Name: Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Keşfedin, mikrobiyal etkileşimleri yüksek verimli tarama yöntemiyle inceleyerek antimikrobiyal keşif ve mikrobiyom araştırmalarına katkı sağlayın. Bu teknik, çeşitli mikrobiyal sistemlerde etkileşim kalıplarını belirlemek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Daniel May, Marc Chevrette ve Don Hoang'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Cameron R. Currie'nin çabaları da dahil olmak üzere bu çalışma, Wisconsin-Madison Üniversitesi, Araştırma ve Lisansüstü Eğitim Rektör Yardımcısı Ofisi tarafından Wisconsin Mezunlar Araştırma Vakfı'nın finansmanı ile desteklendi. Ulusal Sağlık Enstitüleri Çevirisel Araştırma Için Mükemmeliyet Merkezleri (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck Biyoloji ve Tıp Eğitim Programı (NLM 5T15LM007359) Hesaplama ve Enformatik eğitim hibe Tıp Milli Kütüphanesi tarafından desteklendi. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama da veya çalışmayı yayına sunma kararında hiçbir rolü yoktu.

Donörün ailesinden bilgilendirilmiş onay alındı ve Wisconsin-Madison Üniversitesi İnsan Denekleri Komitesi çalışmayı onayladı (Kurumsal İnceleme Kurulu [IRB] onay numarası H-2013-1044).
1. Örnek Kültür
NOT: Bu prosedür burada insan burun boşluğundan izole bakteriler arasındaki etkileşimlerin incelenmesi için kullanılır. Prensip olarak, aşağıdaki yöntemler herhangi bir kültür koşulu için geçerlidir. Beyin-kalp infüzyon suyu (BHI) burun bakterilerinin genel yayılması için kullanılır. Tüm plakalar% 1.5 agar kullanılarak katılaşmış. Bu çalışma için, numuneler bir donörün burnuna (burun lavajı) sifonlanmış, mikrosantrifüj tüplerine aktarılan ve -80 °C'de dondurulan tuzlu çözeltiden alınır.
<ol><li>Çözülmüş lavaj örneklerinin her birinin 100 μL'sini BHI plakalarına plakalamak için standart kültür tekniklerini kullanın.</li>
	<li>Plakaları aerobik olarak 37 °C'de 1 hafta kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, plaka başına her bir farklı morfotipten ≥2 koloni seçin ve bir koloniyi ilk plakadan yeni bir BHI plakasına geçirerek ve 37 °C'de plakayı kuluçkaya yatırarak BHI plakaları üzerinde aerobik olarak izole edin. Bakteri kültürleri saf olana kadar tekrarlayın. NOT: Bakteriyel izole koloni morfolojisi, gram boyama, 16S rRNA gen dizilemesi veya başka bir yöntemle tanımlanabilir. Ancak, protokolü devam etmek için yalıtma kimliğini bilmek gerekli değildir.</li>
	<li>Kriyokorun tüm bakteriyel izole -80 °C'de 1 mL 50 gliserol ile 1 mL bakterili gece kültürü (bkz. bölüm 3) kriyotüplerde birleştirdikten sonra.</li>
</ol>2. 3D Baskı Pulları
NOT: Polikarbonat, standart otoklav sıcaklığını (121 °C) aşan yüksek cam geçiş sıcaklığı (147 °C) nedeniyle damgalama malzemesi olarak seçilmiştir.
<ol><li>3D yazıcıyı polikarbonat filamentle yükleyin.</li>
	<li>Yapışmaya yardımcı olmak ve baskı sırasında aşı pulunun bükülmesini en aza indirmek için baskı yatağına beyaz okul tutkalı (polivinil asetat) uygulayın.</li>
	<li>Yükleyin. 3D yazıcı yazılımına aşı damgası(Şekil 1)için STL model dosyası (Tamamlayıcı Veri Dosyası).</li>
	<li>Aşılama damgasını 290 °C'lik meme sıcaklığında, 60 °C yatak sıcaklığına ve katman yüksekliği 0,38 mm'ye yazdırın.</li>
	<li>Damgayı alüminyum folyoya sarın ve 15 dk kurutma ile yerçekimi döngüsünde 1,5 saat otoklavlayarak sterilize edin. NOT: Polikarbonat higroskopik olmasına rağmen, pullar otoklavlama dan sonra sadece yaklaşık% 0.5 su ağırlığı korumak.</li>
</ol>3. Gece Kültürlerin Hazırlanması
<ol><li>Serolojik pipet kullanılarak, 14 mL kültür tüpüiçine steril BHI suyu 3 mL pipet.</li>
	<li>Steril 1 μL aşılama döngüsü kullanarak, bir bakteri kolonisini et suyuna aşıla. Kümenin et suyuna dağılmasını sağlamak için döngüyü döndürün. Kuluçkadan kısa bir süre önce kültür tüplerini girdap.</li>
	<li>Kültür tüplerini bir gecede 37 °C'de (~16 saat) 250 rpm'de bir çalkalayıcıya kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bakteri kültürleri yeterli bulanıklığa ulaştığında hücre kümelerini parçalamak için girdap (OD600 ≥ 1).</li>
</ol>4. Bioassay Plakalarının Hazırlanması
NOT: Bioassay plakaları steriliteyi korumak için laminar akış kaputunda hazırlanır.
<ol><li>% 1.5 agar ile BHI medya hazırlayın ve üretici talimatlarına göre otoklavlama tarafından sterilize.</li>
	<li>Otoklavlamadan sonra BHI ortamı sıcaklık kontrollü bir su banyosunda 55 °C'ye kadar soğutun.</li>
	<li>Serolojik pipet kullanarak, 12 kuyu plakalı 12 kuyunun her birine 3 mL erimiş BHI media pipet. Kuyuların mümkün olduğunca kesin ve eşit olduğundan emin olun. Bir litre medya ~ 27 bioassay plakaları verecektir.</li>
	<li>Agar'ın bir gecede ayarlanın.</li>
</ol>5. Biyoassay Plakalarını Test Organizması Ile Aşılama
NOT: Bir test organizması, inhibitör aktiviteüretiminin (örneğin, antibiyotik üretimi) ortak kültür etkileşimi testi kullanılarak belirlendiği organizmayı ifade eder. Bu deney için, test organizmaları nazal lavaj örneklerinden izole edilen Aktinobakterilerdir.
<ol><li>Bir gecede kültür içine steril 10 μL aşılama döngü ekleyerek ve iyi bir plaka nın sol üçte üzerinde bir kültür damlacık çizgili bir biyoassay plaka üzerinde test organizma aşılayın. NOT: Kuyunun büyümesinin daha sonra hedef organizmaların aşılanması yasakolduğundan, kuyunun sadece üçte birinin seri olması önerilir.</li>
	<li>Plakadaki 12 kuyunun tümü test organizması ile aşılanana kadar tekrarlayın.</li>
	<li>7 gün boyunca uygun sıcaklıkta ters plakalar inkübat. Daha yüksek sıcaklıklarda (≥37 °C) veya daha kuru iklimlerde, plakaların kurumasını önlemek için plakaları nemli bir kapta saklayın.</li>
</ol>6. Hedef Organizmaların Hazırlanması
NOT: Hedef organizma, inhibisyon durumu ortak kültür etkileşimi analizi kullanılarak belirlenen organizmayı ifade eder. Bu deney için, hedef organizmalar Staphylococcus spp. burun lavajörneklerinden izole edilir.
<ol><li>Bioassay plakalarını 6 gün kuluçkaya yatırdıktan sonra, yukarıda yapıldığı gibi, belirtilen hedef organizmaların gecekültürlerini hazırlayın (bkz. bölüm 3).</li>
</ol>7. Hedef Organizma Aşısı
NOT: Bir gece kuluçkadan sonra kültürlerin bulanık olduğundan emin olun (OD600 ≥ 1). Bazı bakteri kültürleri kültür tüpünün alt kısmında flocculate olabilir. Girdap kümeleri dağıtmak ve kültür bulanıklık değerlendirmek için kültür tüpleri.
<ol><li>1.8 mL BHI ve 200 μL'lik boş 12 kuyu plakasının her kuyusunu doldurarak hedef plakayı hazırlayın.</li>
	<li>Savurun ve hedef plakaya steril aşı damgası yerleştirin. Kültürlerin komşu kuyuları kirletmemesini sağlamaya özen leyerek, kuyuların etrafındaki kültürleri yavaşça döndürün.</li>
	<li>Aşı lama damgasını kaldırın ve her pul ucunda seyreltilmiş hedef kültür damlacıkları olduğundan emin olun.</li>
	<li>
Aşıpulu aşıpulu aşısız bir biyoassay plakasına yerleştirerek monokültür kontrol plakası hazırlayın ve bir kültürün her kuyuyu aşılayabilmesi için pulu hafifçe sallayın. Aşılama damgası kaldırıldıktan sonra, biyoassay plakasının kuyularında bir kültür damlası görülmelidir.
	<ol>
<li>Ortam eşit olmayan düzeylerde nisblü bir kuyu aşılanmamışsa, bir pipet kullanarak kuyuların sağ tarafına seyreltilmiş gece kültürünün 3 μL'sini noktalandırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yukarıda yapıldığı gibi bioassay plakaları aşılamak (adım 7.4.1 bakınız), ancak uçları 12 kuyu plakasağ tarafı ile hizalamak böylece damga hizalayın. Kuyulara aşı yaparken damganın mevcut bakteri kolonisi ile temas etmediğinden emin olun.</li>
	<li>Pulu dikkatlice çıkarın ve hedef plakaya geri yerleştirin.</li>
	<li>Tüm plakalar aşılanana kadar her biyoassay plakası için aşıyı tekrarlayın.</li>
	<li>7 gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı bioassay plakaları inkübat.</li>
</ol>8. Puanlama
<ol><li>
Test ve hedef organizmaların 1 hafta boyunca birlikte çalışmasından sonra, aşağıdaki görsel değerlendirmeye dayanarak etkileşimleri puanlar:
	<ol>
<li>Monokültür kontrolünden ayırt edilemeyen büyümeyi gösteren hedef organizma büyümesi ile kuyuları "0" (inhibisyon yok) olarak puan(Şekil 2A,B).</li>
		<li>Kontrole göre azalmış büyüme gösteren hedef organizmaile kuyuları "1" (zayıf inhibisyon)(Şekil 2C)olarak puanlandırın.</li>
		<li>Hedef organizmanın "2" (güçlü inhibisyon) olarak büyümediği kuyuları puanlayın (Şekil 2D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Communities%3A+Interactions+to+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Communities: Interactions to Scale.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234(2016).</li>
<li>Green, J., Bohannan, B. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scaling+of+microbial+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Spatial scaling of microbial biodiversity.</a> Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).</li>
<li>Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Antibacterial+Action+of+Cultures+of+a+Penicillium%2C+with+Special+Reference+to+their+Use+in+the+Isolation+of+B.+influenz%C3%A6%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ.</a> British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226(1929).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+from+Lethal+Bacterial+Competition+through+Coupled+Activation+of+Antibiotic+Resistance+and+a+Mobilized+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation.</a> PLoS Genetics. 11 (12), e1005722(2015).</li>
<li>Zipperer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+commensals+producing+a+novel+antibiotic+impair+pathogen+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization.</a> Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).</li>
<li>Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungus-growing+ants+use+antibiotic-producing+bacteria+to+control+garden+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites.</a> Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).</li>
<li>Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+in+vitro+evaluating+antimicrobial+activity%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).</li>
<li>Heatley, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+assay+of+penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A method for the assay of penicillin.</a> The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Performance+standards+for+antimicrobial+disk+susceptibility+tests%3B+approved+standard+-11th+ed.+CLSI+document+M02-A11%22">Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, Pennsylvania. (2012).</li>
<li>Adnani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+of+Marine+Invertebrate-Associated+Bacteria+and+Interdisciplinary+Technologies+Enable+Biosynthesis+and+Discovery+of+a+New+Antibiotic%2C+Keyicin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin.</a> ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).</li>
<li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+iChip+for+high+throughput+in+situ+cultivation+of+%26%2334%3Buncultivable%26%2334%3B+microbial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of iChip for high throughput in situ cultivation of &#34;uncultivable&#34; microbial species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li>
<li>Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+DJ+%22Microbiology+%28Reading%2C+England%29%22">Microbiology (Reading, England)</a>. 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).</li>
<li>Hoefler, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+resistance+to+the+lipopeptide+surfactin+as+identified+through+imaging+mass+spectrometry+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).</li>
<li>Hoefler, B. C., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry%2C+Metabolism%2C+and+New+Views+of+the+Microbial+World%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Products+Analysis%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World.</a> Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+metabolic+exchange+with+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+among+Nasal+Bacteria+Suggests+a+Role+for+Siderophore-Mediated+Interactions+in+Shaping+the+Human+Nasal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).</li>
<li>Winkelmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+siderophore-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Microbial siderophore-mediated transport.</a> Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).</li>
<li>Chevrette, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+potential+of+Streptomyces+from+insect+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes.</a> Nature Communications. 10 (1), 516(2019).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları beyan.

Antibiyotikler ve mikrobiyal etkileşimler aracılık diğer ikincil metabolitleri ilaç keşfi de dahil olmak üzere çok sayıda uygulama için yararlıdır. Burada, çok sayıda mikrobiyal etkileşimi değerlendirmek için ortak kültür tahlilleri için bir protokol sunulmuştur. Bu ortak kültür etkileşim iratları basit, uygun fiyatlı, ölçeklenebilir ve yüksek iş elde etme anlamına gelir, birlikte mikroorganizmaların birçok çift yönlü kombinasyonları araştırmak anlamına gelir. Hedef organizmalar, aşı damgası kullanılarak 12 kuyuluktaki b...

Doğada, mikroorganizmalar nadiren izole olarak bulunurlar; sonuç olarak, sürekli diğer organizmalar ile etkileşim vardır. Bu nedenle, mikroorganizmaların birbirleriyle nasıl etkileştiğini incelemek çok sayıda mikrobiyal davranışı anlamak için gereklidir1. Mikrobiyal etkileşimler karşılıklı, commensal veya antagonistik olabilir. Bu teractions sadece mikroorganizmaların kendilerini etkileyebilir ama aynı zamanda ortamlar ve barındıran mikroorganizmalar1,2kolonize .
Birçok bilim adamı yeni antimikrobiyal molekülleri tanımlamak için mikrobiyal etkileşimleri çalışma. Klinik olarak önemli ilk antimikrobiyal moleküllerden biri mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi ile bulunmuştur. Sir Alexander Fleming bir kontamine Penisilyum spp gözlenen bir Staphylococcus suşu büyümesini inhibe izole, hangi yaygın olarak kullanılan antibiyotik penisilin keşfine yol açtı3. Mikroorganizmaların rakiplerini kızdırmak için kullandıkları mekanizmaların karakterizasyonu antimikrobiyal moleküllerin keşfi için verimli bir kaynak olmaya devam etmektedir. Örneğin, son zamanlarda Streptomyces sp. suş Mg1 antibiyotik linearmycins üretir gösterilmiştir, Hangi Bacillus subtiliskarşı bir litik ve bozsal aktiviteye sahip4.
Ayrıca, non-ribozomally sentezlenmiş peptid lugdunin adlı son zamanlarda burun kommensal Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus aureusinhibe gözlem sonra keşfedildi5. Çalışmalar ayrıca mikroorganizmalar arasındaki karşılıklı etkileşimlerin antimikrobiyal moleküllerin keşfi için antagonistik etkileşimler kadar güçlü olduğunu göstermiştir. Örneğin, kabile Attini birçok mantar tarım karıncalar kendi mantar ürün zorunlu bir patojen inhibe etmek için antifungal molekülleri üreten dış iskelet üzerinde Pseudonocardia denilen simbiyotik bakteriler liman6. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi antimikrobiyal moleküllerin keşfi için yararlı olmuştur, yüksek iş elde ekranlarının kullanımı yeni antimikrobiyal moleküllerin keşfi ne neden olabilir.
Maliyet ve performans kolaylığı ile ilgili olarak, mikrobiyal etkileşimleri incelemek için kullanılan metodolojiler basitten komplekse kadar değişmektedir. Örneğin, bir agar fiş tsay birden fazla mikroorganizmalar arasında antagonizm araştırmak için kullanılabilecek ucuz ve basit bir yöntemdir7. Ancak, bir agar fiş teşp verimli bir prosedür değildir ve birçok çift yönlü kombinasyonları için emek yoğun olabilir. Mikrobiyal olarak üretilen ürünlerin yüksek iş akışı açısından hedef izolasyonlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için birçok laboratuvar 8diskdifüzyon tahlilleri kullanmalıdır. Bu tahliller kolay ve ucuzdur ve7. Ancak, bu tahnı mikrobiyal özlerin nesil gerektirir ve hedef organizmalar ve antibiyotiklerin belirli kombinasyonları için yanıltıcı sonuçlar üretebilir, Salmonella ve sefalosporinler gibi9.
Önceki yaklaşımlar, mikroorganizmaların birbirleriyle etkileşime girmesine izin vermek yerine, hedef organizmada bir tepki ortaya çıkarmak için izole bileşenlere dayanır. Mikroplar arasındaki etkileşimler monokültürde üretilmeyen "şifreli" antimikrobiyal moleküllerin üretimini ortaya çıkarmak olabilir, çünkü bu dikkat budur. Örneğin, son zamanlarda antimikrobiyal keyicin sadece bir Micromonospora sp tarafından üretilen gösterilmiştir. eş-aynı sünger mikrobiyom izole edilir bir Rhodococcus sp. ile kültürlü10. Daha karmaşık etkileşim metodolojileri bu potansiyel monokültür engelini aşar. Örneğin, iChip nadir ve zor çevresel örneklerden bakteri yetiştirmek için izole etmek için yararlıdır ve yerinde büyüme yoluyla mikrobiyal etkileşimlerin gözlem sağlar11. Etkileşimleri ayrıntılı olarak araştırmak için matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon zaman-of-flight görüntüleme kütle spektrometresi (MALDI-TOF-IMS) kullanılabilir. Bu yaklaşım, mikrobiyal kolonilerin yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip etkileşiminde bulunan küçük molekül ve peptidlerin bileşimi ve dağılımı hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. MALDI-TOF-IMS de rekabet mekanizmaları karakterize etmek için bakteriyel etkileşimleri birden fazla çalışmada kullanılmıştır12,13,14,15. Ancak, MALDI-TOF-IMS genellikle zahmetli numune hazırlama, ekipman çalıştırmak için özel uzmanlık ve pahalı ve özel kütle spektrometregerektirir. Bu nedenlerden dolayı, yüksek iş artışı çalışmaları için kullanımı zor bir tekniktir. Böylece, yukarıdaki yaklaşımların birçok sınırlamasını aşan mikrobiyal etkileşimler için basit, ölçeklenebilir ve yüksek iş ortağı ortak kültür tayini yararlı olacaktır.
Burada, yüksek iş artışı mikrobiyal co-kültür için bir protokol sunulmaktadır. Bu tetki basit ve kolayca mikrobiyal etkileşimler önceden varolan çalışmalara dahil edilmiştir. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan birçok yöntemin aksine, yöntemimiz basit, ucuz ve çok sayıda etkileşimin araştırılmasıiçin uygundur. Bu tahlilleri gerçekleştirmek sadece kolay değil, aynı zamanda malzemelerin çoğu laboratuvar tedarikçisi veya kamu kaynaklarından (örn. kütüphaneler ve makerspaces) yaygın olarak mevcuttur. Sonuç olarak, bu araştırma, mikroorganizmaların birçok çift yönlü kombinasyonları arasında ilginç desenleri belirlemek ve ayrıştırmak için ilk araştırma satırı olarak avantajlıdır, mikrobiyal ekolojinin araştırılması nda özellikle yararlı olabilecek.

<table><tbody><tr><td>1 &mu; L tek kullanımlık polistiren aşılama döngüleri, mavi</td><td>VWR</td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>10 & mu; L tek kullanımlık polistiren aşılama döngüleri, sarı</td><td>VWR</td><td>12000-810</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu hücre kültürü plakası, kapaklı steril</td><td>Greiner bio-one</td><td>665 180</td><td></td></tr><tr><td>14 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp, 17 x 100 mm 2style, pirojenik olmayan, steril</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>2.0 kapaklı kendinden duran vidalı kapaklı tüpler, steril</td><td>ABD bilimsel</td><td>1420-9710</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serolojik pipet</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>Agar, bakteriyolojik</td><td>VWR</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kalp İnfüzyonu Suyu</td><td>Dot Scientific</td><td>DSB11000-5000</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat filament, beyaz, 3 mm çap</td><td>Keene Village Plastics</td><td>12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Okul Tutkalı</td><td>Elmer'in</td><td>EPIE304</td><td></td></tr><tr><td>Taz 6 3D yazıcı</td><td>Lulzbot</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikrobiyal etkileşimlerin İncelemi için yüksek İş-İş ortağı tahlilleri

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

Mikroorganizmalar arasındaki etkileşimlerin incelenmesi, yeni antimikrobiyallerden mikrobiyal ekolojideki içgörülere kadar çok sayıda keşfe yol açmıştır. Mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesinde kullanılan birçok yaklaşım özel ekipman gerektirir ve pahalı ve zaman yoğundur. Bu makale, ucuz, büyük örnek sayılara ölçeklenebilir ve çok sayıda deneysel tasarımlara kolayca uyarlanabilen ortak kültür etkileşim idermeleri için bir protokol sunar. Mikroorganizmalar birlikte kültürlenir, her biri mikroorganizmaların bir çift taraflı kombinasyonunu temsil eder. Bir test organizması her kuyunun bir tarafında kültürlenir ve ilk olarak monokültürde kuluçkaya yatırılır. Daha sonra, hedef organizmalar aynı anda her kuyunun karşı tarafına 3D baskılı aşı damgası kullanılarak aşılanır. Ortak kültürden sonra, tamamlanan tahliller büyüme veya inhibisyon gibi görsel fenotipler için puanlandırılır. Bu tahliller fenotipleri onaylamak veya ilgi izole arasında desenleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu basit ve etkili yöntemi kullanarak, kullanıcılar mikroorganizmaların kombinasyonlarını hızlı ve verimli bir şekilde analiz edebilirler. Bu ortak kültür yaklaşımı antibiyotik keşfi nin yanı sıra kültür tabanlı mikrobiyom araştırmaları için de geçerlidir ve her iki uygulamaya da başarıyla uygulanmıştır.

Ortak kültür etkileşimi tahlilleri mikrobiyal etkileşimleri anlamak, ilgi kalıplarını belirlemek ve ilginç etkinliklerle mikrobiyal izolasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu tahlillerde, bir test organizması 12 kuyulu agar plakanın bir tarafında monokültürlü ve 7 gün boyunca kuluçkaya yatırılır. Daha sonra, bir hedef organizma test organizmasının yanında tespit edilir ve iki mikrop hedef organizmanın büyüme fenotip için puanlama önce 7 gün boyunca birlikte kültürlendi. Tahlill...

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Protokolümüz, mikrobiyom araştırmalarına ve antimikrobiyal keşiflere yardımcı olabilecek ilgi etkileşimlerini belirlemek için çok sayıda çift yönlü mikrobiyal etkileşimin birlikte taranması için yüksek bir üretim yöntemi sunmaktadır. Bu yöntem, mikroorganizmalar laboratuvar koşullarında kültüre sevimli olduğu sürece, çeşitli sistemlerdeki mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için kolayca uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanıcıların nispeten kısa bir süre içinde mikrobiyal etkileşimleri çok sayıda ekran sağlar.Bu tekniğin yeni kullanıcıları zaman almalıdır, özellikle biyoassay plakaları aşılarken, aşırı büyüme veya kontaminasyonu en aza indirmek için dikkatli olmak çok önemlidir. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü biyoassay plakalarının aşılandırılması, organizmaların kuyuları aşmamasını ve ortak kültürlerin kirlenmemesini sağlamak için hassasiyet gerektirir. Bir gecede kültürler hazırlayarak başlayın.14 mililitrelik kültür tüpleri içine BHI suyu üç mililitre eklemek için bir serolojik pipet kullanın. Sonra et suyu içine bir bakteri koloniaşılamak için steril bir mikrolitre aşılama döngü kullanın. Kümenin et suyuna dağılmasını sağlamak için döngüyü döndürün.Kısaca kültür tüplerini girdap ve 250 RPM'de bir çalkalayıcıyla bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bakteri kültürleri bir od 600 yukarıda ulaşmak kez, onları girdap hücrelerin kümeleri kırmak için. PHI ortamını %1,5 agar ile hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.Daha sonra ortamları sıcaklık kontrollü bir su banyosunda 55 dereceye kadar soğutun ve bir tabaktaki 12 kuyunun her birine üç mililitre erimiş BHI media dağıtın ve kuyuların mümkün olduğunca eşit olmasını sağlar. Sonra agar bir gecede ayarlamak için izin verin. Bir gecede kültür içine steril 10 mikrolitre aşılı döngü ekleyerek bir biyoassay plaka üzerinde test organizma aşılamak, ve iyi bir plaka nın sol üçte üzerinde kültür damlacık çizgili.Plakadaki 12 kuyunun tümü aşılanana kadar tekrarlayın. Plakaları yedi gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı kuluçkaya yatırın. 37 santigrat derecenin üzerinde veya daha kuru iklimlerde kuluçkaya yalıyorsanız, kurumasını önlemek için plakaları nemli bir kapta saklayın.Biyoassay plakasının altı günlük kuluçkadan sonra, daha önce açıklandığı gibi hedef organizmanın gece kültürlerini hazırlayın. BhI 1.8 mililitre ve hedef gece kültürü 200 mikrolitre ile boş bir 12-kuyu plaka her kuyu doldurarak hedef plaka hazırlayın. Hedef plakaya steril aşı damgası yerleştirin.Yan kuyuları çapraz kirletmemelerini sağlayarak, kuyuların etrafındaki kültürleri yavaşça döndürün. Aşı lama damgasını kaldırın ve her pul ucunda seyreltilmiş hedef kültür damlacıkları olduğundan emin olun. Aşılama damgasını aşılanmamış bir biyoassay plakasına yerleştirin ve pulu nazikçe sallayın, böylece kültür damlacığı her kuyuyu aşılatır.Pul kaldırıldıktan sonra, kuyularda bir kültür damlası görülmelidir. Aşı damgası ile aşılanan herhangi bir kuyu yoksa, bir pipet kullanarak kuyulara seyreltilmiş bir gecede kültür üç mikrolitre nokta. Daha sonra bioassay plakalarını daha önce açıklandığı gibi aşılama, ancak pulun mevcut bakteri kolonisiyle temas etmediğinden emin olmak için pul uçlarını 12 kuyulu plakanın sağ tarafıyla hizalayın.Pulu dikkatlice çıkarın ve hedef plakaya geri yerleştirin. Agar kuyularda eşit olmayan bir şekilde katılaşmışsa, pulu yavaşça ileri geri sallayın, ancak damgayı test organizması büyümesine kaydırmamaya dikkat edin. Tüm plakalar aşılanana kadar her biyoassay plakası için aşıyı tekrarlayın, ardından plakaları yedi gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı kuluçkaya yatırın.Bir hafta boyunca test ve hedef organizmayı bir arada yaptıktan sonra, görsel değerlendirmeye dayalı etkileşimleri puan. Tekkültürden ayırt edilemez bir büyüme gösteren hedef organizma büyümesi ile kuyuları sıfır olarak puan. Bir olarak azalmış büyüme ile kuyupuan ve iki olarak büyüme yok.Burada açıklanan ortak kültür tahlilleri, insan burun boşluğundan izole edilmiş stafilokok türlerine doğru aktinobakteri test organizmalarının inhibitör aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Toplam 812 çift biliş test edildi. Özellikle, Corynebacterium propinquum kuvvetle koagülaz negatif stafilokoki inhibe, diğer Corynebacteria karşılaştırıldığında özellikle ya zayıf koagülaz negatif stafilokok inhibe veya hiçbir inhibitör etkisi yoktu.Karşılaştırmalı genomik kullanımı sayesinde Corynebacterium propinquum genomunda siderofor üretimi için biyosentetik bir gen kümesi tanımlanmıştı. Standart ve demir takviyesi BHI ortamı kullanılarak yapılan co-kültür etkileşim iratları, Corynebacterium propinquum ve koagülaz negatif stafilokokları arasındaki inhibisyon fenotipinin aslında demire bağımlı olduğunu belirlemiştir. Plakayı damgalarken dikkatli olmak önemlidir.Damgalamadan sonra her bir kuyuyu iki kez kontrol edin ve kontaminasyonu önlemek için aşılama damgasının doğru şekilde hizalandığından emin olun. İlgi etkileşimleri tespit edildikten sonra, mikrobiyal genetik ve genomik, doğal ürün izolasyonu ve karakterizasyonu veya bu etkileşimlerin altında yatan mekanizmaları karakterize etmek için görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak yapılan sonraki çalışmalar kullanılabilir. Bu protokol son zamanlarda insan nazal mikrobiyota arasında siderophore aracılı rekabet ortaya çıkarmak için kullanılan ve sifomisin denilen yeni bir antifungal molekülün keşfi yardımcı oldu.

high-throughput-co-culture-assays-for-investigation-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Ali, I. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans sağlığına etkisi olan mikrobiyal izolatların yüksek verimli taraması. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, Caenorhabditis elegans'ta bağırsak bakterilerinin stres direncini nasıl etkilediğini değerlendirmek için yüksek verimli bir floresan testi göstermektedir. Patlamış bağırsak granüllerinden mavi floresansı takip ederek, test bakterilerine maruz kalan solucanlarda daha erken ölüm sinyallerini ortaya çıkarıyor.

Mikrop-Solucan Etkileşimlerini İncelemek İçin Yüksek Verimli Floresan Tahlil

Kaynak: Temkin, M. I. ve diğerleri. Mikrobiyal etkileşimlerin araştırılması için yüksek verimli ortak kültür testleri. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, Corynebacterium propinquum ile Staphylococcus arasındaki mikrobiyal etkileşimleri bir ortak kültürde incelemek için in vitro testi sunmaktadır.

Ortak kültürde Mikrobiyal Etkileşimleri Araştırmak İçin Vitro Bir Analiz

Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Bu yöntem makalesinde, bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkisi olan ozmolitler gibi kimyasal bileşikleri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama stratejisi sunuyoruz.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Bu protokol, fotoototrofik şeker salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mayalar dahil olmak üzere ko-kültürlerin kurulumu ve kantitatif izlenmesi için kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Keşfedin, mikrobiyal etkileşimleri yüksek verimli tarama yöntemiyle inceleyerek antimikrobiyal keşif ve mikrobiyom araştırmalarına katkı sağlayın. Bu teknik, çeşitli mikrobiyal sistemlerde etkileşim kalıplarını belirlemek için uygulanabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Daha fazla video keşfet