Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi
25 Eylül 2019
Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.
Bu protokol, dendritik arbor'un dal dinamiklerini ölçmek ve canlı zaman atlamalı görüntüleme ve 3D görüntü ek açıklama yazılımı kullanarak nöronlar geliştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, dendritik filopodia'nın dinamik davranışlarını ölçmek için hızlı ve verimli bir yöntem sağlayan dal terminallerini görüntüler ve izler. Bu yöntemi kullanarak yapılan araştırmalar, gelişim ve aktivitenin dendrite morfogenezi nasıl düzenlediğini anlamayı sağlar.
Yöntemlerimiz hem in vitro hem de in vivo ortamlarda seyrek etiketli nöronlar için geçerlidir. Bu yordamı gerçekleştirirken, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğe ulaşmak için görüntüleme parametrelerinin dikkatle ayarlanması gerektiğini unutmayın. Larva drosophila beyin hasat için, bir diseksiyon mikroskop altında bir çift beş standart uç diseksiyon forceps yerinde bir larva örneği tutmak için diğer kullanırken dikkatle beyin dışarı incelemek için, göz diskleri, beyin lobları ve ventral sinir kordonu koruyarak.
Daha sonra görüntüleme sırasında numunenin herhangi bir hareketini en aza indirmek için bağlı kasları çıkarın. Tüm beyinler hasat edildiğinde, bir cam slayt üzerine bir kare oda çizmek ve hazneye 20 mikrolitre harici tuzlu çözelti eklemek için vakum yağı kullanın. Beyinleri odaya aktarmak ve sırt kenarları yukarı bakacak şekilde mikroskop altındaki beyinlerin pozisyonlarını ayarlamak için çersepsi kullanın.
Bir cam kapak fişi ile oda kapağı ve görüntüleme işlemi sırasında örnek sürüklenen azaltmak için kapak fişi hafifçe basın. Ayrı ayrı etiketlenmiş nöronlar içeren beyin ekstrelerini tanımlamak için, diseksiyondan sonraki 30 dakika içinde 40X su daldırma hedefi ve epifloresan ışık kaynağı seçin. 920 nanometre ve Dscan olmayan bir dedektöre ayarlanmış iki foton lazer seçin ve görüntüleme parametrelerini 512'de kare başına 512 piksel ve 10 dakika boyunca Z-stack başına bir dakika olarak toplamak için ayarlayın.
Daha sonra, bir dakika içinde tüm dendritik arbor kapsama sağlarken yeterli X, Y, Z çözünürlüğü elde etmek için optik ve dijital zum ayarlayın. Ayarlar, 0,11 x 0,11 x 0,25 mikrometre ile tipik bir X, Y, Z çözünürlüğüne sahip görüntüler oluşturur. Drift düzeltme için, uygun bir drift düzeltme yazılımı programında ilgi dosyasını açın ve Mikroskobik Parametreleri Edit ve Edit'i tıklatın.
İki foton seçeneği varsa, iki foton görüntüsü için mikroskop türünü Geniş Alan olarak ayarlayın ve yazılım tarafından tanımlanan iş akışını izleyin. Deconvolution için, deconvolution yazılımında sürüklenen görüntüyü açın ve iş akışını izleyin. Ardından, 4B verileri çözümleme ve görüntü içindeki tanımlı noktaların uzamsal koordinatlarını raporlama yeteneğine sahip sonraki görüntü ek açıklama yazılımı tarafından desteklenen bir dosya türünde deconvolved görüntü kaydedin.
Görüntü ek açıklama için, görüntü ek açıklama yazılımında deconvolved görüntü açın ve incelemek ve 3D her zaman noktalarında şube ipuçlarını işaretleyin. Görüntü ek açıklama yazılımı, işaretli dal ipuçlarının uzamsal ve zamansal koordinatlarını bildirir ve saklar. Sonraki hesaplamalar için koordinat bilgilerini CSV dosyası olarak dışa aktarın.
Noktalar modülünde Otomatik Oluşturmayı Atla'yı tıklatın, El ile Edin'i tıklatın ve Otomatik Bağlantı'yı Seçili Nokta onay kutusuna işaretleyin. Zaman serisindeki kareleri gözden geçirin ve ek açıklama için bir dal seçin. Shift tuşunu basılı tutarak, nokta eklemek için şube terminal ucunu tıklatın.
Ardından, İstatistikler sekmesini tıklatın, Ayrıntılı, Belirli Değerler ve Konum'u seçin. Kaydedilen mekansal ve zamansal koordinat bilgileri görüntülenir. Verileri CSV dosyası olarak aktarmak için Kaydet'i tıklatın.
Şube ipucu yerleşimini 3B olarak hesaplamak için CSV dosyasını elektronik tablo olarak açın ve İzID sütununa seçin. En Küçükten En Büyüye Sırala'yı tıklatın ve Seçimi Genişlet'i kabul edin. Sıralamadan sonra, Track ID her benzersiz dendritik dalı tanımlar ve aynı daldaki noktalar aynı Track ID.The Time sütunundaki noktaları paylaşır ve farklı zaman dilimlerindeki bilgileri saklar.
Elektronik tabloda, bir Mesafe sütunu ekleyin ve her iki zamansal bitişik noktanın uzaklıklarını hesaplamak için koordinatları kullanın. Tek voxel düzeyindeki küçük hareketleri ölçmek için, düzeltilmemiş sürüklenen veya kusurlu görüntü ek açıklamalarını filtrelemek için 0,3 mikrometreden küçük tüm mesafe değerlerini sıfırlayın. Ardından, Bir Yer Değiştirme sütunu oluşturun ve uzaklık sütunundaki değerleri Yer değiştirme sütununa kopyalayın.
Her şube ucu için uzantı ve geri çekme olaylarını el ile atayın. Bu bir uzantıysa, pozitif yer değiştirme değerini değiştirmeden bırakın. Bu bir geri çekme ise, karşılık gelen yer değiştirme değerini negatif değere değiştirin.
Ardından, yeni bir Olay sütununda, tek tek uzantı ve geri çekme olayları için yer değiştirme değerlerini toplayın. Bu videoda, ventral lateral nöron etiketli bir temsilciden toplanan maksimum yoğunluklu yansıtılan görüntü serileri gözlemlenebilir. Tek kare görüntüler, geri çekme ve uzatma olaylarının değerlendirilmesini sağlar.
Şube terminallerinin yarı otomatik 4D takibi, tek tek etiketlenmiş ventral lateral nöronların dinamik dal terminallerinin gösterildiği gibi ek açıklamayapılmasına olanak sağlar. Her zaman noktasında dal hareketlerinin yönü ve uzaklığı hesaplanması, farklı gelişim selevrelerinde ayrı ayrı etiketlenmiş ventral lateral nöronlar için dendritik dal dinamiğinin karşılaştırılmasına olanak sağlar. En önemli adım diseksiyon ve montaj sırasında beyin dokusu ve dendrit morfolojisinin bütünlüğünü korumaktır.
Ham görüntü serisi kalitesi de başarılı izleme ve nicelik lendirme için önemlidir. Bu tekniği kullanarak drosophila santral nöronların geliştirilmesinde dendrit filopodia'nın kantitatif analizini yapma ve dendrit maturasyonu ve sinaptogenez ile ilgili moleküler makineleri keşfetme becerisi kazandık.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, canlı Drosophila larval beyinlerindeki yüksek hareketlilikli dendritik filopodia görüntüleme yöntemi sunar. Zaman aşımı 3D görüntülemeyi kullanarak, protokol gelişmekte olan nöronlardaki dendritik ağaç dallarının dal dinamiklerini ölçer ve gelişim ve aktivite tarafından düzenlenen dendrit morfogenezine dair bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Dendritik filopodia, sinaptojenezis ve sinir devresi gelişiminde kritik bir rol oynar.
- Dendrit dinamiklerini anlamak, nöronal plastisite ve fonksiyon hakkındaki bilgiler için gereklidir.
- Canlı görüntüleme teknikleri, gelişim sırasındaki nöronal değişikliklerin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
- Dendritik dinamiklerin doğru ölçümlendirilmesi, düzenleyici mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Canlı ortamda dendritik filopodia izlemek için sağlam bir yöntem geliştirmek.
- Gelişmekte olan nöronlardaki dallanma dinamiklerini değerlendirmek.
- Nöronal aktivite ve gelişimin dendritik morfolojiyi nasıl etkilediği hakkındaki bilgilere katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Drosophila larval beyinlerinde canlı zaman aşımı görüntüleme.
- Dal uçlarını takip etmek için 3D görüntü açıklama yazılımı kullanıldı.
- Görüntüleme parametreleri, diseksiyon sırasında zamansal ve uzamsal çözünürlük için optimize edildi.
- Görüntüleme sonrası analiz, kayma düzeltme, dekonvolüsyon ve dal uçlarının manuel açıklamasını içerir.
- Nicel analiz, dendritik dal uçlarının mesafelerini ve hareketlerini hesaplamayı içerir.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, gelişmekte olan nöronlardaki dendritik filopodiaların dinamik davranışlarını başarıyla izledi.
- Her dendritik dalın uzama ve daralma olayları nicel olarak değerlendirildi.
- Görüntü kalitesi ve doku bütünlüğü, doğru izleme ve ölçümlendirme için kritik öneme sahipti.
- Bu yaklaşım, farklı gelişim evreleri arasında karşılaştırmalı analizlerin yapılmasını sağlar.
Sonuçlar
- Bu çalışma, dendritik filopodia dinamiklerinin nicel analizi için yeni bir protokol sunar.
- Yöntem, gelişim ve nöronal aktivitenin dendritik morfolojiyi nasıl düzenlediğini anlamamızı geliştirir.
- Elde edilen bilgiler, sinaptik oluşum ve nöronal bağlantı üzerine araştırmalara katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying dendritic branch dynamics enables mechanistic de-risking in neurodevelopmental target validation by linking structural plasticity to functional outcomes. This approach supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative readouts of neurite morphogenesis relevant to synaptic formation pathways. The method’s applicability to sparsely labeled neurons in vitro and in vivo enhances translational continuity across model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to neurite outgrowth and synaptic partner engagement through direct measurement of filopodial dynamics.
- Operational Value: Provides a standardized framework for assessing target engagement effects on dendritic complexity in phenotypic screening assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved data on branch tip movements that can serve as phenotypic readouts for compound-induced neurodevelopmental effects.
- Operational Value: Supports assay standardization through drift correction, deconvolution, and coordinate-based tracking, improving reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by enabling comparison of dendritic dynamics across developmental stages or genetic perturbations linked to neurodevelopmental disorders.
- Operational Value: Produces translatable metrics (extension/retraction events, displacement) that bridge in vitro findings to in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting live imaging data into quantifiable dynamics that inform lead identification and preclinical risk assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targets regulating cytoskeletal remodeling and activity-dependent neurite stabilization.
- Screening: Enables assay readiness through standardized imaging protocols and post-processing pipelines that ensure data consistency.
- Analytics: Delivers quantitative outputs (distance, displacement, event summation) that allow objective comparison of dendritic behavior across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing measurable neurite dynamics that correlate with synaptic maturation and circuit formation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform applicable to diverse neuronal models and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation by linking molecular perturbations to dynamic structural phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized drift correction, deconvolution, and manual annotation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, quantitative neurite morphology data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on dendritic complexity and synaptic readiness.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live imaging, neuronal dissection, and 4D image annotation software for accurate terminal tracking.
- Depends on high-resolution microscopy systems capable of 3D time-lapse acquisition with sufficient temporal resolution to capture fast filopodial dynamics.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, drift correction protocols, and annotation criteria to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different neuronal types or model systems with varying arbor complexity.
- Dependent on preserving tissue integrity during dissection and mounting, as physical disruption directly impacts data quality and tracking accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Larval Brain Explant Dissection and Mounting
2:04
Live Time-Lapse Imaging
3:02
Drift Correction and Deconvolution
3:54
Image Annotation
5:06
Dynamic Dendritic Branch Calculation
6:43
Results: Representative Dynamic Dendritic Branch Terminal Tracking
7:34
Conclusion
