Name: Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Öğrenin, murine gastrointestinal sistemde Candida albicans'in yerini ve morfolojisini görselleştirmek için situ hibridizasyon floresan yöntemini. Bu teknik, bağırsak mikrobiyota etkileşimlerini doğal ortamında incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg ve KC Huang FISH tekniğini geliştirmede rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Teresa O'Meara el yazması hakkında yararlı yorumlar da yaptı ve Miriam Levy fotoğrafçılığa yardımcı oldu. Bu çalışma NIH'nin R01AI108992, R01DK1113788 ve Bulaşıcı Hastalıkların Patogenezinde Burroughs Hoş Geldiniz Ödülü ile desteklenmiştir.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntem, herhangi bir cinsiyet veya zorlanma commensally kolonize farelerin GI yollarında C. albicans mayave hyphae görselleştirilmesi için izin verir. FISH sondası, mantar sitoplazması boyunca dağıtılan 23S rRNA ile melezleşir. Yöntemimiz bağırsak bakterileri görselleştirmek için daha önce bildirilen protokolden uyarlanmıştır20. C. albicans ana bilgisayar içinde morfolojisini değiştirdiğinden, yöntem mantar hücre şeklini ve yerelleştirmeyi izlemek için yararlıdır. Örneğin, bu yöntemi mayaların sindirim sistemi boyunca baskın olduğu hipotezini çürütmek ve bazı "filamentasyon-kusurlu" mutantların in vivo ve in vitro fenotipleri arasındaki tutarsızlıkları ortaya çıkarmak için kullandık12.
C. albicans commensal colonization için çeşitli fare modelleri mevcuttur. Laboratuvar fareleri ve insanların mikrobiyota ayrı ve, farelerde, antibiyotik kullanımı veya özel bir diyet istikrarlı kolonizasyon kurmak için gereklidir. Antibiyotik tedavisi de c. albicans insanların kolonizasyonu artırır ve yaygın hastalık için önemli bir risk faktörüdür10. Bu çalışmada kullanılan antibiyotikler nispeten ucuz ve bakteriyel mikrobiyota güvenilir düşüşler verim. Antibiyotikler intagonistik bakteri türlerinin yükünü azaltmak için kullanılan, hayvanlardan tüm bakterileri ortadan kaldırmak için değil unutmayın. Araştırmacılar C. albicansçalışma istiyorsanız- bakteri yokluğunda etkileşimleri barındırmak veya antibiyotik veya özel bir diyet kullanımı önlemek için, mikropsuz hayvanlar geleneksel yetiştirilen hayvanlar için ikame edilebilir; ancak, gnotobiyotik fareler bazı immün ve anatomik anormallikler sergilerler ve bu nedenle tüm amaçlar için uygun olmayabilir.
Başarılı FISH boyama için birkaç adım önemlidir: Önerilen fiksasyon yöntemi, özellikle mukus tabakası ve üç boyutlu gibi bağırsak lümeninin kırılgan içeriğini korumak için GI dokularının yapısal bütünlüğünü korumak için önemlidir. mantar ve bakteri organizasyonu16. Su içeren yaygın olarak kullanılan birçok fiksasyon çözümlerinin parlak mimariye son derece zarar verdiğini lütfen unutmayın. Bu protokolde önerilen fiksasyon sonrası yıkıntılar için fiksatifler ve çözümler su içermez ve su ile kirlenmeyi önlemek önemlidir. Bir diğer kritik adım ise hibridizasyon fırınındaki slaytların kuluçkaya yatışı sırasında hibridizasyon çözeltisinin buharlaşmasını önlemenin önemli olduğu hibridizasyon adımıdır. Bu sorunu önlemek için slaytları su geçirmez bir kapta yerleştirmenizi öneririz. Alternatif olarak, bir başlangıçta mikrodizilerin hibridizasyonu için kullanılan gibi su geçirmez hibridizasyon odaları kullanabilirsiniz.
Bir C. albicans-özelFISH probu bu protokolde açıklanmıştır. Ancak, birçok laboratuvar yetiştirilen fareler c. albicans veya diğer mantarlar kendi doğal bağırsak mikrobiyota bir parçası olarak içermediğinden, bir panfungal prob özellikle deneysel kolonize hayvanlarda C. albicans leke olabilir. Bir panfungal probun yerine üstün hibridizasyon özellikleri ve daha yüksek sinyal-gürültü oranı nedeniyle istenemeyebilir. Panfungal prob C. albicansiçin bir psödospesifik sonda olarak kullanılırsa, bu enfekte olmayan hayvanlarda boyama eksikliği belgelemek için önemlidir (yani, antibiyotik ile tedavi ama C. albicans). Kolonize olmayan bir kontrol hayvanının boyanması, FISH problarının gıda partiküllerine yapışmasından kaynaklanabilecek arka plan boyamalarını değerlendirmek için de yararlıdır. Genel olarak, FISH problarının kullanımı Calcofluor white (hücre tipleri arasında farklılık gösteren bir hücre duvarı bileşeni olan chitin, GMS veya ticari olarak mevcut antifungal antikorlar) gibi diğer boyama mantarları yöntemlerine göre gelişmiş özgüllük sunar. Ayrıca FISH boyama, türe özgü rRNA'lara farklı olarak etiketlenmiş FISH probları kullanarak birden fazla organizmanın costaining sağlar.
Bu tekniğin bir uyarı bazı C. albicans maya hücre tipleri FISH (örneğin, opak ve GUT hücre tipleri) tarafından çok benzer görünür olmasıdır. Bu hücre türleri arasında ayırt etmek için, hücre tipine özgü mantar mRNA'larına hibridizasyon probları geliştirmek yararlı olacaktır. Bununla birlikte, mevcut haliyle, FISH tekniği zaten in vivo ve in vitro davranışları arasında şaşırtıcı tutarsızlıklar ortaya koymuştur C. albicans mutantlar her iki koşul da altında değerlendirilen12, karmaşık etkileşimleri gösteren mevcut in vitro tahliller tarafından yeterince taklit olmayan doğal kommensal ortam. Ek yabani tip ve mutant konaklarda farklı C. albicans lekeleri daha fazla çalışmalar mantar-host etkileşimleri içine ek anlayışlar vermek olasıdır. Özellikle, inflamatuar barsak hastalığı modellerinde profil C. albicans öğretici olacaktır, hangi insanlarda C. albicans yüksek titreleri ile ilişkili21, ve C. albicans overgrowth ve hastalık diğer modelleri. FISH tekniği de belirli konak hücreleri leke immünohistochemistry ile kombine edilebilir. Genel olarak, burada sunulan yöntem memeli GI yolu içinde C. albicans lokalizasyonu ve morfolojisi belirlemek için makul hızlı ve güvenilir bir araç sağlar.

Candida albicans bir mantar commensal yanı sıra fırsatçı bir insan patojen. Bu maya tanımlanmış bir çevresel niş yoksun ve bunun yerine gastrointestinal içinde yayılır (GI) sistem, cilt, ve insanlar ve diğer memelilerin genitoüriner sistem1. C. albicans üzerinde erken araştırma öncelikle virülans potansiyeli üzerinde duruldu oysa, birkaç yeni raporlar bağırsak içinde commensally yayılan organizmaların normal sağlık önemli roller oynayabilir düşündürmektedir, bağışıklık gelişimi de dahil olmak üzere ev sahibi2,3,4. Memeli bağırsağı içinde C. albicans commensalism araştırmalarını kolaylaştırmak için, istikrarlı GI kolonizasyon ve situ hibridizasyon bir floresan bir fare modeli geliştirdi (FISH) mantar maya hücreleri ve hyphae içinde görselleştirmek için tabanlı bir yöntem bağırsak lümeni.
Bazı istisnalar dışında5, laboratuvar da yetiştirilen fareler genellikle sindirim sisteminin mantar kolonizasyonuna direnç gösterirler. Kolonizasyon direnci belirli bakteri türleri tarafından aracılık olduğu düşünülmektedir; ancak, bu antibiyotik ile hayvanların tedavisi ile aşılabilir6,7 veya muhtemelen bakteri türlerinin bileşimi değiştirir kimyasal olarak tanımlanmış bir diyet kullanımı8,9. Benzer şekilde, insanlarda, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı C. albicans overgrowth ve yayma ile ilişkili olmuştur10. Bizim murine kolonizasyon modeli c. albicans immünobeceriksiz, geleneksel olarak yetiştirilen farelerin kolonizasyonu kurmak için geniş spektrumlu antibiyotikler kullanır. Penisilin ve streptomisin c. albicans 108 koloni oluşturan birimleri (CPU) ile gavaj önce bir hafta boyunca hayvanların içme suyunda sağlanır. Antibiyotik li su devam ettikçe, C. albicans GI yolu boyunca yayılır ve 106−108 CPU/g dışkı titrelerine ulaşır. Mantar kolonizasyonunun yüksek seviyesine rağmen, hayvanlar sağlıklı kalır ve enfekte olmayan kontroller ile aynı oranda kilo. Bu model için ekran ve birden fazla C. albicans commensalism faktörler11karakterize başarıyla kullanılmıştır11 ,12.
Mantar krallığının diğer üyeleri gibi, C. albicans büyük morfolojik plastisite yeteneğine sahiptir13. In vitro koşullar altında, en az altı tek hücreli maya hücre türleri arasında geçiş gösterilmiştir, yanı sıra çok hücreli hyphae ve psödohyphae. Maya-to-hypha geçiş en iyi karakterize virülans özelliklerinden biridir, ve hyphae ve pseudohyphae en memeli hastalık modellerinde baskın, yanı sıra enfekte insan dokularında. Murine sindirim sistemi içinde C. albicans lokalizasyonu ve hücre morfolojisi belirlemek için, sabit histolojik kesitlerde maya ve hyphae boyama için bir FISH tekniği geliştirdi. Problar, mantar sitoplazması boyunca dağıtılan 23S ribozomal RNA (rRNA) ile melezlenen floresan etiketli DNA oligonükleotidlerinden oluşur. Konak dokular, ev sahibi mukoza, sindirim malzemesi, bakteriyel mikrobiyota ve bağırsak lümeni içindeki mukus da dahil olmak üzere bağırsağın üç boyutlu mimarisini koruyacak şekilde sabitolduğundan, bu teknik mantarın lokalizasyonuna izin verir. lekeli zaman bu yerler ile ilgili hücreler. FISH tekniği, Periyodik Asit Schiff (PAS) veya Gomori'nin Metheammine-Silver (GMS) gibi mantarlar için geleneksel histolojik lekeleri ile karşılaştırır, ayrıca ticari olarak mevcut antifungal antikorlar, çünkü bu reaktifler C. albicans. Ayrıca, standart fiksatifler mukus tabakası kaldırmak ve bağırsak lümen diğer içeriğini bozabilir14,15.
Bu makalede, yüksek dereceli C. albicans kolonize fare GI sistemi kurmak için ayrıntılı talimatlar sağlamak, ötanazi hayvanlardan sindirim sistemi diseksiyon için, luminal koruyan bir şekilde doku fiksasyonu için mimarisi ve FISH kullanarak ev sahibi dokular içinde C. albicans tespiti için. C. albicans yabani türü ve mutant suşları ek olarak, gavaj tekniği diğer mikroorganizmaların teslim etmek için kullanılabilir. Fiksasyon tekniği bağırsak içeriğinin korunması istenen herhangi bir çalışma için yararlı olacaktır. FISH prosedürü bir gün içinde tamamlanabilir ve birden fazla farklı etiketli problar kullanılarak birden fazla mantar türünü yerelleştirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td>herhangi bir satıcıdan</td></tr> ikame edilebilir <tr><td>BHI kan agarı</td><td></td><td></td><td>, herhangi bir satıcıdan</td></tr> ikame edilebilir<tr><td>C. albicans FISH probu</td><td>IDT DNA Teknolojileri</td><td>özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon inkübasyonu</td><td></td><td></td> için oda <td>buharlaşmayı azaltmak için su geçirmez oda</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>> =% 99.5</td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Hassas görev silecek mendilleri</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Besleme iğneleri</td><td>Cadence, Inc.</td><td>7910</td><td>metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; sterilize etmek için otoklavlanabilir</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>diğer floroforlar mevcuttur</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>diğer floroforlar mevcuttur</td></tr><tr><td>Köpük pedler</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Kasetlere sığacak köpük pedler sipariş</td></tr> edin <tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>MK881746</td><td>ACS reaktifi, >=%99,5</td></tr> <tr><td>Cam Coplin kavanozu</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>arka arkaya 10 slayta kadar tutun</td></tr><tr><td>Histoloji kasetleri</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Çekumun ezilmemesi için derin kasetler</td></tr><tr><td>Hibridizasyon lamel</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td></td><td></td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td>, <td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Lee'nin ortamı</td><td></td><td></td>, <td>Lee ve ark. 1975</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>ACS reaktifi, >=%99.8</td></tr> <tr><td>Fareler</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>yetişkin BALB/c; 18-21 gram (8-10 hafta)</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>%16 çözelti</td></tr><tr><td>Pararafin balmumu</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Doku gömme için</td></tr><tr><td>Paraplast PBS, pH 7.4</td><td>UCSF Hücre Kültürü Tesisi Medya Üretim Ünitesi</td><td>CCFAL003</td><td>kalsiyum, magnezyum içermez; herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Penisilin G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud dekstroz agar</td><td></td><td></td><td>olabilir herhangi bir satıcıdan ikame edilmiş</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>steril, herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir; RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Sigma</td><td>L3771</td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir; RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>S9137-100G'yi</td> <td>koruyun</td></tr><tr><td>Süper PAP kalemi</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>herhangi bir satıcıdan ikame edilebilir; RNaz içermez</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td>, <td>DAPI</td></tr><tr><td>Ksilenleri</td><td>içermez Sigma</td><td>214736</td><td>reaktif sınıfı</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>olabilir herhangi bir satıcıdan ikame edildi</td></tr></tbody></table>

situ hibridizasyonfloresan kullanarak murine gastrointestinal sistemde candida albicans görselleştirilmesi

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans insanlarda ve diğer birçok memelilerde bağırsak mikrobiyotasının bir mantar bileşenidir. C. albicans en kolonize konaklarda semptomlara neden olmasa da, kommensal rezervuar bulaşıcı hastalık için bir depo olarak hizmet vermektedir, ve bağırsakta yüksek mantar titreleri varlığı inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkilidir. Burada, kararlı gastrointestinal kolonizasyon bir fare modelinde C. albicans hücre morfolojisi ve lokalizasyon görselleştirmek için bir yöntem açıklar. Kolonizasyon oral antibiyotik ile tedavi edilmiş hayvanlarda C. albicans tek bir doz kullanılarak kurulmuştur. Bağırsak dokusu segmentleri luminal içeriği (mikroorganizmalar ve mukus) yanı sıra konak mukoza mimarisini koruyan bir şekilde sabitlenir. Son olarak, situ hibridizasyonfloresan C. albicans ve hyphae için leke mantar rRNA karşı problar kullanılarak yapılır. Bu protokolün önemli bir avantajı, Gastrointestinal kolonizasyon sırasında C. albicans hücre morfolojisi ve konak yapıları ile mekansal ilişki eşzamanlı gözlem sağlar.

Verilen talimatlara göre, bu tekniğin sonucu, kesitli GI dokularında konak epitel, mukus ve C. albicans çekirdeklerinin floresan etiketleme olacaktır. Yabani tip Candida albicans hücreleri ya yuvarlak olarak görünmelidir, tek hücreli maya hücreleri ya da son derece uzamış, bazen dallanma, çok hücreli hyphae (hücre-hücre bölünmeleri hyphae belirgin olmayacaktır). C. albicans Mutantlar ayrıca daha küçük olarak görünebilir, biraz uzamış "gri" mayalar veya daha büyük, biraz uzamış "GUT" (gastrointestinal kaynaklı geçiş) veya "opak" mayalar.
Şekil 1, oral gavaj için kullanılan beslenme iğnesinin yanı sıra gavaj işlemi sırasında iğnenin kilit konumlarını da gösteriş ve görüntüle. Şekil 2, organ diseksiyonu ve farenin GI segmentlerinin görünümü için kullanılan tipik bir kurulum sağlar.
Şekil 3, farklı C. albicans hücre tiplerinin fish boyamalarını in vitro ve fare modeli içinde yayılımı takiben gösterir. Şekil 3A, sabit, permeabilize, in vitro-propagated hyphae floresan ve faz görüntülerini gösterir. Hypha oluşumu sıvı Lee'nin orta18 ile% 2 N-asetilglucosamine, pH 6.8 ile 37 °C indüklendi. Şekil 3B, sabit, permeabilize, in vitro-propagated maya hücrelerinin floresan ve faz görüntülerini gösterir. Şekil 3C,D sırasıyla sabit, permeabilize, in vitro-propagated GUT hücreleri ve opak hücreleri gösterir. GUT ve opak hücre tipleri taramalı elektron mikroskobu ile görüntülendirilmediklerinde morfolojik olarak ayırt edilemezler. İn vitro-propagateed hücrelerin FISH boyama hücreleri iyi permeabilized değilse suboptimal olacağını unutmayın. Zayıf ve diffüz boyama örneği Şekil 3C'degösterilmiştir. En iyi sonuçlar için, her hücre tipi ve türü araştırılacak ampirik olarak hücre fiksasyonu ve permeabilizasyon koşulları belirlenmelidir. Neyse ki, kesitli dokularda C. albicans görselleştirmek için önerilen protokol daha tutarlı permeabilization üretir.
Şekil 3E-G, c. albicans-spesifik probu (Şekil 3E) veya panfungal sonda(Şekil 3F,G)ile boyanmış fare kalın bağırsaklarında C. albicans tasvir. C. albicans bu görüntülerde kırmızı görünür, konak hücre çekirdekleri mavi, ve mukus tabakası yeşil. Hem yuvarlak mayalar hem de yüksek uzamış hyphae (beyaz ok uçları) kalın bağırsaklarda meydana gelir. Panfungal sonda ile boyamanın daha parlak olduğunu lütfen unutmayın. Şekil 3G, panfungal sonda ile boyanmış aynı bölmede bir ume6 mutantı tasvireder. Ume6 in vitro koşullar altında hypha oluşumu için gerekli olan transkripsiyon faktörünü kodlar19 . İlginçtir, in vitro koşullar altında bu mutant tarafından görüntülenen maya kilitli fenotip bağırsak içinde recapitulated değildir, gereksiz bir faktör konak içinde aktive edilmesi gerektiğini düşündüren12. Şekil 4, murine GI yolunun farklı bölümlerinde, ev sahibi mukozaya hemen bitişik bölgeler ve bağırsak lümeninin daha merkezi bölgeleri de dahil olmak üzere yabani tip C. albicanların görünümünü betimlemektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> Şekil 1: Gavaj sırasında anahtar besleme iğne pozisyonları. (A) Besleme iğnesi. (B) Dilin yan tarafına yerleştirilen iğne topuile besleme. (C) Yemek borusuna yerleştirilme ile dik pozisyonda iğne besleme. (D) Burun üzerinde birkaç milimetre görünür ile mideiçine yerleştirilen besleme iğnesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> Şekil 2: Örnek diseksiyon düzeni. (A) Diseksiyon pedi ve aletleri. (B) Excised GI yolu. Proksimal (özofagus) distal (anüs) bölümleri: I. Mide. II. Proksimal ince bağırsaklar. III. Medial ince bağırsaklar. IV. Distal ince bağırsaklar. V. Cecum. VI. Kalın bağırsak. Pembe kesikli kenarlık kutuları dokuların düzeltilmesini gösterir. (C) Kasetlere yerleştirilmiş dokular. Roma rakamları b panelindekiyle <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">aynıdır.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> Şekil 3: FISH lekeli C. albicanstemsili görüntüler. (A) FISH C. albicans hyphae sıvı Lee'nin medya18% 2 N-asetilglucosamine, pH 6.8 ile yetiştirilen. (B) C. albicans yuvarlak maya hücreleri YEPD + 2% agar plakaları üzerinde yetiştirilen FISH. (C) BALIK C. albicans GUT hücreleri (ySN1045) YEPD + 2% agar plakaları üzerinde yetiştirilen. (D) C. albicans opak hücrelerin BALIK YEPD + 2% agar plakaları üzerinde yetiştirilen. (E) Kalın bağırsaklarda yabani tip C. albicans (ySN250), C. albicans-spesifikprob ile boyanmış. (F) Kalın bağırsaklarda yabani tip C. albicans, panfungal sonda ile boyanmış. (G) Ume6 mutant (ySN1479) kalın bağırsaklarda, panfungal sonda ile boyanmış: kırmızı C. albicans,mavi ev sahibi epitel çekirdekleri, ve yeşil müsin olduğunu. Ok uçları hyphae'yi gösterir. Oklar mayayı gösterir. Ölçek çubukları = 20 μm. Görüntüler F ve G Witchley ve ark.12'denuyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> Şekil 4: FISH lekeli C. albicanların farklı bağırsak bölmelerinde görünümü. Yabani tip C. albicans fare GI yolu belirtilen segmentlerinde gösterilir. Her bölmede, görüntüler ev sahibi mukozaya bitişik alanı ve bağırsak lümenmerkezi bölge tasvir. Panfungal probu ile boyama yapıldı. Ölçek çubuğu = 20 μm. Görüntüler Witchley ve ark.12'denuyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Antibiyotik stokları (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penisilin G</td>
			<td>181 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Streptomisin</td>
			<td>400 mg/μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Methacarn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stok</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
			<td>Birim</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metan -ol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kloroform</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buzul asetik asit</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hibridizasyon çözümü</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stok</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
			<td>Birim</td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M Nacl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td> SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 formamid</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>μL (kullanımlar arasında -20 °C'de küçük aliquots olarak tutulur)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase içermeyen su</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FISH yıkama solüsyonu</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M Nacl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase içermeyen su</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Müsin-çekirdek boyama çözeltisi</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 μg/mL</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>lektin, 40 μg/mL</td>
			<td>1.6 g/mL</td>
			<td>40</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözeltilerin tipik hacimleri ve konsantrasyonları.

Bu protokolün amacı Memeli gastrointestinal sistemde Candida albicans hücre şekli ve lokalizasyonu görselleştirmektir.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Bu protokol, Candida albicans'ın memeli gastrointestinal sistemde nasıl yaşadığına dair şimdiye kadar sahip olduğumuz en iyi içgörülerden bazılarını ortaya koymuştur. Örneğin, yakın zamana kadar, Candida'nın bağırsakiçinde nerede lokalize olduğunu ya da bu niş içinde varsaydığı birçok morfolojik formdan hangisini bilmiyorduk. Bu tekniğin en büyük avantajı, mantarın konak yapıları veya mikrobiyotadaki bakterilerle olan üç boyutlu etkileşimlerini bozmadan Candida'yı doğal ortamında görselleştirmesine olanak sağlamasıdır.Bağırsak karmaşık bir ortam olduğu için, laboratuvarda modellemek çok zordur ve bu nedenle Candida biyolojisini doğrudan bir konak modelinde araştırmanın bir yolunu bulmak çok tatmin edicidir. Candida albicans da dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyota bazı bileşenleri inflamatuar barsak hastalığı gibi hastalıklarda rol oynamak için şüpheli. Bu teknik, hastalardan elde edilen biyopsi örneklerinde spesifik mikroorganizmaların varlığını teşhis etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.Gavaj tekniğinin ustalığı ve organları yırtmadan gastrointestinal segmentleri parçalama yeteneği en iyi sonuçları elde etmek için önemlidir. Başlamak için, gavage verilen bir inoculum hesaplanan hacmi ile her hayvan. Bir mililitreşile şırınga için bir otoklavlı hayvan besleme iğnesi takın ve tüm kabarcıkları kaldırmak için emin olmak için bir gavaj hacmi ile şırınga doldurun.Şırıngayı steril bir yüzeye yerleştirin. Hayvanı emniyete almak için, baskın elile kuyruğun dibinde tutun ve baskın olmayan eli hayvanın sırtına, kulakların hemen arkasındaki gevşek deriye doğru kaydırın. Başparmak ve işaret parmağı ile sıkıca birlikte scruff toplayın.Scruff tarafından hayvan almak, ters çevirin ve avucun avuç karşı hayvan hareketsizleştirmek için kuyruk etrafında aynı elin küçük parmak döngü. Hayvanın başını yavaşça uzatır, böylece vücutla düz bir çizgide dir. Sonra baskın el ile şırınga almak ve kavisli iğne aşağı işaret ile hayvana dik tutun.Yavaşça ağız bir iç köşesinde kanca ve boğaz arkasına ağız tarafı boyunca iğne ilerlemek için iğne topu kullanın, sonra merkezine iğne hareket ettirin. İğne topu hayvanın boğazının arkasında olduğunda, iğneyi hayvanın vücut çizgisine paralel olacak şekilde yukarı doğru yatırın ve boğazından aşağı doğru düzgün bir şekilde kaymasını bekleyin. İğne boğazdan aşağı doğru düzgün bir şekilde kaymazsa, iğne düzgün konumlandırılamayabilir ve yeniden konumlandırmak ve tekrar denemek için geri çekilmelidir.İğneyi düzgün bir şekilde ilerleterek hayvanın sadece birkaç milimetre görünür kalana kadar iğneyi yutmasını bekleyin. İğne topunun yavaşça pistonu ilerleterek midede olduğunu test edin ve direnç yoksa inoculumu teslim almaya devam edin. İnokül uygulandıktan sonra iğneyi yavaşça geri çekin ve hayvanı kafesine yerleştirin.Emekli nefes alma veya sıkıntı belirtileri için 5 ila 10 dakika boyunca hayvan izleme devam edin ve gavaj kısa bir süre sonra normal aktivitedevam ettiğini doğrulamak. Aynı inoculum bir sonraki hayvan için kullanılacaksa, bir alkol mendil ile iğne temizleyin. Farklı bir inoculum kullanılacaksa, iğneyi değiştirin.Karın derisinin bir bölümünü çimdiklemek ve makas kullanarak leğen kemiğinin tabanına yakın deri ve altta yatan fasya incise künt uçlu forceps kullanın. Periton boşluğunun her iki tarafında ve göğüs kafesine kadar u şeklinde kesi uzatın, sonra yolu kaldırmak. Çekum ve ince ve kalın bağırsaklar arasındaki bağlantıları kesmek için makas kullanarak periton boşluğundan yavaşça çeki ayıklamak için künt uçlu forceps kullanın.Tüm cecum bir histoloji kaset içine böylece bükülmemiş ve düz bırakır yerleştirin. Üst üzerine ikinci köpük ped yerleştirin ve kaset kapatın. Sonra methacarn içeren bir vida kapağı kavanoziçine kaset yerleştirin.Bir ila iki dışkı pelet içeren ve kaset daha az bir uzunluğa sahip kalın bağırsak bölümü excise. Dokuyu düz ve bükülmemiş tutarak kasetin içine yerleştirin. İkinci köpük ped ile bindirme, kasetkapatın ve methacarn içine yerleştirin.İnce bağırsağın her bir bölümünün örnekalınması için, bazı sindirim malzemesi içeren bir ila iki santimetrelik bir segment ilerler. Kaset içine doku yerleştirin, ikinci köpük ped ile kaplama, kaset kapatın ve methacarn içine koyun. Mide yitirerken yemek borusu ve ince bağırsaklarla olan bağlantılarını kesin.Dokuyu kasete yerleştirin ve kaseti methacarn'a yerleştirin. Kasetleri en az üç saat ama iki haftadan az oda sıcaklığında methacarn çözeltisinde bırakın. Fiksasyondan sonra, köpük pedleri çıkarın ve her bozulmamış doku bölümünü kasetine geri getirin.Daha sonra% 100 metanol 35 dakika, iki kez 100% etanol 25 dakika ve ksilen 20 dakika için iki kez dokuları yıkayın. Pat kasetler bir kağıt havlu üzerinde kuru ve bir melezleme fırında 70 derece santigrat iki saat için önceden erimiş parafin balmumu yerleştirin. Sonra balmumu kasetleri çıkarın, onlar balmumu blokları gömülü olana kadar drenaj ve oda sıcaklığında saklamak için aşırı balmumu izin verin.De-wax parafin ksilen dolu önceden ısıtılmış kavanoziçine slaytlar ekleyerek histolojik bölümleri gömülü. 10 dakika boyunca 60 derece santigrat derece kavanoz bırakın, sonra ksilen yıkama atın. Kavanoza taze oda sıcaklığında ksilenin dökün ve kuluçka tekrarlayın.Sonra% 100 etanol ile kavanoz doldurun ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Kuluçkadan sonra, kavanozdaki slaytları çıkarın ve hava onları kurutun. C.albicans bir balık sondası ile leke için, bir Pat Kalem kullanarak doku bölümü etrafında bir daire çizerek başlayın.Pipet 50 mikrolitre prob içeren hibridizasyon çözeltisi sabit doku üzerine ve yavaşça pipet ucu ile yayıldı. Kabarcıkları önlemek için emin olmak için bir hibridizasyon coverslip ile sıvı bindirme. Daha sonra kaydırakları su geçirmez bir hibridizasyon odasında kapatın ve karanlıkta bir melezleme fırınında 50 santigrat derecede üç saat boyunca bölümleri kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, bir Coplin kavanoza yıkama solüsyonu ekleyin. Coverslip'i forsepslerle slayttan dikkatlice çıkarın ve kaydırağı yıkama solüsyonuna yerleştirin. Alüminyum folyo ile kavanoz kapağı ve 20 dakika boyunca 50 santigrat derecede kuluçka.Daha sonra, yıkama çözeltisi dökerek ve PBS ile kavanoz dolum slaytlar yıkayın. Hemen dökün ve iki yıkama toplam işlemi tekrarlayan taze PBS ile yeniden doldurun. Wick uzakta hassas bir görev sil ve pat kalem ile bağırsak dokusu bölümü daire pBS ile.Opak plastik bir kap ta slaytlar yerleştirin ve doku bölümüne müsin çekirdek boyama çözeltisi 50 mikrolitre ekleyin. Alüminyum folyo ile kaplayın ve 45 dakika boyunca dört derece santigrat de kuluçka. Kuluçkadan sonra, bir Coplin kavanoza slaytlar koyun ve PBS ile iki kez yıkayın.Bir kağıt havlu üzerinde aşırı PBS uzak dokunun ve sonra bir doku ile son damla ları uzak wick. Her bölüme bir damla montaj ortamı yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için emin olmak için bir cam coverslip ile kaplayın. Montaj ortamının tüm örtünün altına yayılmasına izin verin.Kapak kapağını köşelerde oje ile sabitleyin ve floresan mikroskop kullanarak slaytları görüntüleyin. Bu protokol floresan c.albicans in vitro ve ev sahibi dokularda etiket için kullanılabilir. In vitro propagated hyphae, yuvarlak maya hücreleri, bağırsak hücreleri, ve opak hücreler sabit edildi, permeabilized, ve floresan ve faz kontrast mikroskopisi ile ayırt edildi.Yuvarlak mayalar ve yüksek uzamış hyphae fare kalın bağırsaklarda görüntülenmiştir. Ev sahibi dokular C.albicans spesifik sonda veya panfungal sonda ile lekeli edildi. C.albicans kırmızı, konak hücre çekirdekleri mavi ve mukus tabakası yeşil etiketli oldu.C.albicans hemen ev sahibi mukoza ve bağırsak lümen daha merkezi bölgelere bitişik bölgeleri de dahil olmak üzere murine GI yolu farklı segmentlerinde tespit edildi. Daha önce gavaj tekniğini gerçekleştirmemiş bilim adamları için, bu yöntemi denemeden önce özel eğitim almak önemlidir. Balık boyama sonrasında, immünofloresan teknikleri konak mukozanın ek özelliklerini lekelemek için kullanılabilir.Bu doku hasarı veya konak bağışıklık yanıtları karakterizasyonu için izin verebilir. Bu teknik bize Candida albicans mutantların mantar hücre morfolojisi ve ev sahibi içinde hayatta kalma arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için izin verdi Candida albicans biyoloji anlayışımızı ilerletmek bu zaman tedavi geliştirirken yararlanılabilir.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Zebra balığı hızla gelişmesi, küçük boyutu ve şeffaflık enfeksiyon doğal immün kontrolü çalışması için çok büyük avantajları...

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Kaynak: Ng, K. M., Tropini, C. Bağırsak mikrobiyota-konak etkileşimlerinin Floresans Yerinde Hibrizleşme, Lektin Boyanması ve Görüntüleme Yoluyla Görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2021).Bu video, fare bağırsak dokusunda bağırsak mikrobiyotasını boyandırmak için floresan probları bakteriyel rRNA'ya (ribozomal ribonüklein asit) hibritize ederek ve mikroskobik analiz için konak yapılarını karşı boyama yoluyla fare bağırsak dokusunda bağırsak mikrobiyotasını boyama prosedürünü göstermektedir.

Fare bağırsak bakterilerinin fare bağırsak kesitlerinde yerinde floresans hibridizasyonu

Bu video, Candida albicans'ın deri altı dokuda biyofilm oluşumunu incelemek için bir in vivo fare modelinin geliştirilmesini göstermektedir. Deney, Candida ile enfekte olmuş cihazların biyofilm gelişimi için hayvanın sırt bölgesine implante edilmesini içeriyor.

Candida albicans Bir İn Vivo Fare Modelinde Biyofilm Oluşumu

Bir fare deri altı modelinde Candida albicans biyofilm gelişiminin deneysel bir prosedürünü sunuyoruz. Mantar biyofilmleri, koloni oluşturan birimlerin sayısının belirlenmesi ve üretilen ışık miktarının canlı hücre sayısına karşılık geldiği invaziv olmayan bir biyolüminesans görüntüleme ile ölçüldü.

Biyoparlaklık Görüntüleme Ardından Fare Subkutan Modeli Tıbben-ilgili yabancı Organları Candida albicans Biyofilm Geliştirme

Burada, Candida albicans mantarları ve zimozan ve IgG kaplı boncuklar dahil olmak üzere 0,5 μm'den büyük partiküller gibi patojenlerin fagositozu sırasındaki olayların erken kaskadlarını görselleştirmek ve ölçmek için mikroskop tabanlı bir tekniği açıklıyoruz.

Fagositoz Erken Aşamaları görselleştirme

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

Gut homojen özler ve immünofloresan boyama kullanılarak bu çalışmada açıklanan ex vivo tsay GI sisteminde Candida albicans hiphal morfogenez incelemek için yeni bir yöntem temsil eder. Bu yöntem bağırsakta morfogenetik geçişi düzenleyen çevresel sinyalleri araştırmak için kullanılabilir.

Bir Ex vivo Assay Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Hyphal Morphogenesis Çalışma

Bu kolaylaştırılmış protokol, karmaşık doku örneklerindeki bakterileri tespit etmek ve görüntülemek için, dokuyu sabitlemekten floresan in situ hibridizasyonlu mikropları boyamaya kadar bir iş akışını detaylandırıyor.

Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Bu makalede, non-invaziv konfokal mikroskopi kullanılarak bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotipleri için orta büyüklükte Candida albicans mutant kütüphanelerinin taranması için bir yöntem anlatılmaktadır.

Bir Memeli Konağında Aktif Enfeksiyon Sırasında Candida albicans Mutant Suşlarında Morfogenez Fenotiplerini Taramak için In Vivo Görüntülemenin Kullanımı

Kateter üzerinde biyofilmin oluştuğu ve C.albicans ile konakçı arasındaki etkileşimin klinik CRI ile iyi korelasyon gösterdiği C.albicans ile ilişkili kateterle ilişkili enfeksiyonun (CRI) bir fare modelini oluşturduk. Bu model, C.albicans biyofilmle ilişkili CRI için tarama tedavilerine yardımcı olarak klinik dönüşüm için bir temel oluşturur.

Farede Kateterle İlişkili Candida albicans Enfeksiyon Modeli

Öğrenin, murine gastrointestinal sistemde Candida albicans'in yerini ve morfolojisini görselleştirmek için situ hibridizasyon floresan yöntemini. Bu teknik, bağırsak mikrobiyota etkileşimlerini doğal ortamında incelemeye olanak tanır.

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet