Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi
2 Haziran 2020
Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.
Çok hücreli organizmalar içinde, doku uzamsal yönelimlerinde yüksek dereceleri daha fazla gösterir. Hücreler, morfogenez boyunca büyük mesafelerde bir dizi öncelik gösterir ve hizalar. Epitelin düzlemsel düzenlemelerinin gelişim sırasında nasıl ulaştığını anlamak için, hücrenin oryantasyonlarını ve büyüme dinamiklerini yüksek aralıklı zamansal doğrulukla izlemek çok önemlidir.
Açıklanan protokol drosophila pupal epidermis küresel ve yerel düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Bu metodoloji farklı araştırma kuramı, hücre biyolojisi, morfogenez ve düzlemsel polarite hakkında bilgi verebilir ve diğer dokuların, yapıların ve modellerin analizine uygulanabilir. Tüm adımlar bazı uygulamadan sonra kolayca gerçekleştirilebilir.
Kesinlik istiyorlar. Bu protokolün görselleştirilmesi, en iyi sonuçların daha kısa sürede elde edilebilmesine yardımcı olur. Pupal diseksiyonu karmaşıktır.
Başlamak için, taze bir plastik şişe için sahnelenen beyaz pre-pupa aktarmak için nemli bir boya fırçası kullanın ve 25 santigrat derece gerekli olduğu sürece onları tutmak. Sonra, forceps yardımıyla şişe duvarından her pupa çıkarın. Çift taraflı yapışkan bant ile kaplı bir cam slayt üzerinde her pupa ventral tarafı tutkal.
Pupal kasanın banda yapışmasını sağlamak için pupanın uçlarıyla baş spiracles'e ve pupanın sırt yüzeyine hafifçe dokunun. Operkülonu puparium'dan forceps ile hafifçe çıkararak stereo mikroskop altında diseksiyonun diseksiyona başlayın. Operküler açıklık yoluyla pupal durumda ve pupa yüzeyi arasında sığ bir forceps bir ucu yerleştirin.
Bir veya daha fazla salıncakta kılıfı baş lardan kuyrağa yırtarak pupayı çimdiklemekten kaçının. Arka uça doğru devam ederken kırık pupal kılıfı lateral kenarlara katlayın. Pupayı, hayvanın altına dikkatlice sokarak ve yavaşça yukarı çekerek açılan pupal kasadan çıkarın.
Pupa, ponpların ucuna yapışır. Pupayı ventral tarafta hafifçe tutun ve pupayı gaz geçirilebilir halokarbon yağının küçük bir damlasının üzerine cam dipli bir tabağa aktarın. Yemeğin kenarlarında ıslak mendil kağıt bir parça rulo ve nem korumak için çanak kapağı.
Dibine bünyedeki tabakların üzerindeki yağ damlası üzerine pupa nın üzerine yönlendirin etki alanına ve sürece göre değerlendirilecektir. Dorsal yuvaların erken genişlemesinin uzun süreli canlı görüntülemeiçin, dorsal yanal pupa yönlendirmek. Geç genişleme ve doku remodeling görüntü için, dorsally pupa yönlendirmek.
Monte edilmiş pupa içeren cam dipli kabı mikroskop aşamasına aktarın ve aktarılan ışığı kullanarak karın bölgesinin yüzeyine odaklanın. Karın epitelinde genetik mozaikleri indüklemek için mitotik rekombinasyon kullanmak için, ısı şoku indüklenebilir flipaz, belirli bir genomik konumda bir FRT bölgesi ve FRT bölgesine tanınabilir hücresel marker distal taşıyan bakire dişileri hazırlayın. Eşdeğer genomik konumda FRT alanı taşıyan mutant erkekleri hazırlayın.
Dört ila beş gün boyunca 25 santigrat derece bir plastik şişe üç-bir oranda birkaç kadın ve erkek çapraz. Histoblastlarda somatik klonlar oluşturmak için, 37 santigrat derecede hayvanları içeren plastik şişeleri bir saate 45 dakika ila 45 dakika sallayarak haçın soyundan gelen üçüncü yıldız larva evresinde ısı şoku tedavisi yapın. Görüntü J yazılımında, 2B konfokal mikroskopi ile elde edilen Z yığın dilimlerini korumak için maksimum yoğunluklu projeksiyon işlevini kullanın.
Yuvalar, onları düzlemsel koordinat sistemi ön solunda ve sırtüstü doğru yönlendiren karakteristik bir şekle sahiptir. Bu analizle en iyi sonuçları elde etmek için giriş görüntüsünün yüksek çözünürlükte elde edilmesi gerekir. Yerel hücre kenarlarında nitel yönlendirme değerleri elde etmek için eklenti menüsüne tıklayın ve yön J dağıtım seçeneğini seçin.
Gausspencere sigmasını bir piksele, kübik spline degradeye, minimum tutarlılığı yüzde 20'ye ve minimum enerjiyi yüzde bire ayarlayın. Eklentinin renk etüdü seçeneğini kullanır. Tonunu yönlendirmeye, doygunluğu tutarlılığa ve giriş görüntüsüne parlaklık olarak ayarlayın.
Bu renk, hücre kenarı yönünü ayarlanan düzlemsel koordinat sistemine göre kodlar. Ardından, eklenti menüsüaltında, hücresel yönlendirmeleri ve yön hücresini hücre hizasına göre ölçmek için yön J ölçüsü seçeneğini kullanın. Histoblastların işgal ettiği alan içinde 20 mikrometre çarpı 20 mikrometre civarında tek tip ağırlığın ilgi küçük, bitişik örtüşen olmayan bölgeleri oluşturun.
Presleme ölçüsü, ROI'ların baskın yerel yönünü ve tutarlılığını hesaplar. Bu çalışmada, kullanılan metodoloji önemli fotoğraf ağartma veya fotoğraf toksisitesi olmadan 48 saate kadar süreler için gelişmekte olan pupa yüksek çözünürlüklü filmler üretmek mümkün. Burada, rfp NLS'nin yokluğunda işaretlenen yabani tip klonlar ve ikiz noktalarının puparium oluşumundan 26 saat sonra gösterilmektedir.
Klonlar segmental sınırlar boyunca uzamış. İkiz klonlar paralel veya birlikte düzenlenmiştir. Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra vahşi tip bir klonun morfolojisi her iki aşamada da karmaşık sınır morfolojisi gösterir.
Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra geometrik parametreler için kutu ve bıyık çizimleri ortalama alan ve çevre nin bu zaman penceresinde önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Klonun oryantasyonu genişleme ve yeniden şekillendirme sırasında sürdürüldü. Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra şekil parametreleri, yabani tip klonlarda pürüzlülük, yuvarlaklık ve daireselliğin zar zor değiştiğini gösterir.
Pupa zarar değil emin olun, aksi takdirde birkaç saat içinde ölecek, canlı görüntüleme etkileyen. Bu protokol, sartus reaktifinin veya enstrümanın çalıştırılmasını gerektirmez. Parçalara ayırırken kendinizi çimdiklemekten kaçının.
Bu metodolojileri uygulayarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü filmler üretmek için farklı hayal teknikleri kullanarak mümkün. Fotonların veya dönen disklerin odaknoktası. Rastgele hücreler çapraz görüşmeler veya hücre iletişim mekanizmalarının belirlenmesinde kolaylık sağladığından, otonom olmayan yanıtları araştırmak için klorsal analiz kullanılabilir.
Bu yöntemler kolayca morfogenetik olayların tam bir dizi çalışma için adapte edilebilir, metamorfoz sırasında epidermal koordinasyonu da dahil olmak üzere, kas, ve nöro gelişim.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, meyve sineği metamorfoz geçirdiğinde Drosophila abdominal epitelileri içinde hücre yönelimi ve doku büyümesinin dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji, Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişim aşamalarını, dokuları ve hücre altı yapıları çalışmak için uygulanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Morfogenez
- Planar Polarite
Arka Plan
- Doku, çok hücreli organizmalarda yüksek derecede mekansal yönelim gösterir.
- Hücreler, morfogenez sırasında uzun mesafelerde hizalanır ve öncelik gösterir.
- Hücre yönelimleri ve büyüme dinamiklerini izlemek, epitel düzenlemelerini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Bu çalışma Drosophila pupal epidermisine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Küresel ve lokal seviyelerde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek.
- Hücre biyolojisi ve morfogenez teorilerine dair içgörüler sağlamak.
- Metodlojiyi çeşitli dokular ve model organizmalara uygulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre yönelimi izlemek için görüntüleme teknikleri.
- Doku büyüme dinamiklerinin analizi.
- Drosophila gelişiminin in vivo gözlemi.
- Protokolün farklı gelişim aşamalarına uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Hücre davranışlarını takip etmede yüksek mekansal-zamansal doğruluk.
- Metamorfoz sırasında hücre yönelimi dinamikleri hakkında içgörüler.
- Diğer dokular ve model organizmalar için potansiyel uygulamalar.
- Metodloji pratikten sonra erişilebilir hale gelir.
Sonuçlar
- Protokol, epitelyal morfogenezi anlamayı geliştirir.
- Hücre biyolojisi alanındaki çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu metodolojiyle daha geniş içgörüler elde edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
