Kollajen Kaynaklı Artrit Modelinde Doku İltihabının Moleküler Yollarını Değerlendirmek Için Fare Patilerinin İşlenmesi için Kriyo-pulverizasyon Protokolü

Lokal dokularda moleküler profillerin değerlendirilmesi, hastalıkla ilgili preklinik modellerde değerlendirilen aktif ilaçların etki mekanizmasını anlamak için kritik bir adımdır. Artrit araştırma alanında, ilgi yerel doku ortamı kemik karmaşık bir karışımı oluşur küçük ağırlık taşıyan eklemler, kıkırdak, kas, ve bağışıklık hücreleri. Burada kriyojenik kontrollü bir ortamda bu karmaşık doku ortamının mekanik bozulması ve/veya pulverizasyonu için güvenilir ve sağlam bir yöntem tanımlıyoruz.

Bu yöntem daha sonra tek bir tek tip örnek kaynaktan hastalığın moleküler imzaları oluşturmak için aşağı proteomik ve transkripsiyonel profil oluşturma çabaları oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntem diğer birçok eski tekniklerin aksine homojen bir toz oluşturur. Ayrıca, eski sıcaklık yalıtım prosedürü yüksek kaliteli RNA izolasyon sağlar.

Bu yöntem daha sonra ilgili hastalık yollarının moleküler karakterizasyonu sağlayan downstream proteomik ve transkripsiyonel profil oluşturma için kullanılabilir. Bu yöntem dokulardan moleküler imza elde eden herhangi bir araştırma alanına anlayışlar sağlayabilir. Bu yöntem, yoğun ve bileşenleri ayırması zor olan karmaşık doku sistemine genişletilebilir.

Bu noktaya kadar değerlendirmemiş olsak da, kulak veya kemik gibi yoğun kıkırdak dokularına potansiyel uygulama görebiliriz. Tozutartım için tüplere aktarmanın zaman açısından kritik doğası pratik gerektiren bir şeydir. Çok fazla zaman alınırsa, toz çözülmeye başlar ve amorf olur.

İşlemi rahat edene kadar örnek sayısını 10 ile 15 arasında sınırlamak önemlidir. Doku işleme gününde, en az 10 dakika boyunca kuru buz üzerinde gerekli tüm aletleri önceden soğutun. Aşırı soğuktan zarar görmemek için termal eldiven giyin.

Daha sonra, hazırlanan fare pençesinin her birini ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen sıvı nitrojende dondurun. Donmuş pençeleri 80 santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, sıvı nitrojen ile bir dondurucu değirmen doldurun ve en az 10 dakika boyunca denge sağlar.

İşlenmemiş numuneyi kuru buzüzerine yerleştirin ve donma/çözülme döngülerini önlemek için orada tutun. Sonra bir alt çelik fiş ile önceden soğutulmuş büyük polikarbonat taşlama şişe içine bir arka pençe aktarın. Önceden soğutulmuş çelik darbeciyi takın ve polikarbonat öğütme şişesini önceden soğutulmuş üst çelik fiş ile kapatın.

Numuneler ile birlikte büyük polikarbonat öğütme şişelerini önceden doldurulmuş dondurucu değirmenine aktarın ve kapağı enstrümanın önünde bulunan kauçuk tokayla kapatın. Numuneler bir dakika sıvı nitrojen içinde soğumaya bırakın. Daha sonra, dondurucu değirmenini saniyede 10 döngü ile bir dakikalık programa ayarlayın.

Çalıştır düğmesine basın ve dondurucu değirmeninin döngüsünü tamamlamasını bekleyin. Bundan sonra, dondurucu değirmenkapağını açın ve büyük polikarbonat taşlama şişesini çıkarın. Taşlama şişesini bir çıkarıcıya yerleştirin ve çelik fiş polikarbonat tüpten kayana kadar siyah sapa aşağı doğru basınç koyarak üst çelik fişi çıkarın.

Açılan taşlama şişesini kuru buzüzerine aktarın ve çelik darbeciyi çıkarmak için önceden soğutulmuş çalgıları kullanın. Dondurulmuş tozu önceden soğutulmuş 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. RNA ekstraksiyonu için 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 30 ila 50 miligram ve protein ekstraksiyonu için 100 ila 200 miligram arasında tartın.

Toz haline getirilmiş numuneleri negatif 80 santigrat derecede saklayın ve 24 saat içinde RNA ve protein izolasyonlarına ilerleyin. İlk olarak, RLT tampon her mililitre için beta-mercaptoethanol 10 mikrolitre ekleyin. Doku miligramı başına 23,3 mililitrelik bir orana karşılık gelen RLT tampon hacmini hesaplayın ve dondurulmuş toz ile tüpe beta-merkaptoetanol ile UYGUN RLT tampon hacmini ekleyin.

10 saniye boyunca 3, 000 RPM'de numuneyi girdaplayın. Bir mililitrelik pipetter kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı inip, numuneyi 20 saniye boyunca 3.000 RPM'de tekrar girdaplayın. Santrifüj 13, 000 kez iki dakika için g ve yeni bir tüp için supernatant 700 mikrolitre aktarın.

Bu tüpe 700 mikrolitre etanol ekleyin ve numunenin 700 mikrolitresini bir RNA arıtma sütununa yükleyin. Tüpü en az 10,000 kez g hızda 30 saniye santrifüj edin. Akış boyunca atın ve rneasy sütun üzerine numunenin kalan kısmını yükleyin ve 30 saniye boyunca en az 10,000 kez g hızda tekrar tüp santrifüj.

Akış tan atın ve 700 mikrolitre RW1 tamponu ekleyerek ve en az 10, 000 kez g hızını 30 saniye boyunca santrifüj ederek kolonu yıkayın. DNAse sindirim seçeneği gerçekleştirilmesi durumunda, DNAse tedavisinden önce 350 mikrolitre RW1 eklenir. Ve DNAse tedavisinden sonra, rw1 ek bir 350 mikrolitre eklenir.

Daha sonra en az 10,000 kez g hızında 500 mikrolitre RPE tampon ve santrifüj ekleyerek sütunu iki kez yıkayın ve her seferinde akışı atmasını önleyin. Bundan sonra, iki dakika boyunca en az 10,000 kez g hızda santrifüj ederek sütun kuru. RNA'yı 50 mikrolitre su ekleyerek ve en az 10,000 kez g hızında iki dakika santrifüj ederek eute.

Akış toplamak ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüp aktarın. Daha fazla analiz den önce araştırmacının seçim yöntemini kullanarak RNA miktarını belirleyin ve negatif 80 santigrat derecede depolayın. Hücre kültürü sınıf su ile 1X hücre lisis stok çözeltisi 1X hücre lisis stok çözeltisi seyreltin.

100X proteaz inhibitör stok yapmak için su bir mililitre ile proteaz inhibitör kokteyl seti yeniden. 1X son stok çözeltisi elde etmek için 1X hücreli lysis tampon9.9 mililitre proteaz inhibitörü 100 mililitre ekleyin. Doku tozu her miligram için buz gibi hücre lisis tampon dört mikrolitre ekleyin ve tüp için bir beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin.

Tüpü 3,000 RPM'de 60 saniye boyunca girdaplayın. Tüpü ıslak buza aktarın ve bir sonraki örneğe devam edin. Ayrıca, araştırmacılar kutudikey yerleştirerek boncuk ile daha iyi karıştırma kolaylaştırabilir bulabilirsiniz.

Bir saat sonra tüpleri 10,000 kez g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin. Üst teki yağ tabakasından kaçınmak için süpernatantları taze bir tüpe aktarın. Toplam protein konsantrasyonu belirleyin.

Aliquot her örnek 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine ve negatif 80 santigrat derece daha fazla analiz gerçekleştirmek için hazır olana kadar saklayın. Bu çalışmada, dokulardan çıkarılan RNA veya proteinin verimini ve kalitesini artırmak ve inflamatuar yanıtlarla ilişkili moleküler profillerin analizini sağlamak için rinpatilerin işlenmesi nde kriyojenik pulverizasyon yöntemi kullanılmıştır. Temsili bir jel görüntü görselleştirme CIA farelerin ön pençeleri çıkarılan RNA gösterir.

28S rRNA ve 18S rRNA bantları tüm örneklerin yeterli miktarda sağlam RNA'ya sahip olduğunu gösterir. Protein BCA analizine dayalı toplam protein konsantrasyonlarının temsili dağılım konusu burada gösterilmiştir. Çeşitli tedaviler altında naif fareler, CIA fareler veya CIA fareler toplam protein konsantrasyonları gruplar arasında karşılaştırılabilir.

Luminex analizleri daha sonra protein ekstresindeki inflamatuar sitokin ve kemokin konsantrasyonlarını belirlemek için yapılır. Normalleştirilmiş sitokin ve kemokin konsantrasyonlarının temsili bir dağılım arsa naif fareler ile karşılaştırıldığında, birkaç sitokinler CIA farelerde yüksek ve anti-IL17A antikor ile tedavi önemli ölçüde çeşitli sitokinlerin üretimini inhibe ortaya koymaktadır. CIA'deki transkripsiyon değişikliklerini ve tedaviye bağlı etkileri değerlendirmek için mikrodizi analizi yapılır.

Burada, CIA farelerinde saf farelere kıyasla önemli ölçüde artmış genlerin temsili bir ısı haritası çizimi gösterilmiştir. Bu işlemi gerçekleştirirken, araştırmacıların tüp ve tozun kuru buzdan uzak tutulduğu süreyi en aza indirmeleri çok önemlidir. Bu, tozun erimesini ve bozulmuş RNA ve proteine karşı sonraki sorunları önlemeye yardımcı olur.

Bu teknik tarafından üretilen moleküler imzaların yüksek kalitesi araştırmacıların bir terapötik verecek benzersiz profili sorgulamak için izin verir ve daha artritik koşulları tedavi etmek için kullanılabilecek mekanizmaların farklılaşması için izin verir. Bu teknik daha fazla ilgi bu dokularda moleküler imzaları değerlendirmek için kulak ve kemik gibi yoğun dokuların bir dizi ayıklamak için kullanılabilir. Tedavinin hastalığın moleküler izlerini nasıl modüle ettiğini anlamak, hangi özel sinyal yollarının modüle edilir olduğunu daha iyi değerlendirmemizi sağlar.

Ve belki de daha da önemlisi, hangi yollar değerlendirilmekte olan terapötik mekanizma ile düzenlenir değildir. Sıvı nitrojen ve kuru buz ile çalışırken, uygun derecelendirilmiş eldiven ler ve yüz kalkanları da dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanmak zorunludur. Birkaç saniyeden fazla cilt maruz kalma ciddi yanıklara neden olabilir.

Kuru buz büyük miktarlarda çalışırken, kuru buz karbondioksit bültenleri gibi iyi havalandırılan bir alanda çalışmak önemlidir.