Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Bu protokol, Candida albicans'ın memeli gastrointestinal sistemde nasıl yaşadığına dair şimdiye kadar sahip olduğumuz en iyi içgörülerden bazılarını ortaya koymuştur. Örneğin, yakın zamana kadar, Candida'nın bağırsakiçinde nerede lokalize olduğunu ya da bu niş içinde varsaydığı birçok morfolojik formdan hangisini bilmiyorduk. Bu tekniğin en büyük avantajı, mantarın konak yapıları veya mikrobiyotadaki bakterilerle olan üç boyutlu etkileşimlerini bozmadan Candida'yı doğal ortamında görselleştirmesine olanak sağlamasıdır.

Bağırsak karmaşık bir ortam olduğu için, laboratuvarda modellemek çok zordur ve bu nedenle Candida biyolojisini doğrudan bir konak modelinde araştırmanın bir yolunu bulmak çok tatmin edicidir. Candida albicans da dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyota bazı bileşenleri inflamatuar barsak hastalığı gibi hastalıklarda rol oynamak için şüpheli. Bu teknik, hastalardan elde edilen biyopsi örneklerinde spesifik mikroorganizmaların varlığını teşhis etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.

Gavaj tekniğinin ustalığı ve organları yırtmadan gastrointestinal segmentleri parçalama yeteneği en iyi sonuçları elde etmek için önemlidir. Başlamak için, gavage verilen bir inoculum hesaplanan hacmi ile her hayvan. Bir mililitreşile şırınga için bir otoklavlı hayvan besleme iğnesi takın ve tüm kabarcıkları kaldırmak için emin olmak için bir gavaj hacmi ile şırınga doldurun.

Şırıngayı steril bir yüzeye yerleştirin. Hayvanı emniyete almak için, baskın elile kuyruğun dibinde tutun ve baskın olmayan eli hayvanın sırtına, kulakların hemen arkasındaki gevşek deriye doğru kaydırın. Başparmak ve işaret parmağı ile sıkıca birlikte scruff toplayın.

Scruff tarafından hayvan almak, ters çevirin ve avucun avuç karşı hayvan hareketsizleştirmek için kuyruk etrafında aynı elin küçük parmak döngü. Hayvanın başını yavaşça uzatır, böylece vücutla düz bir çizgide dir. Sonra baskın el ile şırınga almak ve kavisli iğne aşağı işaret ile hayvana dik tutun.

Yavaşça ağız bir iç köşesinde kanca ve boğaz arkasına ağız tarafı boyunca iğne ilerlemek için iğne topu kullanın, sonra merkezine iğne hareket ettirin. İğne topu hayvanın boğazının arkasında olduğunda, iğneyi hayvanın vücut çizgisine paralel olacak şekilde yukarı doğru yatırın ve boğazından aşağı doğru düzgün bir şekilde kaymasını bekleyin. İğne boğazdan aşağı doğru düzgün bir şekilde kaymazsa, iğne düzgün konumlandırılamayabilir ve yeniden konumlandırmak ve tekrar denemek için geri çekilmelidir.

İğneyi düzgün bir şekilde ilerleterek hayvanın sadece birkaç milimetre görünür kalana kadar iğneyi yutmasını bekleyin. İğne topunun yavaşça pistonu ilerleterek midede olduğunu test edin ve direnç yoksa inoculumu teslim almaya devam edin. İnokül uygulandıktan sonra iğneyi yavaşça geri çekin ve hayvanı kafesine yerleştirin.

Emekli nefes alma veya sıkıntı belirtileri için 5 ila 10 dakika boyunca hayvan izleme devam edin ve gavaj kısa bir süre sonra normal aktivitedevam ettiğini doğrulamak. Aynı inoculum bir sonraki hayvan için kullanılacaksa, bir alkol mendil ile iğne temizleyin. Farklı bir inoculum kullanılacaksa, iğneyi değiştirin.

Karın derisinin bir bölümünü çimdiklemek ve makas kullanarak leğen kemiğinin tabanına yakın deri ve altta yatan fasya incise künt uçlu forceps kullanın. Periton boşluğunun her iki tarafında ve göğüs kafesine kadar u şeklinde kesi uzatın, sonra yolu kaldırmak. Çekum ve ince ve kalın bağırsaklar arasındaki bağlantıları kesmek için makas kullanarak periton boşluğundan yavaşça çeki ayıklamak için künt uçlu forceps kullanın.

Tüm cecum bir histoloji kaset içine böylece bükülmemiş ve düz bırakır yerleştirin. Üst üzerine ikinci köpük ped yerleştirin ve kaset kapatın. Sonra methacarn içeren bir vida kapağı kavanoziçine kaset yerleştirin.

Bir ila iki dışkı pelet içeren ve kaset daha az bir uzunluğa sahip kalın bağırsak bölümü excise. Dokuyu düz ve bükülmemiş tutarak kasetin içine yerleştirin. İkinci köpük ped ile bindirme, kasetkapatın ve methacarn içine yerleştirin.

İnce bağırsağın her bir bölümünün örnekalınması için, bazı sindirim malzemesi içeren bir ila iki santimetrelik bir segment ilerler. Kaset içine doku yerleştirin, ikinci köpük ped ile kaplama, kaset kapatın ve methacarn içine koyun. Mide yitirerken yemek borusu ve ince bağırsaklarla olan bağlantılarını kesin.

Dokuyu kasete yerleştirin ve kaseti methacarn'a yerleştirin. Kasetleri en az üç saat ama iki haftadan az oda sıcaklığında methacarn çözeltisinde bırakın. Fiksasyondan sonra, köpük pedleri çıkarın ve her bozulmamış doku bölümünü kasetine geri getirin.

Daha sonra% 100 metanol 35 dakika, iki kez 100% etanol 25 dakika ve ksilen 20 dakika için iki kez dokuları yıkayın. Pat kasetler bir kağıt havlu üzerinde kuru ve bir melezleme fırında 70 derece santigrat iki saat için önceden erimiş parafin balmumu yerleştirin. Sonra balmumu kasetleri çıkarın, onlar balmumu blokları gömülü olana kadar drenaj ve oda sıcaklığında saklamak için aşırı balmumu izin verin.

De-wax parafin ksilen dolu önceden ısıtılmış kavanoziçine slaytlar ekleyerek histolojik bölümleri gömülü. 10 dakika boyunca 60 derece santigrat derece kavanoz bırakın, sonra ksilen yıkama atın. Kavanoza taze oda sıcaklığında ksilenin dökün ve kuluçka tekrarlayın.

Sonra% 100 etanol ile kavanoz doldurun ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Kuluçkadan sonra, kavanozdaki slaytları çıkarın ve hava onları kurutun. C.albicans bir balık sondası ile leke için, bir Pat Kalem kullanarak doku bölümü etrafında bir daire çizerek başlayın.

Pipet 50 mikrolitre prob içeren hibridizasyon çözeltisi sabit doku üzerine ve yavaşça pipet ucu ile yayıldı. Kabarcıkları önlemek için emin olmak için bir hibridizasyon coverslip ile sıvı bindirme. Daha sonra kaydırakları su geçirmez bir hibridizasyon odasında kapatın ve karanlıkta bir melezleme fırınında 50 santigrat derecede üç saat boyunca bölümleri kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, bir Coplin kavanoza yıkama solüsyonu ekleyin. Coverslip'i forsepslerle slayttan dikkatlice çıkarın ve kaydırağı yıkama solüsyonuna yerleştirin. Alüminyum folyo ile kavanoz kapağı ve 20 dakika boyunca 50 santigrat derecede kuluçka.

Daha sonra, yıkama çözeltisi dökerek ve PBS ile kavanoz dolum slaytlar yıkayın. Hemen dökün ve iki yıkama toplam işlemi tekrarlayan taze PBS ile yeniden doldurun. Wick uzakta hassas bir görev sil ve pat kalem ile bağırsak dokusu bölümü daire pBS ile.

Opak plastik bir kap ta slaytlar yerleştirin ve doku bölümüne müsin çekirdek boyama çözeltisi 50 mikrolitre ekleyin. Alüminyum folyo ile kaplayın ve 45 dakika boyunca dört derece santigrat de kuluçka. Kuluçkadan sonra, bir Coplin kavanoza slaytlar koyun ve PBS ile iki kez yıkayın.

Bir kağıt havlu üzerinde aşırı PBS uzak dokunun ve sonra bir doku ile son damla ları uzak wick. Her bölüme bir damla montaj ortamı yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için emin olmak için bir cam coverslip ile kaplayın. Montaj ortamının tüm örtünün altına yayılmasına izin verin.

Kapak kapağını köşelerde oje ile sabitleyin ve floresan mikroskop kullanarak slaytları görüntüleyin. Bu protokol floresan c.albicans in vitro ve ev sahibi dokularda etiket için kullanılabilir. In vitro propagated hyphae, yuvarlak maya hücreleri, bağırsak hücreleri, ve opak hücreler sabit edildi, permeabilized, ve floresan ve faz kontrast mikroskopisi ile ayırt edildi.

Yuvarlak mayalar ve yüksek uzamış hyphae fare kalın bağırsaklarda görüntülenmiştir. Ev sahibi dokular C.albicans spesifik sonda veya panfungal sonda ile lekeli edildi. C.albicans kırmızı, konak hücre çekirdekleri mavi ve mukus tabakası yeşil etiketli oldu.

C.albicans hemen ev sahibi mukoza ve bağırsak lümen daha merkezi bölgelere bitişik bölgeleri de dahil olmak üzere murine GI yolu farklı segmentlerinde tespit edildi. Daha önce gavaj tekniğini gerçekleştirmemiş bilim adamları için, bu yöntemi denemeden önce özel eğitim almak önemlidir. Balık boyama sonrasında, immünofloresan teknikleri konak mukozanın ek özelliklerini lekelemek için kullanılabilir.

Bu doku hasarı veya konak bağışıklık yanıtları karakterizasyonu için izin verebilir. Bu teknik bize Candida albicans mutantların mantar hücre morfolojisi ve ev sahibi içinde hayatta kalma arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için izin verdi Candida albicans biyoloji anlayışımızı ilerletmek bu zaman tedavi geliştirirken yararlanılabilir.