Name: Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Keşfedin meme kanseri kök hücre davranışlarını incelemek için murine mammosphere kültürlerinde kendini yenileme niceliği yöntemini. Bu basit ve uygun maliyetli analiz, farklı hücre tiplerinin büyüme oranlarını karşılaştırmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Rosa26-MycER transgenik fare modeli tür hediye için Bruno Amati teşekkür ederiz. Bu çalışma WWCR, AIRC, ERC ve İtalya Sağlık Bakanlığı'ndan P.G.P. T.V. ve X.A.'ya verilen hibelerle finanse edilmiştir.

In vivo işlemler AB direktifi 2010/63 ve kurumsal etik komitesi (Hayvan Sağlığı için Organizma-OPBA) ve İtalya Sağlık Bakanlığı (IACUC Numaraları 762/2015 ve 537/2017) onayı sonrasında gerçekleştirilmiştir.
1. Murine Meme Bezi Toplama ve Sindirim
<ol><li>Tipik bir deney için, CO2 teneffüs tarafından 8-10 haftalık bakire dişi fareler kurban. Deneyin amaçlarına bağlı olarak 5-30 fare kullanın. Fareleri bir kaputun altına diseksiyon tahtalarına yerleştirin. Ön ayakları germek ve etanol ile hayvanın kürk aşağı yıkamak için iğnekullanın.</li>
	<li>Forseps ile cildi kaldırın ve pelvik alan düzeyinde başlayan ve serviks e kadar tüm yol hareket dikey bir kesi gerçekleştirmek, periton bozulmadan bırakarak. Cilt veya periton yırtılma önlemek için, yuvarlak kenarlı makas kullanın.</li>
	<li>Dikkatle vücudun lateral ekseni boyunca makas nazik hareketleri ile vücuttan cilt ayırmak.</li>
	<li>Deri torasik ve karın bölgesinden tamamen ayrıldıktan sonra, hayvanın dört uzuvları boyunca dört kesi yapın ve iğnelerle deriyi sabitler. Tam genişletilmiş deri den hayvanın vücut ayırmak için makas ve forceps kullanın.</li>
	<li>Yavaşça şimdi tamamen maruz ve dikkatle makas yardımı ile deriden ayırmak meme yağ pedleri kaldırmak için forseps kullanın. Her farenin alt torasik ve abdominal meme bezlerini toplayın ve 50 mL konik tüpiçinde Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) batırın. Tüp başına en fazla 20 bez toplayın. Dokuları buzda tut. NOT: Gerekirse, bezleri bir gecede buz üzerinde kalabilir. Burası güvenli bir durak noktası. Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında yapılmalıdır.</li>
	<li>Sindirim ortamını hazırlayın ve filtreleyin: Dulbecco'nun modifiye kartal ortası (DMEM) 2 mM glutamin, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 200 U/mL kollajenaz ve 100 μg/mL hyaluronidaz (Malzeme Tablosunabakınız).</li>
	<li>100 mm Petri kabına 20 beze aktarın ve neşter veya kavisli makas kullanarak dokuyu dolayın. Büyük hacimlerde DPBS'yi yemeğe aktarmaktan kaçının.</li>
	<li>Her Petri kabına 10 mL sindirim ortamı ekleyin ve 25 mL serolojik pipet kullanarak kıyma dokusunu 50 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüpleri parafilm ile kapatın ve bir rotator üzerine yerleştirin. Rotatörü düşük hızda (0,03 x g)ayarlayın ve %5 CO2içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de 2,5 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Sonraki adımlara geçmeden önce süspansiyonu görsel olarak inceleyin. Büyük doku parçaları sindirilmemiş kalırsa, kuluçka süresini 37 °C'de 30 dakika daha uzatın. NOT: Alternatif olarak, sindirim bir gecede yapılabilir 37 °C, 5% CO2, nazik bir kollajenaz / hyaluronidase enzim karışımı kullanılarak13.</li>
</ol>2. Birincil Murine MECs Izolasyon
<ol><li>Rotatörü durdurun ve tüpleri kuvözden çıkarın. 5 mL serolojik pipetin açılışında p1000 ucunu ayarlayın. Süspansiyon P1000 ucundan geçerse, sonraki adımlara devam edin. Aksi takdirde, 37 °C'de kuluçka süresini 30 dakika daha uzatın.</li>
	<li>Santrifüj 100 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant'ı dikkatlice decant ve her tüpün peletini 3 mL DPBS'de yeniden askıya alın. NOT: Düşük santrifüj hızı lenfositler ve yağ dokusu hücrelerinin kaldırılmasını sağlar. Bu adımda peletin sislodging önlemek için nazik manipülasyon gereklidir.</li>
	<li>100, 70 ve 40 μm hücreli süzgeçkullanarak her tüpteki hücre süspansiyonuna ayrı ayrı süzün. Her filtreleme adımında, geçişi toplamadan önce süzgeçleri 2 mL DPBS ile yıkayın. NOT: Bu noktadan itibaren, hücre süspansiyonları biraraya getirilebilir ve birlikte işlenebilir.</li>
	<li>Santrifüj 300 x g, 4 °C'de 5 dk. Supernatant'ı dikkatlice decant ve DPBS'nin kalan hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın.</li>
	<li>Eşit hacimde amonyum-klorür-potasyum (ACK) lysis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücresine (RBC) devam edin (Bkz. Malzemeler Tablosu). Pipetleme ile karıştırın ve 5 dakika kadar buz üzerinde kuluçka.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk için 300 x g'de10 mL DPBS ve santrifüj ekleyin. Supernatant'ı dikkatlice dekatant ve peleti görsel olarak inceleyin. Pelet beyazsa, bir sonraki adıma geçin. Aksi takdirde RBC lysis adımını tekrarlayın (adım 2.5).</li>
	<li>Mammosphere media 1-5 mL hücre pelet resuspend: meme epitel hücre büyüme bazal orta (MEBM), 2 mM glutamin ile takviye, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 5 g/mL insülin, 0.5 μg/mL hidrokortizon, %2 B27, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 20 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 0.4 IU/mL heparin (Tablo Malzemeler)</li>
</ol>3. Seri Mammosphere Re-kaplama
<ol><li>Mammosfer kültürlerinin kurulması için, hücreleri mamografi mecrasında 200.000 canlı hücre/mL yoğunlukta tedavi edilen doku dışı kültüre (ultra-düşük yapışma) 6-iyi plakalar üzerine plakalayın. Hücreleri 37 °C,%5 CO2'de7-10 gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>%95 etanolde %1 poli-HEMA çözeltisi hazırlayın ve filtreleyin (bkz. Malzemeler Tablosu). Aşağıdaki pasajlar için ultra düşük yapışma 6-iyi plakalar katlayın, kuyu başına 400 μL poli-HEMA çözeltisi ekleyerek ve etanolün tamamen kurumasını sağlayarak. Daha iyi sonuçlar elde etmek için kaplamayı iki kez tekrarlayın. NOT: İlk geçiş sırasında kaplamasız plakaların kullanılması fibroblastların kültürden seçici olarak çıkarılmasını sağlar.</li>
	<li>7-10 günlük kültürün sonunda, tüm kuyulardan birincil mammospheres toplamak ve santrifüj 300 x g, 4 ° C'de 5 dakika için.</li>
	<li>Supernatant'ı dikkatlice dekantın ve filtreli uçlu P200 pipeti kullanarak mammospheres'in mekanik ayrıştırılmasına devam edin. Pipet yaklaşık 100 kez ve görsel olarak büyük küresellerin varlığı için süspansiyon incelemek. NOT: 37 °C'de düşük hacimli (0.2-0.5 mL) küre peletinin kısa bir kuluçka (2-5 dk) veya %5 CO2,mekanik dissosiasyonu kolaylaştırmak için kullanılabilir. Her pasajın kaplaması için taze mammosphere orta (adım 2.7) hazırlayın.</li>
	<li>Taze mamografi orta 1-5 mL resuspend ve canlı hücreleri saymak. Varsa, tedavi gruplarında veya kültür koşullarına hücreleri bölün.</li>
	<li>Plaka 20.000 canlı hücre /mL poli-HEMA kaplı ultra-düşük yapışma 6-iyi plakalar ve kuluçka 37 °C, 5% CO2. NOT: Mamospheres hücre kaplama sonra 5-7 gün içinde maksimum boyutuna ulaşır. Mümkün olduğunda, teknik çoğaltmalar elde etmek için her örnek veya koşulun hücrelerini birden çok kuyuya dağıtın. Hücre agregasını önlemek için kaplama yoğunluğu düşük tutulmalıdır. 6-iyi plakalar için maksimum 20.000 hücre/mL ve 24 kuyulu plakalar için 5.000 hücre/mL önerilir.</li>
	<li>5-7 gün sonra, iyi başına küre sayısını saymak. Bu, 10x büyütme lensi ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak veya dijital görüntü analizi kullanılarak manuel olarak yapılabilir (bkz. adım 4).</li>
	<li>Her kuyunun mamospheres ayrı ayrı toplayın ve santrifüj 300 x g, 4 °C'de 5 dakika için.</li>
	<li>Supernatant'ı dikkatlice dekantın ve filtreli uçlu P200 pipeti kullanarak mammospheres'in mekanik ayrıştırılmasına devam edin. Pipet yaklaşık 100 kez ve görsel olarak büyük küresellerin varlığı için süspansiyon incelemek.</li>
	<li>Taze mammosphere orta 1 mL resuspend ve canlı hücreleri saymak. Her numunenin veya koşulun hücrelerini birleştirin ve 3.6-3.10 adımlarını yineleyin. Kaplanmış hücre sayısını ve her geçit için her biri için sayılan küre ve hücre sayısını kaydedin. Kümülatif büyüme hesaplaması için adım 5'e geçin.</li>
</ol>4. Dijital Görüntü Analizi (DIA) Kullanarak Küre Numaralandırma
<ol><li>Her pasajın sonunda, tüm kuyuların tüm yüzeyini tarayıp stereoskopüzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanarak kürelerin görüntülerini elde edin. Görüntüleri .tif dosyaları olarak kaydedin.</li>
	<li>ImageJ14'ükullanarak stereoskop görüntülerini Görüntü Dizisi olarak aktarın. Ölçeği ve görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın.</li>
	<li>Resim yığınını çoğaltın ve menü çubuğundaki sekme işleminden Arka Planı Çıkar'ı seçin. Seçenekleri kontrol Edin Işık arka plan ve Kayan paraboloid ve düğmesinetıklayın Tamam . Yığının tüm görüntülerini işle.</li>
	<li>Menü çubuğunun sekmesinden Ayarla ve Ardından Eşik'i seçin. Uygula'yatıklayarak, Yığını İkiliye Dönüştür başlıklı bir diyalog penceresi görüntülenir. Yöntem olarak Varsayılan'ı ve arka plan olarak Işık'ı seçin. Kutuyu işaretle Her görüntü için hesapla eşiğini hesapla ve Tamamdüğmesine tıklayın.</li>
	<li>Menü çubuğunun sekmesinin altındaki İkili listeden Havza, Aç ve Erode komutlarını sırayla seçin. Görünen diyalog kutusunun Evet düğmesine tıklayarak yığının tüm görüntülerini işleyin. NOT: Bu işlemler, nesnelerin dokunması, nesnedüzitme ve nesnelerin kenarından piksel kaldırma görsel bölümleme sağlar.</li>
	<li>İşlevçözümme menüsünden Parçacıkları Analizet'i seçin. Minimum boyut eşiğini 10.000 μm2 ve 0,50 ile 1,00 arasında dairesellik olarak ayarlayın. Açılan menüden Elips seçeneğini seçin. Özetle'yiişaretleyin , kenarlarda hariç tut ve yerinde Göster ve Tamamdüğmesine tıklayın. Yığının tüm görüntülerini işle.</li>
	<li>Elipslerin kürelerle olan yazışmalarını görsel olarak inceleyin ve gerekirse parçacık sayısını buna göre düzeltin. Her kuyunun tüm karelerinden sayımları toplamı, her kuyunun toplam mammospheres sayısını elde etmek için.</li>
</ol>5. Kümülatif Büyüme Eğrisi Hesaplama
NOT: Her pasajın sonunda her kuyuda sayılan mammospheres sayısı (PN)PNbaşında tohumlanmış mammosphere başlatan hücrelerin sayısını yansıtır.
<ol><li>Her geçiş için (PN),kaplamalı hücre sayısını ve iyi başına sayılan hücre ve küre sayısını kaydedin. Her pasajın sonundaki küre boyutunu hesaplayın: küre boyutu PN (hücre / küre) = pn / küre sayılanp n sayılan hücreler NOT: PN'deki küre boyutu, PN'detohumlanan her mammosferbaşlatan hücrenin proliferatif potansiyelinin bir ölçüsüdür.</li>
	<li>PN için kaplanmış hücre sayısını bir önceki pasajın sonunda hesaplanan küre boyutuna bölerek kaplamalı kürelerin sayısını çıkar (PN-1): küreler pN = hücreleri pn / küre boyutu PN-1 kaplama NOT: Konvansiyona göre, küre boyutu kültürün ilk geçişi sırasında kararlı kabul edilir (yani, küre boyutu P0 = küre boyutu P1). Birden çok kuyu teknik çoğaltma olarak kullanılıyorsa, PN-1'deki ortalama küre boyutunu payda olarak kullanın.</li>
	<li>Her geçit için kümülatif hücre ve küre numarasını hesaplayın: kümülatif sayı PN = (pn / kaplamaLı PN)X kümülatif sayı PN-1. NOT: Konvansiyona göre, kümülatif sayı P0 = p1plakalı . Teknik çoğaltma olarak birden çok kuyu kullanılıyorsa, her geçiş için numune veya koşul başına ortalama kümülatif sayıyı hesaplayın.</li>
	<li>Veri noktalarını yarı logaritmik ölçekte çizin. Geçiş numarasını (P0-P N)x ekseninde (doğrusal ölçek) ve y ekseninde kümülatif hücre veya küre numarasını (logaritmik ölçek) görüntüleyin.</li>
	<li>Üstel bir eğilim çizgisini veri noktalarına sığdırın ve uyumun iyiliğini ölçmek için belirleme katsayısını (R2)hesaplayın. NOT: Veri noktalarına takılan eğilim çizgisi, sabit bir hızda büyüyen veya ölen bir hücre popülasyonu için beklendiği gibi üstel bir eğriye yaklaşmalıdır. R2, 0 ile 1 arasındaki değerleri alır ve 1'e en yakın değerler daha iyi bir uyum gösterir.</li>
	<li>Kültürün büyüme hızını (GR) çıkarmak için eğilim çizgisinin denklemini doğal bir üstel işlev olarak gösterin: y = y0 e(GR)x, y0 değeri ise y = 0 olur.</li>
</ol>

<ol><li>Kordon, E. C., Smith, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entire+functional+mammary+gland+may+comprise+the+progeny+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell.</a> Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage+and+time+dictate+the+fate+of+Wnt%2Fbeta-catenin-responsive+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).</li>
<li>Van Keymeulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stem+cells+contribute+to+mammary+gland+development+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance.</a> Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).</li>
<li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Pece, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140 (1), 62-73 (2010).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Santoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Loss+in+Breast+Cancer+Leads+to+Myc+Activation%2C+Increased+Cell+Plasticity%2C+and+Expression+of+a+Mitotic+Signature+with+Prognostic+Value%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value.</a> Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+mammary+stem%2Fprogenitor+cell+isolation%3A+Different+method+matters%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Springerplus%22%5BJournal%5D)">Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters?</a> Springerplus. 5, 140(2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Murphy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+thresholds+govern+Myc%27s+biological+output+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo.</a> Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).</li>
<li>Bailey, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Tracking+of+Breast+Cancer+Cells+Enables+Prediction+of+Sphere+Formation+from+Early+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions.</a> iScience. 8, 29-39 (2018).</li>
<li>Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+formation+assay+from+human+breast+cancer+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sphere+culture+cannot+maintain+a+high+ratio+of+cancer+stem+cells%3A+a+mathematical+model+and+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Smart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+breast+cancer+cell+line+tumourspheres+and+primary+human+breast+epithelia+mammospheres+demonstrates+inter-+and+intrasphere+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Panciera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+of+Somatic+Stem+Cells+by+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, masc büyüme özelliklerinin in vitro nicel tanımı için bir protokol açıklıyoruz. Örnek olarak, düşük seviyeli kurucu Myc ifadesinin normal murine MASC'ler üzerindeki etkisini sgörüyoruz. Ancak bu yaklaşım çeşitli bağlamlara eşit olarak uygulanabilir. İnsan veya murine birincil hücreleri, hem de kurulan hücre hatları, seri olarak geçilebilir mammosfer kültürleri kurmak için ankraj bağımsız koşullarda kültürlenebilir. Gen aşırı ekspresyonu ve RNA paraziti protokole ilk geçişin sonunda viral bir transdüksiyon adımı eklenmesiyle (3.5. adımdan sonra) kolayca sunulabilir. Alternatif olarak, hücreler yapışma enfekte olabilir ve daha sonra mammospheres olarak kaplanmış.
Burada sunulan tahmin kritik bir yönü, sonuçların yorumlanması na müdahale agregaların nesil önlemek için yeterince düşük olmalıdır tohumlama hücre yoğunluğu vardır16,17. Mammospheres morfolojisi bu belirsizliği gidermek için bilgilendirici olabilir. Sadece kompakt, yuvarlak küreler her pasajın sonunda numaralandırılmalıdır. Hem küresellerin daireselliği hem de boyutu göz önünde bulundurulmalıdır. DIA'nın otomatik leştirilmiş işlemi kullanılarak, bu adım uygun eşiklerle objektif ve mutlak bir şekilde sağlanır. Genellikle, ataları mamosfer sayımları dışında tutulmalıdır acinar yapılar veya hücrelerin daha küçük kümeleri oluşturacaktır. Başparmak kuralı olarak, 100 μm çapında bir eşik kullanırız. Son olarak, sağlam veya tamamen ayrıştırılmış olmayan mammopsheres bir pasajdan diğerine transferi önlemek için dikkatli olmalıdır. Öte yandan, aşırı pipetleme artan hücre ölümüne yol açacaktır. Bu nedenle, bu tür zorluklarla karşılaşılırsa, hafif tripsinizasyon veya Accutase tedavisi kullanmanızı ve tek hücreli süspansiyonların oluşmasını sağlamak için ayrık küreleri 40 μm'lik bir süzgeçten geçirmenizi öneririz.
Küre şekillendirme verimliliği (SFE) alternatif olarak, mammosphere kültürlerde SC veya CSC quantitation ex vivo için bir vekil olarak kullanılmıştır. SFE gerçekten belirli bir hücre popülasyonundaki kök benzeri hücrelerin bir ölçüsüdür. Ancak, yalnızca farklı zaman noktalarında bilgi sağladığından daha az vicdanlı bir yaklaşımı temsil eder. Bunun yerine, kümülatif küre sayılarının hesaplanması ve kümülatif büyüme eğrilerinin üretilmesi, kültürün ilk hücre tohumlama adımından kültür tükenene kadar ya da ölümsüzleştirilmiş kültürlerde istenilen sayıda geçit için kültür büyüme hızının çıkarımını sağlar. Büyüme özelliklerinin değerlendirilmesi, katsayı R2 ile üstel büyümeden sapmanın değerlendirilmesine ve ikinci adımda GR değerinin kendisinin değerlendirilmesine olanak sağlar.
Daha da önemlisi, kümülatif mammosfer büyüme eğrileri csc düzeyinde seçici küçük molekül inhibitörleri veya diğer kemoterapötik ilaçların etkisini değerlendirmek için kullanılabilir6,11. 5-7 pasajda fonksiyonel olarak egzoz normal primer mammospheres aksine, tümör mammospheres süresiz olarak genişletmek eğilimindedir. Bu özellik sınırsız CSC kendini yenileme yeteneği ile bağlantılıdır. Proliferasyon ve CSC kendini yenileme üzerindeki etkileri tümör hücresi ve mammosphere büyüme eğrileri üretimi ile uncoupled olabilir, sırasıyla. Bir CSC özgü etkisi kümülatif mammosphere büyüme hızında bir azalmaya neden olması bekleniyor, veya kümülatif hücre büyüme hızı üzerinde etkisi olmadan6,11.
Son olarak, ilgi başka bir alan yetişkin doku SC yeniden programlama biridir. Tam olarak yetiştirilen mammospheres bir fenotipik heterojen hücre popülasyonu oluşur, hangi sadece küçük bir kesir kök benzeri özellikleri korur, vivo nakli üzerine mammosphere başlatma yeteneği ve meme bezi rejenerasyonu da dahil olmak üzere6,9,11,18,19. Meme ataları böylece ya in vitro etiket istinat tahlilleri kullanılarak izole edilebilir6,9,11 veya, ex vivo, kurulan yüzey belirteçleri kullanarak2,3. Özellikle, meme ataları anoikis hayatta değildir ve mammospheres oluşturmak mümkün değildir. Zorunlu Myc ifade meme ataları PKHneg olarak izole mammosphere inisiyasyon potansiyeli vermek için gösterilmiştir11, süresiz olarak geçilebilir bir kültürün nesil sonuçlanan. Benzer şekilde, fizyolojik yeniden programlama negatif düzenleyicilerin girişim aynı test kullanılarak test edilebilir. Bu bağlamda, ortaya çıkabilecek ortak bir sorun hücre girişi sınırlı sayıda. Hücre girişi 10.000 hücreden daha düşükse, 24 kuyulu tabaklarda (maksimum 5.000 canlı hücre/mL) tohumlamanızı öneririz. Bununla birlikte, ankraj bağımsız kültür koşulları, özellikle yeniden programlama etkisi hemen olmadığı durumlarda, yeniden programlama puanlama için çok sert olduğu kanıtlanabilir. Bu gibi durumlarda, destekleyici bir matris ve 3 boyutlu organoid kültürlerin kullanımı daha uygun olabilir20.
Genel olarak, mammosphere test kolayca normal ve tümöral MEC popülasyonlarında kök benzeri özellikleri puanlama için istihdam edilebilir maliyet-etkin bir seçenektir. Bu protokolde alınan nicel yaklaşım, farklı koşullarda veya farklı uyaranlara maruz kalan kültürler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır. Titizlikle takip edildiğinde, daha ayrıntılı mekanistik çalışmalar imkanı sunan, in vivo kök özellikleri tanımlayan birden fazla oyuncu ayrılmasına izin veren nispeten basit bir ex vivo model sistemi sağlar.

Meme epitel sapı ve ata hücrelerinin izolasyon ve in vitro kültürü meme hücre biyolojisindeki özelliklerini anlamak için gerekli hale gelmiştir. Zarif soy izleme ve seri transplantasyon tahlilleri, in vivo niş bağlamında kök hücre (SCs) ve diğer doku alt kümelerinin incelenmesini sağlamıştır. Ancak, bu yaklaşım zaman alıcı ve muhabir fare modelleri1,2,3,4,5nesil gerektirir. Bu nedenle, in vitro kültür ve meme kök hücrelerinin yayılması (MASCs) anahtar köklük özellikleri, yani kendini yenileme ve farklılaşma yeteneği, bu alanda en büyük zorluklardan biridir. Son yıllarda, mammosphere testi yaygın normal meme dokusu ve meme kanseri büyüme modeli için, normal veya kanser SCs (CCs) ölçmek ve kendi faaliyetlerinin bir vekil muhabiri olarak kendi kendini yenileme yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştırvivobağlamda kendi faaliyetlerinin bir vekil muhabiri olarak 6,7,8,9,10,11.
Mammosphere tsay verimli ve maliyet-etkin bir yaklaşımdır, hangi taze izole meme epitel hücreleri (MECs) non-yapışık koşullarda kültürlü olan, sadece MASCs hayatta kalacak ve süspansiyon küreler oluştururken tüm diğer hücre tipleri anoikis tarafından ölecek. Ayrıca, seri non-adherent pasajlarda mammospheres birkaç nesil oluşturmak için yeteneği MaSCs6,9,11kendi kendini yenileme yeteneği ile ilgilidir. Burada, başlangıçta Dontu ve meslektaşları7 öncü nörosfer tahlili bir değişiklik olarak geliştirilen bir nicel mammosphere tahsin ayrıntılı bir protokol açıklar12, uygun büyüme faktörlerinin eklenmesi ile non-adherent, serum-free koşullarda putatif SC büyümesini sağlayan7,12.

<table><tbody><tr><td>ACK lizis tamponu</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Amonyum-klorür-potasyum lizis bufer, 100 mL.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>B27 takviyesi 50X (10 mL). Nihai konsantrasyon %2 v/v.</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>İnsan rekombinant fibroblast büyüme faktörü - bazik, 50 >. Stok çözeltisi 100 &�; g/&mu; Tris 5 mM pH 7.6'da L. Son seyreltme %0.02 v/v.</td></tr><tr><td>Kollajenaz</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>Clostridium histolyticum'dan kollajenaz. Tip I-A, liyofilize toz, 1 g. DMEM'de 20.000 U/mL stoklayın. Son seyreltme %1 v/v.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Microgem'i</td><td>S17859L0615</td><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su</td></tr><tr><td>EGF'si</td><td>Tebu-Bio</td><td>AF-100-15</td><td>Rekombinant insan epitel büyüme faktörü. Stok çözeltisi 100 &mu; steril dH2O'da g/mL. Nihai seyreltme% 0.02 v/v.</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-Glutamin, 200 mM. Son seyreltme %1 v/v.</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>PharmaTex</td><td>34692032</td><td>Stok konsantrasyonu 5.000 IU/mL. Son seyreltme %0.008 v/v.</td></tr><tr><td>Hyaluronidaz</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Tip IV-S, toz, 750-3.000 U / mg katı, 30 mg. Steril dH2O'da stok çözeltisi 10 mg / mL. Nihai seyreltme% 1 v / v.</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Stok konsantrasyonu 100 &mu; g/mL'dir. Son seyreltme %0,5 v/v.</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>SAFCBiosciences</td><td>91077C</td><td>İnsülin, insan rekombinant, kuru toz, 250 mg. Stok konsantrasyonu 1 mg / mL. Son seyreltme %0,5 v/v.</td></tr><tr><td>Düşük ataşmanlı 6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>351146</td><td>Steril 6 kuyulu işlem görmemiş, şeffaf düz tabanlı ve kapaklı hücre kültürü plakaları.</td></tr><tr><td>MEBM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td>Meme epitel hücre büyümesi bazal ortam</td></tr><tr><td>Penikllin-Streptomisin karışımı</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>10.000 U potasyum penisilin ve 10.000 & içerir; % 0.85 tuzlu su içinde mL başına g streptomisin sülfat. Son seyreltme %1 v/v.</td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>Gece boyunca 55 ° C'de% 95 EtOH içinde çözülür. Stok konsantrasyonu% 12 w / v. Nihai seyreltme% 95 EtOH içinde% 1 v / v. Filtre (0.22 &mu; m) kullanmadan önce.</td></tr></tbody></table>

murine mammosphere kültürlerde kendini yenileme nin niceliği

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

Meme bezi geniş rejenerasyon kapasitesi ile karakterizedir, bir kadının yaşam döngüsü boyunca büyük hormonal değişiklikler geçer gibi. Meme kök hücrelerinin (MASC) rolü hem fizyolojik/gelişimsel bağlamda hem de meme kanserinegenezi açısından yaygın olarak incelenmiştir. Bu açıdan, MaSC özelliklerine odaklanan ex vivo çalışmaları çok sonra aranır. Mammosphere kültürleri organ oluşumunun bir taşıyıcısı temsil ve hem temel hem de çevirisel araştırma için değerli bir araç haline gelmiştir. Burada, murine primer mamografi kültürleri ve MaSC büyüme özelliklerinin niceliği için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Protokol, meme bezi toplama ve sindirimi, primer meme epitel hücrelerinin (MECs) izolasyonunu, primer mammosfer kültürlerinin kurulmasını, seri geçişleri, mammosfer büyüme parametrelerinin niceliğini ve sonuçların yorumlanmasını içerir. Örnek olarak, düşük seviyeli kurucu Myc ifadesinin normal MEC'ler üzerindeki etkisini sunarak artan kendini yenileme ve çoğalmaya yol açıyoruz.

Normal MECs MYC aşırı ekspresyon, mammosphere başlatan hücrelerin artan sıklığı yol açar. Bu çift mekanizma ile elde edilir: Myc MaSC simetrik bölünmeler ve yeni MASCs11içine progenitor yeniden programlama sıklığını artırır. Düşük kurucu Myc ekspresyonunun etkisini test etmek için, Myc aktivitesinin 4-hidroksitamoksifen (4-OHT)tarafındanindüklenebileceği Rosa26-MycER transgenik fare modelini kullandık. 4-OHT yokluğunda, fibroblastları çıkarmak için ilk olarak MEC'leri ultra düşük yapışma 6-iyi plakalara yapıştırdık. İlk pasajdan sonra kültürü ikiye böldük: iki kuyu tedavi edilmedi (kontrol) ve iki kuyu 200 nM 4-OHT (MycER) ile tedavi edildi. Üç bağımsız deney için 5 ardışık pasajın küre ve hücre numaralarını saydık(Tablo 1). Her geçitteki kümülatif hücre ve küre sayıları Tablo 2'degösterilmiştir. 4-OHT ile indüksiyon, Şekil 1'degösterildiği gibi küre ve hücre büyüme oranlarının artmasına yol açar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256fig1a.jpg"> Şekil 1: Temsili sonuçlar. Kümülatif küre (A) ve hücre (B) kontrol ve MycER mammospheres büyüme eğrileri. 3 bağımsız deneyin ortalama ve standart sapması gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/60256fig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">1. kaplama</td>
			<td colspan="3">2. kaplama</td>
			<td colspan="3">3. kaplama</td>
			<td colspan="3">4. kaplama</td>
			<td colspan="3">5. kaplama</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Kaplanmış Hücreler</td>
			<td>Hücre Sayısı</td>
			<td>Küre Sayısı</td>
			<td>Kaplanmış Hücreler</td>
			<td>Hücre Sayısı</td>
			<td>Küre Sayısı</td>
			<td>Kaplanmış Hücreler</td>
			<td>Hücre Sayısı</td>
			<td>Küre Sayısı</td>
			<td>Kaplanmış Hücreler</td>
			<td>Hücre Sayısı</td>
			<td>Küre Sayısı</td>
			<td>Kaplanmış Hücreler</td>
			<td>Hücre Sayısı</td>
			<td>Küre Sayısı</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp1</td>
			<td rowspan="2">Denetim</td>
			<td>77,000</td>
			<td>50,000</td>
			<td>31</td>
			<td>65,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>41</td>
			<td>57,000</td>
			<td>30,000</td>
			<td>32</td>
			<td>30,000</td>
			<td>22,000</td>
			<td>5</td>
			<td>22,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>81,000</td>
			<td>41</td>
			<td>65,000</td>
			<td>55,000</td>
			<td>23</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>77,000</td>
			<td>31,0000</td>
			<td>193</td>
			<td>80,000</td>
			<td>375,000</td>
			<td>323</td>
			<td>80,000</td>
			<td>380,000</td>
			<td>217</td>
			<td>80,000</td>
			<td>220,000</td>
			<td>223</td>
			<td>80,000</td>
			<td>170,000</td>
			<td>155</td>
		</tr><tr><td>77,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>142</td>
			<td>80,000</td>
			<td>505,000</td>
			<td>396</td>
			<td>80,000</td>
			<td>270,000</td>
			<td>149</td>
			<td>80,000</td>
			<td>290,000</td>
			<td>194</td>
			<td>80,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>160</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp2</td>
			<td rowspan="2">Denetim</td>
			<td>75,000</td>
			<td>75,000</td>
			<td>71</td>
			<td>60,000</td>
			<td>17,000</td>
			<td>34</td>
			<td>28,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>29</td>
			<td>45,000</td>
			<td>13,000</td>
			<td>2</td>
			<td>13,000</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>47,000</td>
			<td>45</td>
			<td>60,000</td>
			<td>11,000</td>
			<td>47</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>75,000</td>
			<td>200,000</td>
			<td>188</td>
			<td>80,000</td>
			<td>225,000</td>
			<td>277</td>
			<td>80,000</td>
			<td>230,000</td>
			<td>155</td>
			<td>80,000</td>
			<td>210,000</td>
			<td>211</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>95</td>
		</tr><tr><td>75,000</td>
			<td>250,000</td>
			<td>192</td>
			<td>80,000</td>
			<td>202,500</td>
			<td>283</td>
			<td>80,000</td>
			<td>305,000</td>
			<td>185</td>
			<td>80,000</td>
			<td>160,000</td>
			<td>237</td>
			<td>80,000</td>
			<td>100,000</td>
			<td>133</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Exp3</td>
			<td rowspan="2">Denetim</td>
			<td>82,500</td>
			<td>130,000</td>
			<td>121</td>
			<td>80,000</td>
			<td>45,000</td>
			<td>105</td>
			<td>80,000</td>
			<td>110,000</td>
			<td>86</td>
			<td>80,000</td>
			<td>58,500</td>
			<td>75</td>
			<td>58,500</td>
			<td>58,500</td>
			<td>78</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>125,000</td>
			<td>177</td>
			<td>80,000</td>
			<td>71,250</td>
			<td>42</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="2">MycER</td>
			<td>82,500</td>
			<td>325,000</td>
			<td>457</td>
			<td>80,000</td>
			<td>610,000</td>
			<td>327</td>
			<td>80,000</td>
			<td>367,000</td>
			<td>309</td>
			<td>80,000</td>
			<td>500,000</td>
			<td>260</td>
			<td>80,000</td>
			<td>115,000</td>
			<td>146</td>
		</tr><tr><td>82,500</td>
			<td>475,000</td>
			<td>463</td>
			<td>80,000</td>
			<td>455,000</td>
			<td>392</td>
			<td>80,000</td>
			<td>415,000</td>
			<td>204</td>
			<td>80,000</td>
			<td>470,000</td>
			<td>295</td>
			<td>80,000</td>
			<td>185,000</td>
			<td>161</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Her geçitte sayılan küre lerin sayısı ve kaplanmış ve sayılan hücre sayısı.
<img alt="Table 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60256/60256table2.jpg"> Tablo 2: Kaplamalı küre numaraları ile kümülatif küre ve hücre numaralarının hesaplanması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60256/Table2.xlsx" target="_blank">Bu tablonun daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Burada, in vitro mammosphere öz-yenileme nicel tahsin sonuçlarının uygulanması ve yorumlanması açıklanmaktadır.

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

Yani mammosphere kültürleri çalışma ve kanser meme kök hücre davranışlarında normal önemli yönlerini incelemek için kolay erişilebilir bir motor sistem sağlar, kendi kendini yenilemek ve ayırt etmek için yetenekleri de dahil olmak üzere. Kantitatif yaklaşımımız, mamografi kültürlerinin büyüme hızının objektif bir şekilde değerlendirilmesi ve farklı hücre tipleri ve koşullarının doğrudan karşılaştırılmasını amaçlamaktadır. İlk deneme için, ben sindirim üzerinde önlemek ve her kaplama önce doğru bir hücre sayımı sağlamak için kuluçka süreleri üzerinde sıkı bir kontrol tutmak tavsiye ederiz.Charolaise Bull'la prosedürü göstermek Errico D'Elia olacak, laboratuvarımdan bir teknisyen. 5 ila 30 dört karın ve alt torasik mammory bezleri hasat sonra, 8 ila 10 haftalık dişi fareler, DPBS en az hacimli 100 milimetre petri çanak başına 20 bezleri kadar yerleştirin. Küçük parçalar halinde dokuları kıyma ve parçalara sindirim ortamı 10 mililitre ekleyin.Doku parçalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik serolojik pipet kullanın ve tüpü parafin filmle kapatın. Daha sonra 0.03 X G'de bir rotator üzerindeki parçaları 37 derecede 2,5 saat ve nem oranı %5 karbondioksitle 2,03 X G'de kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, tüm parçalar P1000 pipet ucundan geçirilebiliyorsa, doku bulamacını santrifüj le tortulayabilir ve süpernatantı dikkatlice dekant.PBS'nin 3 mililitrelik peletini yeniden askıya alın ve tüp içeriğini bir 100, 170, 140 mikrometrelik hücre süzgecinden yeni bir konik tüpe sırayla süzün ve her süzgeç her filtreden sonra 2 mililitre taze DPBS ile yıkın. Pelet santrifüj ile hücreleri ve supernatant kalan DPBS hücreleri askıya decant. Hücreleri eşit hacimde amonyum klorür potasyum lisis tamponu ile karıştırın ve kırmızı kan hücrelerini 5 dakikaya kadar buz üzerinde karıştırın.Kuluçka sonunda, DPBS 10 mililitre ile lysis tutuklama ve santrifüj ile hücreleri toplamak. Beyaz bir pelet varlığını onaylayın ve geri sayım için mammosphere orta 1 ila 5 mililitre pelet askıya. Daha sonra hücreleri doku kültürü yle tedavi edilmeyen ultra düşük yapışma altı kuyu plakasına, 37 santigrat derecede 7 ila 10 günlük kuluçka için mililitre başına 5 ila 5 canlı hücreye yerleştirin.7 ila 10 günlük kültürün sonunda, hücre kültürü plakaher kuyudan birincil mammospheres toplamak ve cetrifugation ile mammospheres tortu. Süpernatant'ı dekantettikten sonra, mammospheres'i yaklaşık 100 kez pipetlemek için filtreli uçlu bir P200 pipet kullanın. Tek hücreli hastaların üretimi, yeni lability için mammosphere hücrenin doğru nicelik için kritik öneme sahiptir.Ayırmanın kapsamını görsel olarak inceleyin ve gerekirse hücre süzgecikullanın. Re sayma için taze mammosphere orta 1 ila 5 mililitre ile ilgisiz mammospheres askıya ve plaka 2 X 10 polihema kaplı ultra düşük yapışma altı iyi plakalar üzerinde mililitre başına dördüncü canlı hücrelere 5-7 günlük bir kültür için. Sonra, 5 ila 7 gün sonra, iyi başına küre sayısını saymak.Her pasajın sonunda, küreleri görüntülemek için tüm kuyuların tüm yüzeyini tetmek için stereoskop üzerine monte edilmiş bir dijital kamera kullanın. Görüntüleri tif dosyaları olarak kaydettikten sonra, stereoskop görüntülerini görüntü dizisi olarak ImageJ'e aktarın ve ölçeği ve görüntü türünü 8 bit olarak ayarlayın. Görüntü yığınını çoğaltın ve İşlem sekmesinden Arka Planı Çıkar'ı seçin.Işık arka planı ve Kayan paraboloid seçeneklerini kontrol edin ve yığının tüm görüntülerini işlemek için Tamam'ı tıklatın. Resim sekmesinden Ayarla ve Eşik'i seçin ve Uygula'yı tıklatın. Açılır pencere görüntülenir.Yöntem olarak Varsayılan'ı ve Arka Plan olarak Işık'ı seçin. Her görüntü kutusu için Hesapla eşleğini işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. Yığındaki tüm görüntüleri işlemek için Havza'yı seçin ve Evet'i tıklatın. Aç'ı seçin ve Evet'i tıklatın ve Erode'u seçin ve Evet'i tıklatın.Ardından, Analiz menüsünden Parçacıkları Analiz Et'i seçin ve minimum boyut eşiğini 10,000 mikrometre kare ve Daireselliği 0,50 ile 1,00 arasında ayarlayın. Açılan menüden Elips seçeneğini seçin ve Özetle, kenarlarda hariç tut ve yerinde Göster'i işaretleyin. Ardından yığının tüm görüntülerini işlemek için Tamam'ı tıklatın.Her geçiş için kümülatif büyüme eğrisini hesaplamak için, kaplamalı hücre sayısını ve küreler halinde sayılan hücre sayısını kaydedin ve her pasajın sonundaki küre boyutunu hesaplayın. Bir önceki pasajın sonunda hesaplanan küre boyutuna her geçiş için kaplanmış hücre sayısını bölerek, kaplama kürelerin sayısını çıkar. Her bir kuyu nun başına düşen kümülatif hücre numarasını ve her bir kuyu için her bir kuyu için kümülatif küre numarasını hesaplayın ve veri noktalarını yarı logaritmik ölçekte çizin.Sonra veri noktalarına bir üstel eğilim satırı ve uyum iyiliğini ölçmek için kararlılık katsayısını hesaplamak. Daha sonra kültürün büyüme hızını çıkarmak için doğal bir üstel fonksiyon olarak eğilim çizgisinin denklemini tasvir. Bu deneyde, üç bağımsız deney için ardışık beş pasajın küre ve hücre sayıları belirlendi.Burada kümülatif hücre ve geçiş başına küre numaraları gösterilir. Myc aktivasyonu gözlendiği gibi, artan küre ve hücre büyüme oranları yol açar. Hücre farklılaşmasını, göçlerini ve invazyonunu değerlendirmek için hücre toplama veya gen ekspresyonu analizi veya diğer fonksiyonel varlıkları gerçekleştirmek için biyolojik ve ilgili zaman noktaları seçilebilir.Bu, birden çok uygulama ile basit ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır. Örneğin, kanser kök hücre çoğalması ve kendini yenileme üzerindeki etkilerini ölçmek için doğrudan keşif kullanılabilir.

quantification-of-self-renewal-in-murine-mammosphere-cultures

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

HC11 lactogenic farklılaşma mammospheres olarak anılacaktır kubbeli yapıların oluşumu ile karakterize edilebilir. Yapılar, faz kontrast mikroskobu ile numaralandırılan lactogenic farklılaşma niceleme yardımcı olabilir.

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

Bu videoda, meme kanseri hücre hatlarından kanser kök hücrelerinin izole edilmesi anlatılmaktadır. Bu kanser kök hücrelerini, kendini yenilemeyi değerlendirmek ve küre oluşturma verimliliğini hesaplamak için birincil mamosferler oluşturmak üzere kültüre ediyoruz ve farklı tohumlama yoğunlukları arasında karşılaştırmaya izin veriyoruz.

Birincil Mamosferlerin Üretimi: Hücre Potansiyelini Belirlemek İçin Bir Teknik

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Yüzen mamosfer tahlilleri, süspansiyon koşullarında hayatta kalan ve farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşumu gösteren kök benzeri meme kanseri hücrelerinin alt kümesini araştırabilir.  Bu protokol, kök ile ilişkili transkripsiyonel manzaranın analizini kolaylaştırırken, in vivo tümörijenez için bir vekil olan küre oluşturma yeteneğinin uygun bir in vitro ölçümünü sağlar.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Rejeneratif tıp için çok önemli olduğunu somatik SCs hastalığı modelleme ve SC özellikleri anlayış kazanmak için. Burada yeniden programlamak için deneysel stratejiler mevcut, içinde vitro, yetişkin hücreler karşılık gelen Genişletilebilir doku özgü kök/progenitor hücreler tek transkripsiyon co aktivatörü YAP geçici ifade tarafından ayrıştırılan.

De Novo Somatik kök hücreleri tarafından YAP/TAZ nesil

İn vitro model sistemi, akciğer skuamöz karsinomu (LUSC) ilerlemesi sırasında kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF) 3 boyutlu (3D) bir ortak kültürde doku mimari değişikliklerini yakalamak için geliştirilmiştir. Bu organoid sistem tümör fenotip modüle çeşitli tümör hücre içsel ve dışsal değişikliklerin rollerini araştırmak için benzersiz bir platform sağlar.

Akciğer Skuamöz Karsinom Progresyonunu Modellemek Için Çok Boyutlu Coculture Sistemi

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu protokol, tümör olmayan meme epitel hücrelerinde Apoptoz İnhibörü 5 (Api5) tarafından indüklenen kanser kök noktasını incelemek için mamosfer oluşum testinin oluşturulma yöntemini açıklar. Birincil nesil mamutsferlerden toplanan lizatlar, kök hücre benzeri özelliklerin indüksiyonunu değerlendirmek amacıyla farklı kök belirteçleri için analiz edilir.

Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu

Keşfedin meme kanseri kök hücre davranışlarını incelemek için murine mammosphere kültürlerinde kendini yenileme niceliği yöntemini. Bu basit ve uygun maliyetli analiz, farklı hücre tiplerinin büyüme oranlarını karşılaştırmaya olanak tanır.

Murine Mammosphere Kültürlerde Kendini Yenileme Nin Niceliği

Daha fazla video keşfet