayı RNA yapı tahmin yazılımı programı RNA Webfold'a kopyalayın. Standart program ayarlarını seçin ve devam et'i tıklatın. Özellikle mikro işlemci dekolte sit alanına en az 11 nükleotit proksimal olan çift telli kök yapılarının varlığında iyi tanımlanmış saç tokalarının varlığı için grafik çıktısını analiz edin.Ayrıca, saç tokası dizileri içinde dallanma noktalarının yokluğu na bakın. Bu noktada trans gen gen sentezi ile üretilmeye ve istenilen iletim vektörlerine klonlenmeye hazırdır. Bu yöntem, nöronal farklılaşma sırasında özellikle ifade edilen beyin tümörlerinde sürekli olarak düzenlenmiş olan üç mikro RNA'dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağlamıştır.Genotoksik stres sırasında mikro RNA modüllerinin ko-ekspresyon desenleri doğrulandı ve bu üç mikro RNA arasında güçlü bir sinerjik aktivite önerdi. Tasarlanan trans gen aynı anda glioblastoma hücrelerinde üç mikro RNA ekspresyonunu özetleyebilir, hem in vitro hem de in vivo, tümör biyolojisinde önemli bir girişim ve çevirisel uygulanabilirlik vaat edilir. Ayrıca, transgenik küme de bir meme kanseri modelinde fonksiyonel oldu.Bu protokolün en önemli gereksinimleri trans gendeki işlemci dekoltesinin orijinal boyutunu korumaktır. Ve şimerik mikro RNA saç tokalarının kök döngü yapısının korunduğundan emin olun. Bu yöntemle, birden fazla biyolojik olarak aktif mikro RNA genini çok kısa DNA dizilerine yoğunlaştırabiliriz ve bu da gen terapisi için herhangi bir doğum vektörlerine tam anlamıyla vitrrol takılabilir.Bu yöntem, farklı mikro RNA'lar arasındaki fonksiyonel etkileşimi incelemek ve aksi takdirde birden fazla ilaç kombinasyonu gerektirecek karmaşık multifaktöriyel hücresel yolları müdahale etmek için idealdir.

characterization-functionally-associated-mirnas-glioblastoma-their

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak yeni glioblastomları (GBM) indüklemek, izlemek ve analiz etmek için verimli ve çok yönlü bir protokolü açıklıyoruz. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histo-patolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma&#39;nın Roman modelleri oluşturmak için

MicroRNA'lar beyinde çok önemli roller oynar ve nöro-dejenerasyonu modellemek için potansiyel hedeflerdir. Bununla birlikte, miRNA'nın kısa uzunluğu ve beyin dokusunun erişilememesi nedeniyle miRNA seviyelerini bozmak zordur. Bu video, farelerde bir nöropeptit kullanarak antagomir tasarımı ve beyne özgü uygulama için bir yöntem sunmaktadır.

MiRNA Beyin Özgül demonte için Stereotaktik Injection Basit Alternatif

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

miRNA tedavi kanser ilerleme düzenlenmesinde önemli potansiyele sahip. Aşağıda gösterildiği analitik yaklaşımlar hücre döngüsü ve anjiogenezi durdurma içinde bir birleşimsel miRNA tedavi faaliyetinin tanımlaması için kullanılır.

Kombinatorik miRNA düzenleyen hücre döngüsü ve anjiogenezi tedavilere analizi

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Proteomik disregülasyon, yaygın olarak infiltre eden gliomların yayılmasında önemli bir rol oynar, ancak birkaç ilgili protein tanımlanmamıştır. Dijital mekansal işleme (DSP), infiltratif gliomların invazyonu ve göçüne katkıda bulunabilecek aday proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu karakterize etmek için verimli, yüksek verimli bir yaklaşım sunar.

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

Kan-beyin bariyeri, tedavisi olmayan bir hastalık olan glioblastoma için tedavilerin uygulanmasında önemli bir engeldir. Burada, boyut nedeniyle bu fizyolojik bariyeri atlayabilen ve tümör içinde birikebilen in vivo görüntü kılavuzluğunda demir oksit terapötik nano bir platform sunuyoruz.

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Keşfedin, yapay DNA kümeleri oluşturarak glioblastoma hücrelerinde birden fazla miRNA'yı aynı anda modüle etme yöntemini. Bu hesaplamalı biyoinformatik protokol, gen tedavisi uygulamaları için esnek bir platform sunar.

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Daha fazla video keşfet