Name: Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Öğrenin, hematopoetik kök atası hücrelerinin mitokondriyal solunum ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntemi. Bu protokol, fare kemik iliğinden yüksek verimli izolasyon sağlar ve hücre canlılığını artırarak metabolik düzenlemeyi incelemenize olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL131645, CA016058), St. Baldrick Vakfı ve Pelotonia Vakfı'nın finansman desteği ile desteklenmiştir.

Bu protokol Nationwide Çocuk Hastanesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokol, iki günlük bir süreye yayılan kronolojik sırada açıklanmıştır. Aşağıdaki protokolde açıklandığı gibi taze reaktifler kullanın.
1. Tsanın Dan Önceki Gün Reaktiflerin Hazırlanması
<ol><li>
Sensör kartuşu nemlendirin.
	<ol>
<li>Bir gecede CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesinde 5 mL kalibran(Malzeme Tablosu)inkübat.</li>
		<li>Akı çıkış kitini(Malzeme Tablosu)açın ve sensör kartuşunu (yeşil; üst) yardımcı plakadan (saydam; alt) ayırın. Ardından, sensör kartuşu baş aşağı ve yardımcı plakaya bitişik yerleştirin.</li>
		<li>Steril su kullanarak, yardımcı plaka (200 μL) kuyularını ve kuyuların etrafındaki odaları (400°L) doldurun.</li>
		<li>Sensör kartuşu, sensörlerin tamamen suyla kaplı olduğundan emin olmak için yardımcı plakaya batırın. Kabarcıkların oluşumunu önlemek için 3x dokunun.</li>
		<li>Kartuşun yardımcı plakaya batırılmış bir gece boyunca CO2 37 °C olmayan bir kuluçka makinesine yerleştirin. Suyun buharlaşmasını önlemek için, kuvözün düzgün bir şekilde nemlendirildidiğinden emin olun. Özellikle normal bir fırın kullanıyorsanız, kartuş yardımcı plakasının yanına ekstra bir önlem olarak H2O içeren açık bir kabı yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir ataşme plakasını hazırlayın.
	<ol>
<li>%70 etanol kullanarak biyogüvenlik kabini sınıf 2 yüzeyini sterilize edin. Kaputun altındaki istinat plakasını açın.</li>
		<li>Kaputun altındaki istin plakasının her kuyusuna %0,01 (w/v) poli-L-l-lizin (PLL) çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Kitte belirtilen kapak ile ele ataşma plakası. Kapatılan sayisplakayı oda sıcaklığında (RT) kaputun altinda 1 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Kuluçka nın amacı, askı hücrelerinin asaplakasının yüzeyine yapışmasını kolaylaştırmak için PLL'nin ar-sonuç plakasının yüzeyini kaplamasına izin vermektir.</li>
		<li>1 saat inkübasyon sonra, steril vakum tabanlı aspiratör ile aşırı çözelti kaldırmak ve hava kaputun altında iyi kuru. NOT: Aspiratör kullanılarak aşırı PLL çıkarılmasını takiben, ar-saymanın kuyularını havayla kurutmak ~30−60 dakika sürer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tasniye Günü
<ol><li>Kartuşunu hazırlayın.
	<ol>
<li>Sensör kartuşu kaldır. Doku kültürü başlık baş aşağı yerleştirin ve yardımcı plaka su atın.</li>
		<li>Yardımcı plaka kuyularını önceden ısıtılmış kalibran 200 μL ile doldurun.</li>
		<li>Kuyuların etrafındaki odaları 400 μL kalibr ile doldurun.</li>
		<li>Sensör kartuşu servis plakasına batırın, sensörlerin tamamen kalikan tarafından kaplandığından emin olun. Kabarcıkların oluşumunu önlemek için 3x dokunun.</li>
		<li>Sensör kartuşu, yardımcı plakaya batırılmış, CO2 37 °C olmayan bir kuluçka makinesinde 45−60 dakika boyunca dengeleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hasat murine kemik iliği kaynaklı LSK HSKCs.
	<ol>
<li>Yeterli biyolojik kopyaları karşılamak için, bir fareden elde edilen HSPC'leri, bir fareden elde edilen gazlı plakanın her yerine kullanmayı planlayın. NOT: Bu kemik iliği hasat yöntemi her fareden ~50.000−80.000 LSK HSK sağlar. Hücre dışı akı ölçmek için bu protokol 96 iyi plaka iyi kuyu başına ~ 70.000 LSK HSPCs için optimize edin.</li>
		<li>Yerel IACUC onaylı yöntemleri izleyerek CO2 aşırı doz ve servikal çıkış kullanarak fareleri ötenazi.</li>
		<li>% 70 etanol kullanarak diseksiyon araçları ve tezgah yüzeyini sterilize.</li>
		<li>Her fare için, rt de% 2 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) içeren 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile önceden bir Petri kabı doldurun. NOT: Aşağıdaki adımlarda kümeler oluşturacağı için önceden soğutulmuş PBS kullanmayın.</li>
		<li>Tüm ötenazili fareye %70 etanol (v/v) püskürtün. Üst ve alt ekstremiteler, kalça kemikleri, göğüs kafesi, göğüs kafesi ve omurga dahil olmak üzere tüm kemikleri izole, fare17,18. LSK hücrelerini kirletebildiği için farenin omuriliğindeki beyaz maddeyi çıkarın. Tüm kemikleri 1x PBS'ye (+ %2 FBS) yerleştirin, toplandığı gibi, daha fazla kullanıma kadar bir Petri kabına koyun.</li>
		<li>50 mL konik bir tüpü ters çevirin (her seferinde yeni) ve Petri kabında 1x PBS'ye (+ %2 FBS) batırılmış kemikleri triturate etmek için kullanın.</li>
		<li>Kemikleri ezdikten sonra 10 mL serolojik pipet kullanarak, kemikleri eşit şekilde dışarı atmak için yukarı ve aşağı pipet (~10x).</li>
		<li>50 mL konik bir tüp üzerine 40 m hücreli süzgeç yerleştirin. 1 mL 1x PBS (+ %2 FBS) geçirerek süzgeç yüzeyini önceden ısla.</li>
		<li>Hasat kemik iliği türetilmiş hücre süspansiyon adım 2.2.7 ve kemik enkaz kaldırmak için hücre süzgeç önceden ıslak yüzeyinden geçmek.</li>
		<li>Tüm kemik malzemeleri 50 mL konik tüpte kemik iliği hücrelerinin çoğunun toplandığı bir belirteç olarak beyaza dönüşene kadar 2.2.6'dan 2.2.9'a kadar adımları tekrarlayın. NOT: Genellikle tüm kemik iliği kaynaklı hücreleri toplamak için fare başına iki 50 mL konik tüpler alır.</li>
		<li>5 dk 500 x g ve RT için kemik iliği türetilmiş hücreleri içeren santrifüj 50 mL konik tüpler.</li>
		<li>Supernatant çıkarın. Kemik iliği türemiş hücreleri (her iki 50 mL tüpün içeriğini birleştirin) 5 mL 1x PBS (+ %2 FBS) son hacim olarak askıya alın ve hücreleri RT'de tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Hasat mononükleli murine kemik iliği hücreleri.
	<ol>
<li>15 mL konik tüpe 5 mL yoğunluk gradyan ortamı (yani Ficoll) ekleyin. Sonra yavaş yavaş kemik iliği hücre süspansiyon 5 mL ekleyin. Hücrelerin yoğunluk degrade ortamının üzerinde bir katman olarak kaldığından emin olun.</li>
		<li>500 x g ve RT 30 dk için santrifüj. Santrifüjde fren kullanmayın. Santrifüjün mümkün olan en düşük ivmede olduğundan emin olun (örn. 1 hızlanma ve 0 yavaşlama).</li>
		<li>Yeni bir 15 mL konik tüp içine santrifüj aşağıdaki mononükleli hücrelerin orta arayüzü (beyaz renk) hasat.</li>
		<li>5 mL 1x PBS (+ %2 FBS) ile yoğunluk gradyan ortamdan alınan hücreleri yıkayın. 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj. Supernatant çıkarın.</li>
		<li>Adımı tekrarlayın 2.3.4.</li>
		<li>Tüpün hücre içeriğini 300 μL 1x PBS 'de (+ %2 FBS) yeniden askıya alın. Aliquot 10 μL hücre süspansiyonu ile facs tüpünde lekesiz veya tek renk kontrolü için.</li>
	</ol></li>
	<li>Mononükleli murin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri hasat edin.
	<ol>
<li>Aşağıdaki antikorların numunesi başına 3 μL karıştırılarak biotin-antikorkokteyli yapın: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. 300 μL mononükleli kemik iliği hücrelerine 15 μL biotin-antikor kokteyli ekleyin. NOT: Her antikor 1:100 seyreltme kullanılır.</li>
		<li>Tüpün alt kısmında hücrelerin kümelenmesini önlemek için 4 °C'de 30 dakika boyunca biotin-antikor kokteyli ile inkübe hücreleri ajitasyon ile.</li>
		<li>Biotin-antikor kokteyli ile karıştırılmış hücrelere önceden soğutulmuş 1x PBS (+ %2 FBS) 10 mL ekleyin.</li>
		<li>Tüpü 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant atın ve 1x PBS (+ 2% FBS) 400 μL hücre pelet resuspend. Streptavidin-tek renk kontrolü için Aliquot 10 μL.</li>
		<li>Kısaca girdap anti-biotin mikroboncuklar(Tablo Malzemeler)kullanmadan önce. Her hücre örneğine (400 μL) 80 μL mikroboncuk ekleyin. Iyice karıştırın ve 4 °C'de ek 20 dakika, ajitasyon ile kuluçka.</li>
		<li>Hücrelere önceden soğutulmuş 1x PBS (+ %2 FBS) 10 mL ekleyin. Tüpü 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.</li>
		<li>Supernatant atın ve 1 mL 1x PBS (+ 2% FBS) hücre pelet resuspend. Manyetik ayırma ünitesi kurarken 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>4 °C'de manyetik destekli hücre sıralama (MACS) ayırıcısının manyetik alanına bir sütun(Malzeme Tablosu)yerleştirin. 4 °C'deki yerçekimi akışı altında 3 mL 1x PBS (+ %2 FBS) ile durulayarak kolonu manyetik ayırmaya hazırlayın.</li>
		<li>2.4.7 adımdaki hücre süspansiyonuna 4 °C'deki ıslak öncesi kolona ekleyin. Hücrelerin 4 °C'de sütundan geçmesine ve 15 mL konik tüpte atık toplamasına izin verin. NOT: Bu tür atık taslanmamış hücrelere sahip fraksiyon, zenginleştirilmiş soy negatif hücreleri temsil eder.</li>
		<li>4 °C'de 3 mL 1x PBS (+ %2 FBS) ile yıkama sütunu. 3x'i tekrarlayın. Akış tantana sını toplayın ve 4 °C'de tutun. Bir hemositometre kullanarak trypan mavi dışlama tarafından eluted canlı hücreleri saymak.</li>
		<li>500 x g ve 4 °C'de 5 dk boyunca akış içeren 15 mL konik tüpü santrifüj edin. Supernatant atın. Hücreleri 0,5 mL 1x PBS (+ %2 FBS) olarak yeniden askıya alın ve içindekileri bir FACS tüpüne aktarın.</li>
		<li>Add 24 μL of the LSK antibody cocktail to each 107 cells. Antikor kokteyli 450-streptavidin antikor eşit konsantrasyon, PE-CY7-Sca1 antikor ve APC-c-Kit antikor içerir.</li>
		<li>4 °C'de 1 saat boyunca karanlık altında ajitasyon ile (folyo ile kaplı) kuluçka.</li>
		<li>FACS tüpüne 3 mL 1x PBS (%+ 2 FBS) ekleyin. 500 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj. Supernatant atın.</li>
		<li>1 mL 1x PBS (+ 2% FBS) antikor etiketli hücreleri resuspend. Sıralamadan hemen önce hücre süspansiyonuna 1 mg/mL propidium iyodür ekleyin.</li>
		<li>LSK hücrelerini sıralamadan hemen önce 40 μm'lik bir süzgeç kullanarak FACS tüpünün içeriğini filtreleyin.</li>
		<li>LSK hücrelerini, FACS sıralama yoluyla, 2 mM glutamin, 3 mg/mL glukoz, 1 mM piropoietin (TPO), 1x kök hücre faktörü (SCF), 0,5x penisilin/streptomisin (P/S), pH 7.4Tabloile desteklenen 0,5 mL tam ortam içeren 1,5 mL tüp içine toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LSK HSPC'lerin Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tahlilleri
<ol><li>
Istina plakasında LSK tohumlama
	<ol>
<li>500 x g ve RT 5 dakika için adım 2.4.17 gelen Centrifuge LSK hücreleri.</li>
		<li>Hücreleri tam ortamda en az 70.000 hücre/40 μL'lik son konsantrasyona geri alın.</li>
		<li>Adım 1.2.4'ten itibaren PLL kaplı 8 kuyulu plakada 40 μL medianın (70.000 hücre içeren) tohum içeriği. Tüm köşe kuyularını boş bırakın.</li>
		<li>450 x g ve RT 1 dakika santrifüj. Freni uygulamayın. Hücrelerin ters mikroskobu kullanarak kuyunun dibine bağlı olduğundan emin olun.</li>
		<li>175 μL'lik son bir hacim için her kuyudaki hücrelere 135°L tam ortam ekleyin.</li>
		<li>CO2 olmayan inkübatördeki hücreleri 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Tablo 2 (mitokondriyal stres testi) ve Tablo 3'te (glikoliz stres testi) açıklanan bir metrik kullanarak analizördeki kuyu plakasının her kuyusuna ilaç eklemek için bir program ayarlayın. NOT: Hücreler kuluçkaya yatarken aleti açın ve 37 °C'de olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitokondriyal stres testi
	<ol>
<li>Oligomisin 45 μM stok çözeltisi, 50 μM karbonil siyanür 4-(trifluromethoxy)fenilhidrat (FCCP) ve rotenon/antimisin A 25 μM stok çözeltisi hazırlayın. 45 μM oligomisin stok çözeltisi hazırlamak için, tam ortam 280 μL'de ticari olarak kullanılabilen kesenin içeriğini çözün. 50 μM FCCP stok çözeltisi hazırlamak için, ticari olarak kullanılabilen kesenin içeriğini tam ortamın 288 μL'sinde çözün. 25 μM rotenone/antimycin A stok çözeltisi hazırlamak için, tam ortam 216 μL'de ticari olarak kullanılabilen kesenin içeriğini çözün.</li>
		<li>Program plakasındaki sensör kartuşunu kuvözden alın ve bağlantı noktalarını (A, B ve C) her kuyuda 2 μM oligomisin, 1,5 μM FCCP ve 0,5 μM rotenone/antimycin A konsantrasyonuna sahip olacak şekilde, Tablo 4'te açıklanan seyreltme ölçümlerini (oksijen tüketim hızı için) takip ederek yükleyin.</li>
		<li>Kapağı, yardımcı plakada monte edilen sensör kartuşundan çıkarın ve alet tepsisinin üzerine yerleştirin. 20 dakika sürecek kalibrasyonu başlatın.</li>
		<li>Kalibrasyondan sonra, yardımcı plakayı çıkarın ve şimdi kuyunun dibine yapıştırılan LSK hücreleri içeren bir adak plakası ile değiştirin.</li>
		<li>Tablo 2'deaçıklanan programı başlatmak için Continue tuşuna basın. Programın tamamlanmasından sonra, verileri almak ve Dalga Masaüstü yazılımı kullanarak bunları analiz. NOT: Hücre dışı akı testlerinden oluşturulan veriler Wave Desktop yazılımındaki nokta çizimi kullanılarak çizilebilir veya web tabanlı istatistik programına aktarılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glikoliz stres testi
	<ol>
<li>300 μL (100 mM), oligomisin 288 μL (50 μM), 2-D glukoz (2-DG) 300 μL (500 mM) tam ortam içinde ticari olarak kullanılabilir kese glukoz yeniden oluşturma.</li>
		<li>Yavaşça pipet yukarı ve aşağı (~ 10x) bileşikleri solubilize etmek. Girdap 2-DG yaklaşık 1 dk için medya içine uygun çözünme sağlamak için.</li>
		<li>Sensör kartuşu kuvözden çıkarın. 10 mM glikoz, 2 μM oligomisin ve 50 mM 2-DG son konsantrasyonu elde etmek için Tablo 5'te açıklanan seyreltme ölçümlerini takiben A ile C arasındaki yük bağlantı noktaları.</li>
		<li>3.2.3 ve 3.2.4 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>Tablo 3'teaçıklanan programı başlatmak için Continue tuşuna basın. Programın tamamlanmasından sonra, verileri almak ve Dalga Masaüstü yazılımı kullanarak bunları analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, maksimum miktarda saf ve uygun murine LSK HSPC popülasyonunun izolasyonunu ve glikoliz ve mitokondriyal solunumölçümlerini hücre dışı akı analizörü ile gösteriyoruz. Özellikle, protokol LSK HSPCs kullanımı için aşağıdaki teknik sorunları aşar : i) mürin kemik iliği LSK HSPCs düşük frekanslı14, ii) LSK HSPCs düşük bazal metabolik aktivite26, iii) LSK HSPCs27kırılganlığı , ve iv) LSK HSPCs eksikliği1kültür . Buna ek olar...

En olgun kan hücrelerinin ömrü kısa olduğundan, kan homeostazı kendini yenileme ve hematopoetik kök hücrelerin uzun ömürlü ama nadir popülasyonun farklılaşması dayanır (HSPCs)1. HSPCs quiescent, ancak çoğalmak için hızlı ve kan sisteminin taleplerini sürdürmek için uyarılma üzerine farklılaşma uğrar. Her HSPC hücresel devlet benzersiz bir biyoenerjik talep gerektirir gibi, metabolik değişiklikler HSPC kader kararlarının önemli sürücüleri vardır. Bu nedenle, metabolik plastisite kaybı, quiescence arasındaki dengeyi değiştirerek, kendini yenileme, ve HSPCs farklılaşması, genellikle miyelo yol açar- veya lenfo-proliferatif bozukluklar. Birlikte, HSPC gelişiminin metabolik regülasyon anlayışı hematolojik maligniteler2,3,4,5altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Mitokondriyal solunum ve glikoliz hücre içi reaksiyonları yönlendirmek ve makromolekül sentezi için gerekli yapı taşlarını üretmek için ATP üretir. HSPC'ler farklılaşmışhücreler6 ile karşılaştırıldığında düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğundan ve hipoksik kemik iliği nişlerinde quiescence sürdürmek, HSPCs öncelikle glikoliz güveniyor. HSPCs aktivasyonu quiescence kaybı ve hücre döngüsüne sonraki giriş yol açan onların mitokondriyal metabolizmageliştirir. HSPCs bu tür metabolik plastisite yetişkinyaşam6,7,8,9,10,11,12boyunca HSPC havuzunun bakım sağlar. Bu nedenle, HSPC aktivasyonunu ve sağlık durumunu analiz etmek için oksijen tüketim hızı (OCR; oksidatif fosforilasyon indeksi) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR; glikoliz indeksi) gibi metabolik aktivitelerinin araştırılması önemlidir. Hem OCR hem de ECAR, hücre dışı akı analizörü kullanılarak gerçek zamanlı olarak aynı anda ölçülebilir. Ancak, geçerli yöntem çok sayıda hücre gerektirir ve yapışık hücreler için optimize edilir13. HSPCs fareler den büyük miktarlarda izole edilemez olduğundan14, saf bir popülasyon elde etmek için sıralama gerektiren, non-yapışık hücreler15, ve farklılaşma kaçınarak olmadan bir gecede kültürolamaz16, OCR ve HSPCs ECAR ölçmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunum ve birkaç bin murin kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs glikoliz ölçmek için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik etmek için net, adım adım talimatlar bir dizi sağlar.

<table><tbody><tr><td>% 0.01 (a / h) poli-L-lizin çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>LSK eki</td></tr><tr><td>40 ve mikro için kullanılır; m hücre süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Kemik kırma sonrası hücre filtrasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Lin-ayırma için kullanılır</td></tr><tr><td>Biotin Sıçan Anti-Fare CD45R/B220 Klonu RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Lin- ayırma için kullanılır</td></tr><tr><td>Biotin Sıçan Anti-Fare CD5 Klonu 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Lin- için kullanılır ayırma</td></tr><tr><td>Biotin Sıçan Anti-Fare CD8a Klonu 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>Lin- ayırma için kullanılır</td></tr><tr><td>Biotin Sıçan Anti-Fare Ly-6G ve Ly-6C Klonu RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>Lin- ayırma için kullanılır</td></tr><tr><td>Biotin Sıçan Anti-Fare TER-119 / Eritroid Hücreleri Klonu TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>Lin- ayırma</td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit) için kullanılır Monoklonal Antikor (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>LSK sıralaması için kullanılır</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Hücre izolasyonunda kullanılır</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Hücre izolasyonunda kullanılır</td></tr><tr><td>Falcon Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Tüpler</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>İçin kullanılır LSK sıralama</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Nöromikleri</td><td>FBS001-HI</td><td>FACS tamponunda kullanılır</td></tr><tr><td>Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Ficoll gradyan ayırma için kullanılır</td></tr><tr><td>L-glutamin 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Test ortamı için kullanılır</td></tr><tr><td>LS Sütunu</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Lin-ayırma için kullanılır Ly-6A</td></tr><tr><td>/E (Sca-1) Monoklonal Antikor (D7), PE-Siyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>LSK sıralaması için kullanılır</td></tr><tr><td>Murin Kök Hücre Faktörü (SCF)</td> <td>PeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Test ortamı için kullanılır</td></tr><tr><td>Murin Trombopoietin (TPO)</td> <td>PeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Test ortamı için kullanılır</td></tr><tr><td>PBS %1</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>FACS tamponu için kullanılır</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin ( 10.000 U/mL)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Tahlil ortamı için kullanılır</td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1304MP</td><td>LSK sıralaması için kullanılır</td></tr><tr><td>Denizatı XFp Hücre Kültürü Mini Plakası</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>LSK tohumlama için kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Test ortamı için kullanılır</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450 Eşlenik</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>LSK sıralaması için kullanılır</td></tr><tr><td>XF Kalibrantı</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Kartuş dengelemesi için kullanılır</td></tr><tr><td>XF ortamı</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Test ortamı için kullanılır</td></tr><tr><td>XFp Glikoliz Stres Test Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Glikoliz stres testi için ilaçlar</td></tr><tr><td>XFp Mitokondriyal Stres Test Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>Mitokondriyal stres testi için ilaçlar</td></tr><tr><td>XFp Sensör Kartuşu</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>Glikoliz ve mitokondriyal stres testi için kullanılır</td></tr></tbody></table>

hematopoetik kök atasının hücre metabolizmasının analizi

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) farklı metabolik plastisite var, hangi onları kan oluşumu taleplerini sürdürmek için bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş sağlar. Ancak, sınırlı sayıda ve non-adherent, kırılgan HSPCs için optimize protokollerin eksikliği nedeniyle HSPCs metabolik durumunu (mitokondriyal solunum ve glikoliz) analiz etmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunumu (oksijen tüketim oranı) ölçmek için bir dizi açık, adım adım talimatlar salıyoruz; OCR) ve glikoli (ekstrasellüler asitleşme hızı; ECAR) murine kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Bu protokol, murin kemik iliğinden daha yüksek miktarda LSK HSPC sağlar, kuluçka sırasında HSPC'lerin canlılığını artırır, non-yapışık HSPC'lerin hücre dışı akı analizlerini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyon ve glikolitik yolları hedefleyen ilaçlar için optimize edilmiş enjeksiyon protokolleri (konsantrasyon ve zaman) sağlar. Bu yöntem, kan gelişimi ve hastalıkları sırasında hspcs metabolik durum ve sağlık tahmin sağlar.

Çıkarma yöntemimiz fare başına ~80.000 LSK HSPC'ye kadar hasat yapmamızı sağladı. LSK hücrelerinin canlılığı ve sayıları yöntemimizle geliştirildi, çünkü biz: (1) üst ve alt ekstremitelerden kemik iliği, kalça kemikleri, sternum, göğüs kafesi ve omurga, (2) hücre ölümü ve kümelenmeyi artıracak kırmızı hücre lisis tamponu kullanmaktan kaçındı, (3) mono-çekirdekli hücrelerin yoğunluk gradyan orta ayırma kullanılan ve (4) kümelerde ilgi hücrelerinin kaybına neden olurdu önceden soğutulmuş tampon kullanarak kaçınılmalıdır.</...

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Hematopoetik kök ve ata hücrelerindeki metabolik değişiklikler, kan oluşumu taleplerini sürdürmek için, kuskan hallerinden farklılaşma durumuna geçiş yapmalarını sağlar. Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin metabolik plastisitesinde değişiklik hematolojik bozukluklara yol açar. Protokolümüz kan gelişimi ve hastalıkları sırasında metabolik regülasyon ve hematopoetik kök ve ata hücrelerinin sağlığının ölçülmeye yardımcı olacaktır.Kırılgan ve nadir popülasyonoldukları için hematopoetik kök ve ata hücrelerinin mitokondriyal solunum ve glikoliz analizi zordur. Optimize edilmiş protokolümüz, daha yüksek miktarda hematopoetik kök ve ata hücrelerinin rüri kemik iliğinden izolasyonuna olanak sağlar, kuluçka sırasında canlılıklarını artırır, non-yapışık HSPC'lerin hücre dışı akı analizini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyonun yanı sıra glikolitik yolları hedefleyen ilaç için optimize edilmiş enjeksiyon parametreleri sağlar. Bu prosedüre başlamak için, yardımcı plaka nın kuyularını ve kuyuların etrafındaki odaları steril suyla doldurun.Sensör kartuşu, sensörlerin tamamen suyla kaplı olduğundan emin olmak için yardımcı plakaya batırın. Daha sonra kartuşun yardımcı plakaya batırılmış bir co2 kuluçka makinesine 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Sınıf II biyogüvenlik kabininde, her bir asayplakasına 40 mikrolitre ticari olarak kullanılabilir %0,1 PLL çözeltisi ekleyin.Kitte verilen kapakla teşp plakayı kapatın ve kapalı plakayı kaputun altında oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, aşırı çözeltikaldırmak ve hava kaputun altında plaka kuru kaldırmak için steril bir vakum tabanlı aspiratör kullanın. Mononükleli murin kemik iliği hücrelerini hasat etmek için, 15 mililitrelik konik tüpe beş mililitre yoğunluk gradyan orta ekleyin.Yavaş yavaş hücrelerin yoğunluk gradyan orta üzerinde bir tabaka olarak kalmasını sağlamak için kemik iliği hücre süspansiyon beş mililitre ekleyin. Santrifüj 500 kez g ve oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj mümkün olan en düşük ivme olduğundan emin olun. Taze bir 15 mililitrelik tüp içine mononükleli hücrelerin orta arayüzü Hasat.Daha sonra hücreleri %2 FBS içeren 1X PBS'lik beş mililitre ile yıkayın. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj. Süpernatant çıkarın ve% 2 FBS içeren 1X PBS 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Daha sonra, bir FACS tüpünde lekesiz veya tek renkli kontrol için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresi. Mononükleli mürin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri toplamak için, 300 mikrolitre mononükleli kemik iliği hücresine 15 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin. Mononükleli mürin kemik iliği hücrelerinden LSK HSPC'leri toplamak için, 300 mikrolitre mononükleli kemik iliği hücresine 15 mikrolitre biyotin antikor kokteyli ekleyin.Tüpleri buzdolabında bir çalkalayıcının üzerine yerleştirilmiş bir buz kovasına yerleştirin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra hücrelere %2 FBS içeren önceden soğutulmuş 1X PBS 10 mililitre ekleyin. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.Supernatant atın ve hücre pelet in 400 mikrolitre 1X PBS içeren 2% FBS. Kısaca kullanmadan önce anti-biotin mikroboncuklar girdap. Her numuneye 80 mikrolitre mikroboncuk ekleyin ve iyice karıştırın.Ajitasyon ile dört santigrat derecede ek bir 20 dakika kuluçka. Bundan sonra, hücrelere% 2 FBS içeren önceden soğutulmuş PBS 10 mililitre ekleyin. Tüpü 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve% 2 FBS içeren PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Manyetik ayırma ünitesini kurarken hücre süspansiyonuna 4 santigrat derecede saklayın. Dört santigrat derecede manyetik destekli hücre sıralama ayırıcı için bir manyetik alana sütun yerleştirin.Dört santigrat derece yerçekimi akışı altında% 2 FBS içeren 1X PBS üç mililitre ile durulayarak manyetik ayırma için sütun hazırlayın. Hücre süspansiyonuna Dört santigrat derecede ıslak ön sütuna ekleyin. Tüm hücrelerin dört santigrat derece sütun geçmesine izin ve 15 mililitrekonik tüp içinde atık toplamak.Daha sonra, dört santigrat derece 1X PBS ve% 2 FBS üç mililitre ile sütun yıkayın. Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Akışı toplayın ve dört santigrat derecede tutun.500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca akışı içeren konik tüp santrifüj. Supernatant atın ve 1X PBS 0.5 mililitre içinde hücreleri yeniden askıya 2% FBS ve bir FACS tüpü için süspansiyon aktarın. Sonra her 10 milyon hücre ye 24 mikrolitre LSK antikor kokteylekleyin.Bir saat boyunca ajitasyon ile dört derece santigrat karanlıkta folyo ve kuluçka ile tüp kapağı. Bundan sonra, FACS tüpüne %2 FBS ile üç mililitre 1X PBS ekleyin. 500 kez g ve beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.Supernatant atın ve% 2 FBS içeren 1X PBS bir mililitre antikor etiketli hücreleri yeniden askıya. Sıralamadan hemen önce, hücre süspansiyonuna mililitre propidium iyodür başına bir miligram lık bir mikrolitre ekleyin ve FACS tüpünün içeriğini filtrelemek için 40 mikrometrelik bir süzgeç kullanın. İlk olarak, toplanan LSK hücrelerini 500 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve 40 mikrolitre başına en az 70,000 hücre son konsantrasyona tam ortamda hücreleri yeniden askıya. Bir PLL kaplı sekiz kuyu plaka kuyuları içine bu hücre süspansiyon Tohum 40 mikrolitre tüm köşe kuyuları boş bırakmak için emin olun. 450 kez g ve oda sıcaklığında bir dakika için plaka santrifüj.Hücrelerin kuyuların dibine bağlı olduğundan emin olmak için ters bir mikroskop kullanın. Bundan sonra, her kuyudaki hücrelere 135 mikrolitre tam ortam ekleyerek her kuyunun son hacmini 175 mikrolitreye çıkarın. Plakanın iki köşesine boşluk olarak 175 mikrolitre tam ortam ekleyin.Hücreleri CO2 olmayan bir kuluçka makinesinde 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, metin protokolünün tablo iki ve tablo üç tablosunda belirtildiği gibi plakanın her kuyusuna ilaç eklemek için analizör için bir program ayarlayın. Mitokondriyal stres testi için, her iyi iki mikromolar oligomisin, 1,5 mikromolar FCCP ve 0.5 mikromolar ya rotenon ve anti-mycin A son konsantrasyonu var gibi inkübatör yarar plakasında sensör kartuşunu almak gerektiği gibi.Kapağı sensör kartuşundan çıkarın ve alet tepsisinin üzerine yerleştirin. 20 dakika sürecek kalibrasyon işlemine başlayın. Kalibrasyon tamamlandığında, yardımcı plakayı çıkarın ve LSK hücrelerini içeren bir asayme plakası ile değiştirin.Daha önce ayarlanmış programı başlatmaya devam edin. Program tamamlandığında, verileri alın ve analiz edin. Bu çalışmada, maksimum miktarda canlı murine LSK HSPC izole edilmiş ve glikoli ve mitokondriyal metabolizması hücre dışı akı analizörü ile ölçüldü.Ekstrasellüler akı analizi geleneksel olarak yapışık hücreler için kullanılmasına rağmen, bu yöntem LSK HSPC'leri hücre dışı akının ölçümü ve böylece LSK HSPC'lerin metabolik sağlığına olanak tanıyan PLL kaplı kuyulara yapışık hale getirir. Bazal ve stres koşullarında hücre dışı asitleşme hızı ile oksijen tüketim hızı ve glikoliz yoluyla mitokondriyal solunumu ölçmek için glikoliz ve mitokondriyal solunumu engelleyen ilaçlar sırayla enjekte edilir. Beklendiği gibi, ekstrasellüler asitleşme oranıbazal düzeyi lsk HSPCs glikoz kültürlü ve negatif ortamda kültürlü olanlara göre pozitif medya pirüvat için daha yüksektir.Glikoz enjeksiyonu pozitif ortamda kültürlenen hücreler için ekstrasellüler asitleşme oranını değiştirmedi, ancak negatif ortamda hücrelerin glikoliz artırdı. Ancak, bu hücrelerin bazal düzeyi hala pozitif grupta daha düşük kaldı. Oligomisin enjeksiyonu glikoliz pozitif grupta maksimum düzeyde aktive, ancak negatif grubu etkilemedi.2-DG'de glukoz analogu ile enjeksiyon ekstrasellüler asitleşme oranını glikolitik olmayan düzeylere geri döndürmüş. Mitokondriyal stres testi için, oligomisin enjeksiyonu mitokondriyal membranı hiperpolarize ederek ETC kompleksleri arasında daha fazla proton pompalanmasını önler ve böylece mitokondriyal solunum oranını azaltır. HÜCRELER mitokondriyal membran potansiyelini kurtarmaya çalışırken FCCP enjeksiyonu oksijen tüketim hızını maksimuma çıkarır.Diğer iki elektron taşıma zinciri inhibitörlü enjeksiyon, mitokondriyal solunumun tamamen durmasına ve böylece oksijen tüketim hızının minimum seviyeye geri döndürülmesini sağlar. Mononükleer hücre izolasyonu için kırmızı hücre lisis tamponu kullanmaktan kaçının. Küme oluşumunu önlemek ve LSK kaybını azaltmak için Ficoll gradyan ayrımını öneriyoruz.Optimize edilmiş metodumuzu kullanarak, nadir ve kırılgan hematopoetik kök ve progenitor hücrelerin mitokondriyal solunum ve glikoliz ölçebilir ve metabolik ipuçlarının incelenmesi normal ve malign hematopoemi düzenler.

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Koloni oluşturan hücre (CFC) tayini hematopoetik atalarıdır yarı-katı ortamda koloniler oluşturur in vitro testtir. Koloni morfolojisi, hücre morfolojisi ve akış sitometri bir arada, farklı hematopoetik soy boyunca çoğalırlar ve ayırt atalarıdır yeteneklerini değerlendirmek için kullanılır.

Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Bu protokol, hücre sıralama yoluyla kök hücrelerin önceden saflaştırılması olmadan hematopoietik kök/progenitör hücre fonksiyonunu incelemek için rekabetçi fare kemik iliği nakli deneyleri kurmak için adım adım yönergeler sağlar.

Rekabetçi Nakli Hematopoetik Kök Hücre Fitness değerlendirin

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

Xenobiotic "effluks" pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir "effluks" pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs 'de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi

Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Burada, nadir hücre tiplerinde metabolitleri doğru ve güvenilir bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Hücre sınıflandırması için modifiye edilmiş bir kılıf sıvısı ve ilgili boş numunelerin oluşturulması da dahil olmak üzere teknik iyileştirmeler, numune başına yalnızca 5000 hücrelik bir girdi ile metabolitlerin kapsamlı bir miktar tayinini sağlar.

Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Öğrenin, hematopoetik kök atası hücrelerinin mitokondriyal solunum ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntemi. Bu protokol, fare kemik iliğinden yüksek verimli izolasyon sağlar ve hücre canlılığını artırarak metabolik düzenlemeyi incelemenize olanak tanır.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Daha fazla video keşfet