Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri
October 15th, 2019
Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.
Protokolümüz, mikrobiyom araştırmalarına ve antimikrobiyal keşiflere yardımcı olabilecek ilgi etkileşimlerini belirlemek için çok sayıda çift yönlü mikrobiyal etkileşimin birlikte taranması için yüksek bir üretim yöntemi sunmaktadır. Bu yöntem, mikroorganizmalar laboratuvar koşullarında kültüre sevimli olduğu sürece, çeşitli sistemlerdeki mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için kolayca uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanıcıların nispeten kısa bir süre içinde mikrobiyal etkileşimleri çok sayıda ekran sağlar.
Bu tekniğin yeni kullanıcıları zaman almalıdır, özellikle biyoassay plakaları aşılarken, aşırı büyüme veya kontaminasyonu en aza indirmek için dikkatli olmak çok önemlidir. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü biyoassay plakalarının aşılandırılması, organizmaların kuyuları aşmamasını ve ortak kültürlerin kirlenmemesini sağlamak için hassasiyet gerektirir. Bir gecede kültürler hazırlayarak başlayın.
14 mililitrelik kültür tüpleri içine BHI suyu üç mililitre eklemek için bir serolojik pipet kullanın. Sonra et suyu içine bir bakteri koloniaşılamak için steril bir mikrolitre aşılama döngü kullanın. Kümenin et suyuna dağılmasını sağlamak için döngüyü döndürün.
Kısaca kültür tüplerini girdap ve 250 RPM'de bir çalkalayıcıyla bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bakteri kültürleri bir od 600 yukarıda ulaşmak kez, onları girdap hücrelerin kümeleri kırmak için. PHI ortamını %1,5 agar ile hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.
Daha sonra ortamları sıcaklık kontrollü bir su banyosunda 55 dereceye kadar soğutun ve bir tabaktaki 12 kuyunun her birine üç mililitre erimiş BHI media dağıtın ve kuyuların mümkün olduğunca eşit olmasını sağlar. Sonra agar bir gecede ayarlamak için izin verin. Bir gecede kültür içine steril 10 mikrolitre aşılı döngü ekleyerek bir biyoassay plaka üzerinde test organizma aşılamak, ve iyi bir plaka nın sol üçte üzerinde kültür damlacık çizgili.
Plakadaki 12 kuyunun tümü aşılanana kadar tekrarlayın. Plakaları yedi gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı kuluçkaya yatırın. 37 santigrat derecenin üzerinde veya daha kuru iklimlerde kuluçkaya yalıyorsanız, kurumasını önlemek için plakaları nemli bir kapta saklayın.
Biyoassay plakasının altı günlük kuluçkadan sonra, daha önce açıklandığı gibi hedef organizmanın gece kültürlerini hazırlayın. BhI 1.8 mililitre ve hedef gece kültürü 200 mikrolitre ile boş bir 12-kuyu plaka her kuyu doldurarak hedef plaka hazırlayın. Hedef plakaya steril aşı damgası yerleştirin.
Yan kuyuları çapraz kirletmemelerini sağlayarak, kuyuların etrafındaki kültürleri yavaşça döndürün. Aşı lama damgasını kaldırın ve her pul ucunda seyreltilmiş hedef kültür damlacıkları olduğundan emin olun. Aşılama damgasını aşılanmamış bir biyoassay plakasına yerleştirin ve pulu nazikçe sallayın, böylece kültür damlacığı her kuyuyu aşılatır.
Pul kaldırıldıktan sonra, kuyularda bir kültür damlası görülmelidir. Aşı damgası ile aşılanan herhangi bir kuyu yoksa, bir pipet kullanarak kuyulara seyreltilmiş bir gecede kültür üç mikrolitre nokta. Daha sonra bioassay plakalarını daha önce açıklandığı gibi aşılama, ancak pulun mevcut bakteri kolonisiyle temas etmediğinden emin olmak için pul uçlarını 12 kuyulu plakanın sağ tarafıyla hizalayın.
Pulu dikkatlice çıkarın ve hedef plakaya geri yerleştirin. Agar kuyularda eşit olmayan bir şekilde katılaşmışsa, pulu yavaşça ileri geri sallayın, ancak damgayı test organizması büyümesine kaydırmamaya dikkat edin. Tüm plakalar aşılanana kadar her biyoassay plakası için aşıyı tekrarlayın, ardından plakaları yedi gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı kuluçkaya yatırın.
Bir hafta boyunca test ve hedef organizmayı bir arada yaptıktan sonra, görsel değerlendirmeye dayalı etkileşimleri puan. Tekkültürden ayırt edilemez bir büyüme gösteren hedef organizma büyümesi ile kuyuları sıfır olarak puan. Bir olarak azalmış büyüme ile kuyupuan ve iki olarak büyüme yok.
Burada açıklanan ortak kültür tahlilleri, insan burun boşluğundan izole edilmiş stafilokok türlerine doğru aktinobakteri test organizmalarının inhibitör aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Toplam 812 çift biliş test edildi. Özellikle, Corynebacterium propinquum kuvvetle koagülaz negatif stafilokoki inhibe, diğer Corynebacteria karşılaştırıldığında özellikle ya zayıf koagülaz negatif stafilokok inhibe veya hiçbir inhibitör etkisi yoktu.
Karşılaştırmalı genomik kullanımı sayesinde Corynebacterium propinquum genomunda siderofor üretimi için biyosentetik bir gen kümesi tanımlanmıştı. Standart ve demir takviyesi BHI ortamı kullanılarak yapılan co-kültür etkileşim iratları, Corynebacterium propinquum ve koagülaz negatif stafilokokları arasındaki inhibisyon fenotipinin aslında demire bağımlı olduğunu belirlemiştir. Plakayı damgalarken dikkatli olmak önemlidir.
Damgalamadan sonra her bir kuyuyu iki kez kontrol edin ve kontaminasyonu önlemek için aşılama damgasının doğru şekilde hizalandığından emin olun. İlgi etkileşimleri tespit edildikten sonra, mikrobiyal genetik ve genomik, doğal ürün izolasyonu ve karakterizasyonu veya bu etkileşimlerin altında yatan mekanizmaları karakterize etmek için görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak yapılan sonraki çalışmalar kullanılabilir. Bu protokol son zamanlarda insan nazal mikrobiyota arasında siderophore aracılı rekabet ortaya çıkarmak için kullanılan ve sifomisin denilen yeni bir antifungal molekülün keşfi yardımcı oldu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, mikrobiyal etkileşimleri taramakta kullanılan yüksek verimli bir yöntemi belirlemekte, mikrobiyota araştırmalarına ve antimikrobiyal keşfe yardımcı olmaktadır. Bu protokol, etkileşim paternlerinin gözlemlenmesini ve patojenlere karşı mikrobiyal türlerin karakterizasyonunu sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyal etkileşimler
- Mikrobiyota araştırmaları
- Antimikrobiyal keşif
Arka Plan
- Karışık kültür etkileşim testleri maliyet-etkili ve basittir.
- Yöntem çeşitli mikrobiyal sistemler için geçerlidir.
- İnokülasyondaki hassasiyet, kontaminasyonu önlemek için kritiktir.
- Görsel gösterimler tekniğin anlaşılmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- Önemli mikrobiyal etkileşimleri tanımlamak.
- Belirli türlerin inhibitör potansiyelini karakterize etmek.
- Mikrobiyota ve antimikrobiyal alanlardaki araştırmaları kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Gecelik kültürlerin hazırlanması.
- Biyotest plakalarının dikkatli inokülasyonu.
- Çift yönlü mikrobiyal etkileşimlerin taraması.
- Aşırı büyüme ve kontaminasyon izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Mikroplardan arasındaki etkileşim paternlerinin belirlenmesi.
- Antimikrobiyal özelliklere sahip türlerin karakterizasyonu.
- Yüksek verimli tarama verimliliği gösterilmiştir.
- Çeşitli mikrobiyal sistemlerde uygulanabilirliği doğrulanmıştır.
Sonuçlar
- Protokol, mikrobiyal etkileşimleri incelemek için etkilidir.
- Daha ileri mikrobiyota araştırmaları için bir temel sağlar.
- Güvenilir sonuçlar için dikkatli uygulama esastır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This high throughput co-culture assay enables rapid screening of pairwise microbial interactions, supporting early-stage target validation in antimicrobial discovery and microbiome research. By providing scalable, inexpensive phenotypic readouts, the method enhances predictive confidence in identifying inhibitory strains and de-risks lead identification pipelines. Its adaptability to diverse microbial systems positions it as a reusable discovery tool for prioritizing therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by screening pairwise interactions to identify antimicrobial activity against pathogens.
- Operational Value: Enables functional target validation through visual phenotypic scoring of growth inhibition or enhancement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by rapidly identifying strains with strong inhibitory effects, such as Corynebacterium propinquum against coagulase-negative staphylococci.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems using overnight cultures and 3D-printed inoculation stamps for reproducible co-culture setup.
- Scalability: Supports high throughput screening of hundreds of pairwise combinations, as demonstrated with 812 tested interactions.
- Quantitative Output: Generates scorable phenotypes (zero to two) based on visual assessment of growth inhibition, enabling comparative analysis across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase interaction screening to downstream mechanistic studies via genetics, genomics, or natural product isolation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates follow-up investigations, such as iron-dependency testing, to clarify mechanisms like siderophore-mediated competition.
- Preclinical Alignment: Supports culture-based microbiome research by modeling interactions in clinically relevant isolates, such as those from the human nasal cavity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, enabling rapid evaluation of microbial interactions before resource-intensive mechanistic or chemical characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by systematically evaluating inhibitory or stimulatory interactions between test and target organisms.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized inoculation and incubation protocols, minimizing variability.
- Analytics: Provides quantitative phenotypic measurements via visual scoring, allowing teams to rank interaction strengths and prioritize hits.
- Translational Research: Enables continuity to preclinical work by linking observed phenotypes to genetic or chemical determinants, such as biosynthetic gene clusters.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform capability applicable across multiple projects in antimicrobial discovery and microbiome modulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false positives through controlled co-culture conditions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via precise inoculation techniques and environmental controls (e.g., humid incubation).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by rapidly identifying high-priority microbial interactions, reducing investment in low-yield targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by supplying early phenotypic data to inform lead selection and mechanistic follow-up.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique and precision during inoculation to prevent cross-contamination and overgrowth.
- Depends on access to 3D-printed inoculation stamps and temperature-controlled incubation equipment.
- Necessitates standardized media preparation (e.g., BHI agar) and overnight culture protocols for consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to fastidious or slow-growing microorganisms requiring adjusted incubation times.
- Limited to culturable microorganisms, constraining applicability to uncultured or anaerobic strains without media optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Preparation of Overnight Cultures and Bioassay Plates
2:20
Inoculating Bioassay Plates with the Test Organism
2:58
Preparation and Inoculation of the Target Organism
5:02
Results: Co-culture Interaction Assays Uncover Siderophore-mediated Inhibition of Coagulase-negative staphylococci by Corynebacterium propinquum
6:06
Conclusion
