Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Özel yapım fotoakustik akış sistemi ve hedeflenen folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri kullanarak dolaşan yumurtalık tümör hücrelerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Mevcut klinik over kanseri tespit önlemleri nonspesifik ve dolaşımdaki tümör hücrelerinin bakım noktası eksikliği. Fotoakustik akış sistemimiz, kan dolaşımındaki belirli yumurtalık kanseri belirteçleri için hasta örneklerinin test edilmesini sağlar. Bu yordam, basitlik, düşük maliyet, umut verici algılama sınırları ve geniş uygulamalara uygulanabilme açısından mevcut teknikler üzerinde iyileştirmeler ile benzersiz bir platform teknolojisi sağlar.

Bu çalışma ile, btcs için ex vivo hasta örnekleri test etmek için yumurtalık kanseri için hedeflenen nanopartikül sistemi inşa etmek hedefliyoruz. Bu çok yönlü PAFC sistemi klinik kullanım için genişletmek mümkün, kanda biyobelirteçleri geniş bir yelpazede varlığını test. Uygun optik hizalama, fotoakustik akış sitometri sistemi içindeki hedeflerin tespiti için çok önemlidir.

Ayrıca, uygun akustik bağlantı sağlamak için, cam slayt ve transdüser arasında kabarcıklar olmadığından emin olun. Akış sisteminin ve bileşenlerinin özel doğası nedeniyle, yöntemin görselleştirilmesi doğru üreme için yararlıdır. Havalandırılan kimyasal duman kaputunda, steril 0,2 mikrometrelik bir filtreden yaklaşık 300 mililitre deiyonize suyu filtreleyin.

Bir milimolar bakır klorür çözeltisi oluşturmak için temiz bir 250 mililitre yuvarlak alt şişeye 0,0134 gram bakır klorür ve 100 mililitre deiyonize su ekleyin. Şişeye 0,015 gram folik asit ekleyin ve çözeltiyi yaklaşık beş dakika karıştırmak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Daha sonra 0,024 gram sodyum sülfür içermeyen 100 mikrolitre deiyonize su ile karıştırın.

Yaklaşık 10 saniye boyunca reaksiyon karışımına bu çözümü yavaş yavaş eklemek için 200 mikrolitrelik pipet kullanın. Reaksiyon kabını kapla. 90 derece santigrat dereceye ayarlanmış bir yağ banyosu gemi yerleştirin ve karıştırmaya devam edin.

Yaklaşık 15 dakika sonra veya yağ banyosu 85 ve 90 santigrat derece arasında sıcaklık aralığına ulaştığında, reaksiyon ek bir saat devam etmek için izin. Reaksiyon tamamlandığında, reaksiyon kabını yağ banyosundan çıkarın ve buz banyosuna aktarmadan önce oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika soğumaya bırakın. Reaksiyon soğuduktan sonra, bir azı lı sodyum hidroksit kullanarak pH'ı yaklaşık 10'a ayarlayın.

Reaksiyon karışımını arındırmak için karışımı 15 mililitrelik gruplar halinde 30 kilodalton santrifüj sütununa ve 3, 082 kez g'de 15 dakika boyunca ekleyin. İlk olarak, folik asit kapaklı bakır sülfür nano tanecikleri taze RPMI ortamda uygun konsantrasyonda karıştırın. Bu nanopartikül çözeltisini, mililitrede 400 mikrogram konsantrasyonda SK-OV-3 hücrelerini içeren hazırlanmış 24 kuyulu plakanın her kuyuya ekleyin.

37 derecede iki saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yat. Bundan sonra hücreleri 0,5 mililitre 0.25 tripsin ve EDTA ile deneyin. Tripsin nötralize etmek için, folik asitiçermeyen RPMI 1640 tam büyüme ortamı en az bir mililitre ekleyin ve altı dakika boyunca 123 kez g hücreleri santrifüj.

Hücreleri yıkamak için, supernatant çıkarın, PBS iki mililitre hücreleri yeniden askıya ve santrifüj 123 kez g altı dakika boyunca. Herhangi bir bağlı olmayan nano tanecikleri kaldırmak için bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın. Daha sonra PBS'de %2'lik bir ara çözeltinin bir ila iki mililitresi ile hücreleri yeniden askıya alın.

Hücreleri hemositometre ve Trippan Mavisi kullanarak say. PBS'de %2'lik bir çözeltideki hücreleri algılama için seçilen konsantrasyona seyreltin. ABS termoplastik veya PLA plastik ile akış tankı 3D yazdırmak için sağlanan üç boyutlu STL dosyasını kullanın.

Tankı yazdırdıktan sonra, sistemi temizleyin ve kullanmak üzere monte edin. Üç milimetrelik yuva ve akış sisteminde bir santimetre delik bir milimetre üzerinde cam kapakları yerleştirin ve sızıntıyı önlemek için silikon ile dikkatlice mühür. Daha sonra, silikon tedavi tüpler içine kılcal tüp sığdırın.

Tüpleri akış tankının yan tarafına, cam kılcal borunun üç milimetrelik yuvanın ve bir santimetrelik deliğin hemen üstünde ve önünde olacak şekilde yerleştirin. Boruyu silikonla kapatın. Sonra bir ultrason darbeci ve alıcıya transdüser bağlayın.

Sinyali 59 desibel kazançla yükseltin. Filtrenin çıktısını, dahili alan programlanabilir geçit dizisiyle donatılmış çok amaçlı yeniden yapılandırılabilir bir osiloskopa bağlayın. Akış odasından gelen tüplerden birini, her daldaki iki şırınga pompasına bağlı bir T kavşağına bağlayın.

Şırınga pompalarından birini havayla, diğer pompayı da analiz edilecek numuneyle doldurun. Hava içeren pompayı dakikada 40 mikrolitre lik bir akış hızına ayarlayın ve numuneyi içeren pompayı dakikada 20 mikrolitre akış hızına ayarlayın. Daha sonra, akış sisteminden çıkan kalan tüpü akış sisteminden çıktıktan sonra hücreleri bertaraf etmek için %10 çamaşır suyu kabına bağlayın.

Kuvars kılcal borunun bölümünü mikroskobun alan görünümünde transdüserile doğrudan hizaya yerleştirin, böylece optik fiberin tüpün tüm genişliğini aydınlatacak şekilde numunenin üzerine dikkatli bir şekilde yerleştirin. 1, 053 nanometre dalga boyunda çalışan diyot pompalı katı hal lazer kanalize bir optik fiber kullanarak örnek ışınlamak. Akış, lazer ateş ve akış sistemi üzerinden örneklerin geçişi kaydetmek için bir mikroskop monte kamera kullanın.

Bu çalışmada yumurtalık dolaşan tümör hücrelerini saptamak için fotoakustik akış sitometrisi ve hedeflenen bakır sülfür hedefleme ajanı kullanılmıştır. Sentezlenen nano partiküllerin tipik bir TEM görüntüsü, tipik bir nanopartikülün ortalama boyutunun yaklaşık 8,6 nanometre olduğunu göstermektedir. Her parçacığın yatay ve dikey çapları daha sonra birbirine dik olarak ölçülür ve daha da ortalamaya dayanır.

Bu parçacıklar için ortalama hidrodinamik çapı 73.6 nanometredir. Bakır sülfür nano tanecikleri yakın kızılötesi içine uzanan bir karakteristik emme eğrisi var. Spektrofotometre ile lazerlerin değiştirilmesinden kaynaklanan 850 nanometre civarında hafif bir obje vardır.

Floresan mikroskobu görüntüleri floresan etiketli nano tanecikleri ile kuluçkaya yatan hücreler, nanopartikül alımının hücre genelinde floresan varlığı ile görüntülenebilen olduğunu göstermektedir. Nano partiküllerle kuluçkaya yatırılamayan hücreler floresan sinyal göstermez. Bu floresan sinyalin varlığı parçacıkların başarılı alımını ve akış sisteminde tespit edilme yeteneklerini gösterir.

Tipik veri toplama sinyalleriörnekleri burada gösterilmiştir. Ham veriler nanopartikül etiketli hücreler, PBS ve folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri arasındaki sinyal farklılıklarını gösterir. Özel laboratuvar görünümü ve MATLAB yazılımı kullanılarak, görüntü rekonstrüksiyonları sırasıyla gerçek zamanlı ve satın alma sonrası olumlu ve negatif kontroller yapılır.

Tek tek zarfçılar daha sonra piksel değerlerine dönüştürülür ve bağımsız sütunlar olarak görüntülenir. Mililitre başına 100 mikrogram konsantrasyonda PBS ile folik asit kaplı bakır sülfür nano tanecikleri arasında fotoakustik sinyalde net farklar oluşur. Bu işlem sırasında ultrason transdüserinin, mikroskopun ve fiber optikin fotoakustik akış sitometri sistemi içinde düzgün bir şekilde hizaya getirmek çok önemlidir.

Pozitif ve negatif denetimleri test ederek sistem hizalanmasını onaylayın. Fotoakustik hedefleme tekniklerinin çok yönlülüğü ve PAFC kullanılarak mümkün olan çok çeşitli uygulamalar nedeniyle, bu teknik çeviri açısından önemli klinik ve araştırma uygulamalarının önünü açmektedir. Klinik uygulamayı sağlamak için, ileri çalışmalar hasta örneklerinin test edilmesi ve prosedürel adımların azaltılması üzerinde odaklanmalıdır.

Nano taneciklerin sentezi uygun koruyucu ekipman kullanan bir kimyasal duman başlık yer almalıdır. İnsan hücre hatları kurumunuzun kurallarına göre ele alınmalıdır. Lazer kullanımı radyasyon güvenliği eğitimi ve uygun PPE gerektirir.

Lazer kullanımı ve fotoakustik testler sadece yüksek eğitimli personel tarafından yapılmalıdır.