Name: Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Öğrenin, merkezi sinir sistemi mikrodamarlarını ultrasantrifüj gerektirmeden bir günde izole etme yöntemini. Bu teknik, lissensefalik ve giriseefalik omurgalılar arasında karşılaştırmalı vasküler analiz yapmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Cruz-Orengo California Üniversitesi, Davis, Veterinerlik Okulu Start Up Fonları tarafından desteklendi.

Bu çalışmanın tüm prosedürleri Kaliforniya Üniversitesi (UC), Davis Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen kurallara uygundur. UC Davis hayvan bakımı çeşitli bağımsız kaynaklar tarafından düzenlenir ve tam Değerlendirme ve Laboratuvar Hayvan Bakımı Uluslararası Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından 1966 yılından bu yana akredite edilmiştir. Porcine CNS dokuları UCD Hayvan Bilimleri Bölümü Et Bilimleri Laboratuvarı'ndan alındı. Rhesus makaklarından CNS dokuları Kaliforniya Ulusal Primat Araştırma Merkezi Patoloji Bölümü'nden (NIH P51OD011107) alındı. Laboratuvar personeli tarafından domuz ve makaklara anestezi, ötenazi veya nekropsi yapılmadı. Bu nedenle, bu konularda özel bir öneri yoktur.
NOT: Bu yöntem birden fazla tür için doğrulanmıştır, ancak sağlanan protokol fare ve domuz dokularına daha doğrudan karşılık gelir. Memeli örnekleri kullanırken optik lobile ilgili ayrıntılar geçerli değildir. Tüm biyolojik tehlikeli maddeler uygun bir biyogüvenlik düzeyinde (BSL) tesiste kullanılmalıdır. Tüm akut toksik maddeler bir duman kaputunun altında ele alınmalıdır. Tüm biyolojik tıbbi atıklar ve akut toksik atıklar düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.
1. Hazırlık
<ol><li>En az bir gün öncesinde çözümler hazırlayın (Tablo 1). NOT: 70 kDa molekül ağırlığı (MW) dekstran eritmek çok zordur. Çözeltinin parafin film veya folyo ile kaplı bir gecede karıştırmak için daha verimlidir. Protokol, araştırma altındaki numuneye bağlı olarak iki farklı MV-2 çözeltisi kullanılmasını gerektirir. %18 dekstran, küçük lissensefalik numuneler üzerinde protokolü gerçekleştirirken miyelini mikrodamar peletinden verimli bir şekilde ayırır. Ancak, büyük jirensefalik örneklerden CNS dokuların arayüzü içinde miyelin bir yayma geliştirir, yanı sıra hipotalamus ve küçük örneklerden hipofiz. Bu yayma% 20 dekstran kullanılarak önlenir.</li>
	<li>Poli-D-lizin kuyusu başına 50 μL yükleyerek iyi kaydıraklar hazırlayın ve tercihen biyolojik güvenlik kabini sınıfı 2 (BSC-2) ile oda sıcaklığında (RT) 2 saat kurumasını bekleyin. Fazla kurmayın. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve kullanıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.</li>
</ol>2. Küçük Lissencephalic Vertebrat Örneğinden CNS Doku Diseksiyonu
NOT: Makale bir C57BL6/J, 10 haftalık, ~ 25 g, erkek fare protokolün uygulama gösterir.
<ol><li>Numune başına mv-1 çözeltisi olmak üzere sırasıyla 5 mL ve 1 mL'lik iki 15 mL konik tüp ve 1,7 mL mikrosentrifuge tüp hazırlayın. Tüpleri buzda tut.</li>
	<li>Anestezi<ol>
<li>Bir ketamin intraperitoneal enjeksiyon ile fareler anestezi, ksilazin, ve asetpromazine anestezik kokteyl 100/10/3 kg vücut ağırlığı başına mg ve sprey 70% etanol ile. Palpebral ve pedal reflekslerinin eksikliğini göz değdirerek ve sırasıyla bir ayağı çimdikleyerek değerlendirerek anesteziyi doğrulayın.</li>
		<li>Bir indüksiyon anestezi kutusu kullanarak% 5 isofluran inhalasyon güvercinler anestezi.</li>
		<li>Su tankı veya amfibi Ringer çözeltisi(Malzeme Tablosu)tutan bir balıkta %1 Tricaine'de balık ve kurbağaları anestezi edin.</li>
		<li>Ötanaziden önce 4 °C'de soğuyarak kertenkeleleri anestezi edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cerrahi makas ile hayvan Decapitate, kafatası ortaya çıkarmak için forseps ile deri soyma, ve foramen magnum ile LaGrange makas ile kesilmiş (Şekil 1A).</li>
	<li>Spatula ile beyni parçalayın ve MV-1 solüsyonu olan 15 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.</li>
	<li>Forseps ile kafatasısella turcica hipofiz almak ve MV-1 çözeltisi ile 1.7 mL mikrosantrifüj tüp transfer. Tüpü buzda tut.</li>
	<li>Vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri ve kas çıkarın. Ekstremiteleri, göğüs kafesini ve iç organları kesin(Şekil 1B).</li>
	<li>Aşağıda açıklanan iki yöntemden biri ile omuriliği inceleyin. Daha sonra MV-1 çözeltisi ile 5 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.<ol>
<li>LaGrange makas ile kaudal yönde bir rostral keserek laminektomi gerçekleştirin, servikal vertebra foramenile başlayan , lomber kordon ulaşana kadar.</li>
		<li>18 G iğne ve MV-1 çözeltisi yüklü 10 mL şırınga ile lomber vertebra foramen boyunca rostral yönde bir kaudal yıkama gerçekleştirin(Şekil 1C,D). NOT: Bu yöntem sadece çok küçük örnekler, çoğunlukla kemirgenler (<100 g) ile çalışır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, bahar makas ile omurilikten dural kese kesmek ve çift uçlu pick ile kalan menenjler kaldırmak(Şekil 2).</li>
	<li>Beyni Petri kabına aktarın ve bir diseksiyon dürbünü kullanarak, çift uçlu kazma ile menenjleri çıkarın(Şekil 2A–C).</li>
	<li>Koku ampulleri ve talamus forceps, iris makas ve bahar makas ile excise. Çift uçlu pick kullanarak, tüm beyin ventriküllerinden koroid pleksus kaldırın. Tüm koroid pleksus kaldırmak için emin olun. NOT: Koroid pleksus ve koku ampulleri büyük bir kontaminasyon kaynağıdır. BBB aksine, bu kılcal damarlar yüksek fenestrated ve onlar kaldırılmaz eğer sonraki deneylerin sonuçları tehlikeye olacaktır.</li>
	<li>Forseps kullanarak, farklı CNS bölgeleri ayırın: korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob (memeli örnekleri üzerinde değil) ve hipotalamus.</li>
</ol>3. Büyük Jirensefalik Omurgalı Örneğinden CNS Doku Diseksiyonu
NOT: Bu protokol, mezbahadan elde edilen domuz CNS dokularını kullanır. Bu nedenle, hiçbir anestezi, ötenazi veya nekropsi burada açıklanan veya gösterilmiştir.
<ol><li>Bir buz sandığı / kova içinde MV-1 çözeltisi yüklü bir 0.946 L (32 oz) histoloji konteyner içinde taşıma domuz CNS dokuları.</li>
	<li>Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, bir çift uçlu pick, forceps, iris makası ve bahar makası ile menenjler çıkarın her CNS doku. Beyin ventriküllerinden koroid pleksus parçalarını çıkardığınızdan emin olun.</li>
</ol>4. CNS Doku Homojenizasyonu
NOT: İki araştırmacıhomojenizasyon sürecine girdiğinde daha verimlidir: biri steroskop altında menenjlerin kesilmesi, diğeri ise kıymalı dokuların homojenleştirilmesidir. Bu şekilde, dokular hızla buz kovası döndürülür ve soğuk tutulur.
<ol><li>Her CNS bölgesini ~1 mL MV-1 çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Tek kenarlı bir bıçak kullanarak, 1-2 mm adet elde etmek için doku kıyma.<ol>
<li>Küçük bir omurgalı numunesi için 100 mm x 20 mm Petri kabı kullanın.</li>
		<li>Büyük bir omurgalı numunesi için 150 mm x 15 mm Petri kabı kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küçük bir omurgalı örneğinin homojenizasyonu (Tablo 2 ve Tablo 3)<ol>
<li>Transfer pipeti kullanarak ptfe zararlısı ile tek bir 10 mL Potter-Elvehjem cam doku öğütücüsünün korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omuriliği ~1 mL MV-1 çözeltisine aktarın. 5 mL MV-1 çözeltisi ekleyin ve her dokuyu homojenize edin (~10 vuruş). Bireysel 15 mL konik tüplere aktarın. Tüpleri buzda tut. NOT: Optik loblu veya optik lobsuz küçük bir omurgalı için sırasıyla 10 mL Potter-Elvehjem öğütücüler ve 15 mL konik tüp gereklidir.</li>
		<li>Tek bir 1,7 mL tüpte forsepsli hipotalamus ve hipofiz ~100 μL MV-1 çözeltisine aktarın ve cam mikroteksle dikkatlice homojenize olun. Her mikroengiyi ~1 mL MV-1 çözeltisi ile durulayın. Tüpü buzda tut. NOT: Küçük bir omurgalı için 2 cam mikrotekles ve 1.7 mL tüp gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Büyük bir omurgalı örneğinin homojenizasyonu (Tablo 4 ve Tablo 5)<ol>
<li>Bir transfer pipet kullanarak, bir PTFE havaneli ile 55 mL Potter-Elvehjem cam doku öğütücü için kıyma doku aktarın ve havai karıştırıcı eklemek. Homojenize edilen belirli CNS kısmına göre önerilen MV-1 çözeltisi hacminin yarısını ekleyin (Tablo 5).</li>
		<li>Çok düşük hızda (~ 150 rpm) havai karıştırıcı açın ve dikkatle yukarı ve aşağı yaklaşık 30 s için cam tüp hareket ettirin.</li>
		<li>Havai karıştırıcıyı kapatın, daha fazla MV-1 çözeltisi ekleyin ve homojen bir bulamaç elde edene kadar adım 4.3.2'yi tekrarlayın.</li>
		<li>50 mL konik tüpe aktarın. Tüpü buzda tut.</li>
		<li>Her CNS doku homojenizasyonu arasında değirmeni deiyonize su ile yıkayın. NOT: Büyük bir omurgalı için 5 veya 4, beyaz maddeli veya beyaz maddesiz, sırasıyla 50 mL konik tüplere ihtiyaç vardır. Aynı şekilde hipotalamus ve hipofiz için iki (2) 15 mL konik tüp gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Mikrodamar Arınma
<ol><li>4.2.1, 4.2.2 veya 4.3.4 adımdan kaynaklanan santrifüj dokusu, 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g.'de homojendir. Kırmızımsı mikrodamarların peletlerinin üstünde miyelinin büyük beyaz bir arabirimi oluşacaktır. Supernatants atın.<ol>
<li>Küçük omurgalı örneği (Tablo 2 ve Tablo 3)<ol>
<li>5 mL serolojik pipet (~10 floş) ile 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisinde korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik peletlerini yeniden askıya alın. Her süspansiyona 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve tüpleri çevirerek dikkatlice karıştırın.</li>
			<li>1 mL MV-2 solüsyonu ile hipotalamus ve hipofiz peletlerini yeniden askıya alın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Büyük omurgalı örneği (Tablo 4 ve Tablo 5)<ol>
<li>Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik mikrodamar peletlerine 20 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin. Bir tüp revolver shaker üzerinde karıştırarak pelet resuspend, ~ 5 dk için 40 rpm karıştırarak. Daha fazla MV-2 çözeltisi ekleyerek korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik süspansiyonları konik tüpler 'hacimleri dengesi.</li>
			<li>5 mL serolojik pipet (~10 floş) ile 5 mL MV-2 çözeltisinde hipotalamus ve hipofiz mikrodamar peletlerini yeniden askıya alın. Süspansiyonlara 5 mL buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve tüpü çevirerek dikkatlice karıştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 °C'de 15 dk için 4.400 x g santrifüj.</li>
	<li>Tüpleri yavaşça döndürerek ve süpernatantın duvarlar boyunca geçmesine izin vererek her tüpün duvarlarından sıvı arabirimindeki kalın ve yoğun miyelin tabakasını dikkatlice ayırın.</li>
	<li>Miyelin ve sıvı arabirimini atın ve her tüpün iç duvarını düşük tiftikli kağıt mendille sarılmış bir spatula ile lekelayın. Küçük omurgalı örnekleri için, transfer pipeti ile dikkatlice emerek her hipotalamus ve hipofiz tüpünden miyelin tabakasını çıkarın.</li>
	<li>Bükümlü düşük tiftik kağıt mendili yle fazla sıvıyı silin. Düşük bağlayıcı ipuçları kullanarak 1 mL MV-3 çözeltisi ile her peleti yeniden askıya alın. Tüpleri buzda tut.</li>
</ol>6. Mikrodamar Elüsyonu ve Filtrasyonu
<ol><li>Her CNS bölgesi için ayrı ayrı gagalara buz gibi MV-3 çözeltisi dökün. 4 °C'de tutun.<ol>
<li>Küçük omurgalı numuneler için, 50 mL kabı başına 10 mL MV-3 çözeltisi kullanın. Optik lobun dahil olup olmadığına bağlı olarak toplam 6-7 beare gereklidir.</li>
		<li>Büyük omurgalı numuneler için, 100 mL kabı başına 30 mL MV-3 çözeltisi kullanın. Beyaz maddenin dahil olup olmadığına bağlı olarak toplam 6-7 gaga gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mL konik tüpün üzerine bir hücre süzgeci yerleştirin. CNS bölgesi başına bir tane kullanın. Korteks, beyin sapı, optik lob, omurilik ve hipofiz için 100 μm süzgeç kullanın. Beyincik ve hipotalamus için 70 μm hücreli süzgeç kullanın.</li>
	<li>Her süzgecinizi 1 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslayın.</li>
	<li>Agregalardan kaçınmak için karıştırırken serolojik pipetle adım 5.5'te hazırlanan süspansiyonlara daha fazla MV-3 çözeltisi ekleyin. Mikro damarları süzgeç üzerine dikkatlice yükleyin. Buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.<ol>
<li>Küçük omurgalı numuneler için(Tablo 2 ve Tablo 3),serolojik pipet le 10-15 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 5 mL MV-3 çözeltisi ile durulayın.</li>
		<li>Büyük omurgalı numuneler için, serolojik pipet ile 20 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 10 mL MV-3 çözeltisi ile durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtreleme ünitesini modifiye edilmiş bir filtre tutucuya(Şekil 2D)CNS bölgesi başına bir adet 20 m naylon net filtre yerleştirerek monte edin.<ol>
<li>Küçük omurgalı örnekleri için(Tablo 2 ve Tablo 3),korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik için 25 mm modifiye filtre tutucular kullanın. Hipotalamus ve hipofiz için 13 mm modifiye filtre tutucu kullanın.</li>
		<li>Büyük omurgalı örnekleri için(Tablo 4 ve Tablo 5),korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik için 47 mm modifiye filtre tutucular kullanın. Hipotalamus ve hipofiz için 25 mm kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtreyi 50 mL konik bir tüpün üzerine yerleştirin ve 5 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslak filtre yiyerek tamponun filtre tutucudan konik tüpe dökülmesini önleyin.</li>
	<li>Eluted mikrodamarları (adım 6.4)'ı 20 μm naylon net filtrenin üzerine aktarın ve mikro damarları 5-10 mL buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.</li>
	<li>Filtreyi temiz forsepsler kullanarak kurtarın ve 6.1 adımda hazırlanan buz gibi MV-3 çözeltisini içeren kabın içine batırın.</li>
	<li>Mikro damarları filtreden yaklaşık 30 s boyunca hafifçe sallayarak ayırın. Küçük omurgalı örnekleri için, 15 mL konik bir tüp içinde beher içeriği dökün. Büyük omurgalı örnekleri için, 50 mL konik bir tüp içinde beher içeriği dökün.</li>
	<li>4 °C'de 5 dk için 2.000 x g'lık santrifüj ve düşük bağlayıcı lı pipet ucu kullanarak 1 mL buz gibi MV-3 çözeltisi içinde peleti yeniden askıya alın.<ol>
<li>Küçük omurgalı numuneler için süspansiyonu (adım 6.10'dan) 1.7 mL mikrosantrifüj tüpe ve santrifüje 20.000 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya aktarın. NOT: Bu dönüş, sağlam bir verim sağlamak için maksimum hızda (~20.000 x g)tezgah üstü bir santrifüjde gerçekleştirilir.</li>
		<li>Büyük omurgalı numuneler için, 6.10 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne süspansiyonu aktarın, 4 mL MV-3 çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de 5 dk için 2.000 x g'de santrifüj ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. İmmünoboyama
NOT: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyası protokol fizibilitesinin kanıtı olarak sürüngen, amfibi ve balık örneklerine yapıldı. Bu nedenle, bu örnekler için immünetiketleme için bir öneri yoktur.
<ol><li>Mikrosantrifüj tüplerinden süpernatant çıkarın.</li>
	<li>Düşük bağlayıcı lı pipet ucu(Malzeme Tablosu)kullanarak 1x steril PBS pelet resuspend . Mikro damarların birden fazla kez boru landırarak agrega oluşturmasını engelleyin. Küçük omurgalı numuneler için(Tablo 3),pelet boyutuna göre ~100 μL-2.000 μL kullanın. Büyük omurgalı örnekleri için(Tablo 5),pelet boyutuna göre ~1.000 μL-4.000 μL kullanın.</li>
	<li>Düşük bağlayıcılı pipet ucu kullanarak, mikro damarları iyi kaydıraklara aktarın, yan duvarlardan kaçınarak her kuyunun ortasına eklemeye dikkat edin.</li>
	<li>Bir BSC-2 içinde ortaya iyi slaytlar ayarlayın ve RT 20 ila 30 dakika kurumaya bırakın. NOT: Agrega oluşumunu önlemek için nispeten yüksek hacimli 1x PBS kullanılır. Bu nedenle, mikrodamarların poli-D-lizin kaplama tarafından tutulduğundan emin olmak için fiksasyon dan önce slaytların kurutulması gerekmektedir.</li>
	<li>Bir transfer pipeti ile pipetleme yaparak artık 1x PBS'yi çıkarın, 200 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Pipet fiksatif çözeltiyi dışarı ve RT 5 dakika için 1x PBS 200 μL ile 3x yıkayın. NOT: Bu noktada balık, amfibi ve sürüngen CNS mikrodamarlarında H&E boyama işlemi yapıldı.</li>
	<li>Kuyu kaydıraä ına 200 μL engelleme tamponu ekleyin ve 37 °C' de 60 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir transfer pipet ile engelleme tampon u çıkarın ve antikor dilüent(Malzeme Tablosu)birincil antikor kokteyl 200 μL ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ana antikor kokteylini çıkarmak için pipet ve RT'de 5 dakika boyunca 200 μL 1x PBS ile 3x yıkayın.</li>
	<li>1x PBS'de seyreltilmiş ikincil antikor kokteylini(Malzeme Tablosu)yükleyin ve RT'de 2 saat boyunca ışıktan korunan kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Pipet ikincil antikor kokteyli dışarı ve 3x 200 μL 1x PBS ile 5 dakika RT, ışıktan korunan. Son yıkamadan sonra iyi kaydıraktan sonra kaydıraktan sonra çerçeveyi ayırın ve 1x PBS'yi düşük tiftik kağıt silme ile kurulayın.</li>
	<li>Bir coverslip ekleyin, sıvı antifade montaj lı orta, ve 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) nükleer boyama için. RT'de bir gecede ışıktan korunarak kurusun.</li>
	<li>Kuruduktan sonra, konfokal mikroskopi ve veri toplama için hazır olana kadar 4 °C'de bir slayt kutusundaKi ışıktan korunun.</li>
</ol>

<ol><li>Bundgaard, M., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+vertebrates+started+out+with+a+glial+blood-brain+barrier+4-500+million+years+ago%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago.</a> Glia. 56, 699-708 (2008).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).</li>
<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+regulation+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders.</a> Neuroscience Letters. , (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+brain+vasculature+in+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders.</a> Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+Physiology+to+Disease+and+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back.</a> Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).</li>
<li>Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the blood-brain barrier.</a> Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).</li>
<li>O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+barriers%3A+a+comparative+look+at+the+blood-brain+barrier+across+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms.</a> Genes & Development. 32, 466-478 (2018).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR7+influences+leukocyte+entry+into+the+CNS+parenchyma+by+controlling+abluminal+CXCL12+abundance+during+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).</li>
<li>Serres, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1-targeted+magnetic+resonance+imaging+reveals+subclinical+disease+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis.</a> FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).</li>
<li>Tietz, S., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers%3A+Crosstalk+between+complex+tight+junctions+and+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions.</a> Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).</li>
<li>Sohet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSR%2Fangulin-1+is+a+tricellular+tight+junction+protein+involved+in+blood-brain+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation.</a> Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).</li>
<li>Cruz-Orengo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+expression+underlies+female+CNS+autoimmunity+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).</li>
<li>Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Straightforward+method+for+singularized+and+region-specific+CNS+microvessels+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+human+brain+pericytes+and+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).</li>
<li>Granberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+cortical+and+white+matter+neuroaxonal+pathology+in+early+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2912-2926 (2017).</li>
<li>Datta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+its+relationship+to+changes+in+brain+volume+and+white+matter+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 140, 2927-2938 (2017).</li>
<li>Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+Techniques+to+Assess+Inflammation+in+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis.</a> Neuroscience. 403, 4-16 (2019).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).</li>
<li>Cornford, E., Hyman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+brain+endothelial+luminal+and+abluminal+transporters+with+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy.</a> NeuroRx. 2, 27-43 (2005).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).</li>
<li>Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+analysis+of+Claudin-5+reveals+significant+endothelial+heterogeneity+among+CNS+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels.</a> Microvascular Research. , (2012).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+pathology+in+human+brain+microvessel+extracts+from+the+parietal+cortex%3A+relation+with+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).</li>
<li>Porte, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+transcriptomic+study+of+brain+microvessels+in+neonatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice.</a> PLoS One. 12, e0171048(2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

BBB sıkı sofistike bir mimari ile birleştiğinde beyin mikrovaskületür endotel hücrelerinin benzersiz özelliklerini içerir,, "peg-soket"- kavşaklar, ve yapışma plakları CNS homeostaz için kritik2,3,19. Endotel hücreleri özellikleri indüklenen ve perisitler ve çevreleyen astroglia son ayak süreçleri2tarafından korunur,3,19. BBB mikrovaskü...

Beynimiz vücudumuzdaki en önemli organdır. Bu nedenle, normalden sapmayı tetikleyebilecek dış etkenlere rağmen beyin homeostazı tutmak bir önceliktir. Bazı bilim adamlarına göre, yaklaşık 400-500 milyon yıl önce1, omurgalı hayvanlar şimdi kan-beyin bariyeri (BBB)2,3olarak bildiğimiz geliştirdi . Bu koruyucu "çit" sıkı iyonların taşınması düzenleyerek merkezi sinir sistemi (CNS) homeostazı ve fonksiyonları üzerinde en büyük etkiyi uygular, moleküller, ve kan ve CNS parankim arasında hücrelerin taşınması. BBB bozulduğunda, beyin toksik maruzkalma duyarlı hale gelir, enfeksiyon, ve inflamasyon. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu ile ilişkili birçok, hepsi değilse, nörolojik ve nörogelişimsel bozukluklar4,5,6.
BBB sofistike fonksiyonu benzersiz CNS mikrovaskülküle nörovasküler birim (NVU) 2,3tarafından uygun atfedilir. Son derece özel endotel hücreleri, perisitler ve astrositik uç ayaklar NVU2,3hücresel bileşenleridir. Bu hücreler tarafından oluşturulan ekstrasellüler matriks de NVU ve BBB fizyolojisi için gereklidir2,3. NVU'nun temel hücresel ve moleküler bileşenleri omurgalılar arasında korunmuş olsa da, heterojenlik siparişler ve türler arasında rapor edilir7,8. Ancak, teknik sınırlamalar nörobiyoloji, biyomedikal veya çevirisel araştırmalardaki bu farklılıkları tam olarak göz önünde bulundurma yeteneğimizi engellemez.
Bu nedenle, beş omurgalı grubundan balık, amfibiler, sürüngenler, kuşlar ve memeliler gibi çok sayıda türe de uygulanabilmek için CNS bölgesine özgü mikrodamar izolasyon yöntemini genişlettik. Protokol, çevirisel alaka düzeyi9olan türler de dahil olmak üzere küçük lissensefalik ve büyük jinekolojik omurgalılarda kullanılmak üzere tanımlanmıştır. Ayrıca, bu bağlamda daha önce araştırılmayan, ancak nörofizyoloji ile ilgili ve muazzam klinik etkileri olan CNS'nin diğer bölgelerini de dahil ediyoruz: hipotalamus, hipofiz ve beyaz madde. Son olarak, nvu ve / veya BBB9,10,11 boyunca protein ekspresyonu değişiklikleri tanımlamak için güvenilir bir araç olarak bu izolasyon yöntemininkapasitesinitest etti. Kavram kanıtı olarak, EAE sırasında VCAM-1 ve JAM-B ekspresyonundaki değişikliklerin immünoresans tarafından izlenen izolasyon yöntemini kullanarak nasıl belirlenebileceğimizi gösterdik.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Bloke edici ve antikor seyreltici için kullanılır.</td></tr><tr><td>%20 PFA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15713-S</td><td>Fiksatif olarak kullanılır (%4 PFA)</td></tr><tr><td>70.000 MW Dekstran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>MV-2 çözeltisi için kullanılır</td></tr><tr><td>Adson Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları (FST)</td><td>11006-12</td><td>Kas ve cildin çıkarılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Adson Forseps, öğrenci kalitesi</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Yukarıdakiyle aynı ancak daha ucuz</td></tr><tr><td>Sığır serumu albümin (BSA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>MV-3 çözeltisi, bloke edici ve antikor seyreltici</td></tr><tr><td>Corning 100 & mu için kullanılır; m Hücre süzgeci</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 & mu; m Hücre süzgeci</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Masaüstü düşük bağlayıcı uçlar</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Aşağıdaki ile aynı ancak daha ucuz.</td></tr><tr><td>Cultrex Poli-D-Lizin Ar-Ge</td><td> D</td><td>3439-100-01</td><td>Sürgülü kaplama için kullanılır</td></tr><tr><td>Eşek anti-Keçi IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Eşek anti-Fare IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Eşek anti-Tavşan IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Eşek anti-Tavşan IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Çift Uçlu Doku Alma</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Meninkslerin ve koroid pleksusun çıkarılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Dumont #3c Forseps</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Daha hassas ve/veya küçük CNS doku işleme için kullanılır (hipofiz gibi)</td></tr> <tr><td>Dumont #7 Forseps</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>CNS tisssue diseksiyonu ve kullanımı için kullanılır</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forseps, öğrenci</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Yukarıdakiyle aynı ancak daha ucuz</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention İpuçları</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Yukarıdaki ipuçlarından daha iyi kalite (daha pahalı).</td></tr><tr><td>Ekstra İnce Graefe Forseps, tırtıklı</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Kemik çıkarmak için kullanılır</td></tr><tr><td>İnce Makas, keskin</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Domuz ve makak dural kesesinin çıkarılması için kullanılır</td></tr><tr><td>Cam Havaneli 1.5 mL Mikrosantrifüj Tüpü Doku Öğütücü Homojenizatör, 10'lu Paket</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Küçük veteriner hipotalus ve hipofiz için kullanılır.</td></tr><tr><td>Keçi anti-CXCL12, biyotinile</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen seyreltme: 1:20.</td></tr><tr><td>Keçi anti-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Nöroinflamasyonu değerlendirmek için birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Keçi anti-PDGFR ve beta;</td><td>Ar-Ge D</td><td>AF1042</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>İkincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Graefe Forseps, kavisli uç, 1X2 diş</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Naylon filtre ağını tutmak ve sallamak için kullanın</td></tr><tr><td>HBSS, 1X kalsiyum ve magnezyum içeren tampon</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>MV-1 çözeltisi için kullanılır</td></tr><tr><td>HEPES, 1M sıvı tamponu</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>MV-1 çözeltisi için kullanılır</td></tr><tr><td>İzolektin GS-IB4-Biotin-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Endotel hücre glikokalisinin D-galaktosil kalıntılarını bağlayan baklagil Griffonia simplicifolia'dan izole edilen glikoprotein. Kuş ve domuz CNS mikro damarları için kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>LaGrange Makas, tırtıklı</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Kafatası diseksiyonu ve laminektomi için kullanılır (domuz ve makak hariç)</td></tr> <tr><td>Millicell EZ slayt 8 oyuklu ünite</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Fare anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Fare anti-İnsan CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>Primat CNS mikrodamarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 16.5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Fare anti-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Fare anti-&alfa; SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Naylon Filtre Ağı, rulo</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>13 mm çapında filtre ağı disklerine kadar lazerle kesilmiştir. Küçük veteriner hipotalus ve hipofiz için kullanılır.</td></tr><tr><td>Naylon Filtre Ağları, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Hipotalamus ve hipofiz hariç çoğu küçük omurgalı CNS dokusunda kullanılır. Makak ve domuz hipotalamus ve hipofiz için kullanılır.</td></tr><tr><td>Naylon Filtre Ağları, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Hipotalamus ve hipofiz hariç, makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.</td></tr><tr>DAPI <td>ThermoFisher</td><td>P36935</td> <td>ile ProLong Gold antifade reaktifi</td><td>Slaytları kaplamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-LSR</td><td>Millipore Sigma</td><td>SAB2107967</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 1 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Sıçan anti-CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>Murin CNS mikrodamarları için birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Sıçan anti-GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Tüm örneklerden CNS mikro damarlarında birincil antikor olarak kullanılır. 1:200 oranında önerilen seyreltme.</td></tr><tr><td>Sıçan anti-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>Nöroinflamasyonu değerlendirmek için birincil antikor olarak kullanılır. Önerilen konsantrasyon: 5 &mu; g/mL'dir.</td></tr><tr><td>Steril Ringer Solüsyonu, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Amfibi anestezisi için kullanılır</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Biyotinile edilmiş primer antikorları etiketlemek için ikincil antikor olarak kullanılır. Önerilen 1:500 seyreltme.</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Biyotinile edilmiş birincil antikorları etiketlemek için ikincil antikor olarak kullanılır. Önerilen 1:500 seyreltme.</td></tr><tr><td>Cerrahi Makas, keskin</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Kas ve derinin çıkarılmasında kullanılır</td></tr><tr><td>Cerrahi Makas, keskin-künt</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Dekapitasyon için kullanılır (domuz ve makak hariç)</td></tr><tr><td>Swinnex Filtre Tutucu, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Lazer kesim ile modifiye edilmiştir. Küçük veteriner hipotalus ve hipofiz için kullanılır.</td></tr><tr><td>Swinnex Filtre Tutucu, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>Lazer kesim ile modifiye edilmiştir. Hipotalamus ve hipofiz hariç çoğu küçük omurgalı CNS dokusunda kullanılır. Makak ve domuz hipotalamus ve hipofiz için kullanılır.</td></tr><tr><td>Swinnex Filtre Tutucu, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Lazer kesim ile modifiye edilmiştir. Hipotalamus ve hipofiz hariç makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Bloke edici ve antikor seyreltici için kullanılır.</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac Tepegöz Karıştırıcı</td><td>VWR (Tedarikçi DWK Yaşam Bilimleri)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Hipotalamus ve hipofiz hariç, 55 mL doku öğütücülü makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.</td></tr><tr><td>PTFE havaneli Wheaton Potter-Elvehjem doku öğütücü, 10 mL</td><td>VWR (Tedarikçi DWK Yaşam Bilimleri)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Hipotalamus ve hipofiz hariç çoğu küçük omurgalı CNS dokusunda kullanılır. Makak ve domuz hipotalamus ve hipofiz için kullanılır.</td></tr><tr><td>PTFE havaneli Wheaton Potter-Elvehjem doku öğütücü, 55 mL</td><td>VWR (Tedarikçi DWK Yaşam Bilimleri)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Hipotalamus ve hipofiz hariç makak ve domuz CNS dokuları için kullanılır.</td></tr></tbody></table>

beş omurgalı grubu arasında merkezi sinir sistemi mikrodamarlarının güvenilir İzolasyon

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Mikrodamarların merkezi sinir sisteminden (CNS) izolasyonu genellikle çoğu kemirgenler olmak üzere birden fazla hayvanDan kortikal doku birleştirilerek gerçekleştirilir. Bu yaklaşım korteksiçin kan-beyin bariyeri (BBB) özelliklerinin sorgulanmasını sınırlar ve bireysel karşılaştırmaya izin vermez. Bu proje birden fazla CNS bölgelerinden nörovasküler birim (NVU) karşılaştırma sağlayan bir izolasyon yönteminin geliştirilmesi üzerinde duruluyor: korteks, serebellum, optik lob, hipotalamus, hipofiz, beyin sapı, ve omurilik. Ayrıca, başlangıçta mürin örnekleri için geliştirilen bu protokol, mikro damarları beyin yarımkürebeyaz maddesinden izole edebildiğimiz küçük ve büyük omurgalı türlerinCNS dokularında kullanılmak üzere başarıyla uyarlanmıştır. Bu yöntem, immünetiketleme ile eşleştirilmiş, protein ekspresyonu ve bireyler arasında istatistiksel karşılaştırma, doku tipi veya tedavi nicelik sağlar. Bu uygulanabilirliği, nöroinflamatuar bir hastalık olan multipl sklerozun bir minür modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) sırasında protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirerek kanıtladık. Ayrıca, bu yöntemle izole mikrodamarlar qPCR, RNA-seq ve Batı lekegibi downstream uygulamaları için kullanılabilir, diğerleri arasında. Bu ultracentrifugation veya enzimatik dissociation kullanmadan CNS mikrodamarları izole etmek için ilk girişimi olmasa da, tek bireyler ve birden fazla CNS bölgelerinkarşılaştırma için onun ustalık benzersizdir. Bu nedenle, aksi takdirde belirsiz kalabilir farklılıkların bir dizi soruşturma için izin verir: CNS bölümleri (korteks, serebellum, optik lob, beyin sapı, hipotalamus, hipofiz, ve omurilik), CNS doku tipi (gri veya beyaz madde), bireyler, deneysel tedavi grupları ve türleri.

Murine CNS'den izole edilen mikrodamarlar nörovasküler ünite2,3'üntüm içsel hücresel bileşenlerini gösterdi. Endotel hücreleri için trombosit endotel hücreli adezyon molekülü-1 (PECAM, CD31 olarak da bilinir) veya isolectin IB4 (endotel hücreli glycocalyx bağlayan bir glikoprotein) kullanarak, trombosit kaynaklı büyüme faktörü-β (PDGFRβ) veya perisitler için nöron-glial antijen 2 (NG2) ve astrositik uç ayaklar için aquaporin-4 (AQ...

Bu protokolün amacı lissencephalic ve gyrencephalic omurgalıların merkezi sinir sisteminin birden fazla bölgesinden mikrodamarları izole etmektir.

Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Bu protokol, farklı merkezi sinir sistemi bölgeleri arasında mikrovaskülkülatür karşılaştırmasağlar, çünkü önemli olduğu gibi, farklı bireyler arasında. Bu mikrodamar izolasyon tekniği tek bir gün içinde tamamlanabilir ve ultrasantrifüj ve enzimatik ayrışma ihtiyacını ortadan kaldırır. Menenjler ve koroid pleksus çıkarma zor olabilir.Her doku tam kaldırılmasını sağlamak için yavaş ve dikkatli bir şekilde çalışmak emin olun. Küçük bir lissencephalic omurgalı örnekten CNS doku diseksiyonu için, buzun üzerinde MV-1 solüsyonu içeren 15 mililitrelik konik tüp içine hasat beyin yerleştirin ve kafatasısella turcica hipofiz almak için forseps kullanın. Hipofiz buz üzerinde MV-1 çözeltisi 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp yerleştirin ve vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri ve kas çıkarın.Uzuvları çıkardıktan sonra, göğüs kafesi ve iç organlar, bel vertebraforamen boyunca bir kaudal-rostral yönde, taze MV-1 çözeltisi ile vertebral kolon floş için 18 gauge iğne ile donatılmış bir 10 mililitreşşöyşş. Sonra taze MV-1 solüsyonu içeren 5 mililitrelik tüp omurilik yerleştirin. Sonra, diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına beyin yerleştirin ve çift uçlu dikmek ile menenjler çıkarın.Menenjit parçaları nın kalmadığından emin olmak için omuriliği kontrol ettiğinizden emin olun. Hipotalamus, beyincik, beyin sapı ve korteks ayırmak için forceps kullanın. Gerektiğinde, koku ampulleri ve talamus çıkarmak için forseps ve iris ve yay makas kullanın ve tüm beyin ventriküllerinden koroid pleksus kaldırmak için çift uçlu dikmek kullanın.Büyük bir jirensefalik omurgalı örnekten CNS doku diseksiyonu için, bir diseksiyon mikroskop ve çift çatallı dikmek kullanın, forseps, ve iris ve yay makas her CNS dokumeningler kaldırmak için, beyin ventriküllerinden koroid pleksus herhangi bir parça kaldırmak için özen. Hasat edilen CNS dokularının homojenizasyonu için, her CNS bölgesini tek tek Petri tabakları içinde bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın. Küçük omurgalı örneklerden CNS dokuları homojenize etmek için, kıyma doku askıya almak için MV-1 çözeltisi bir mililitre eklemek için bir transfer pipet kullanın.Sonra korteks dağıtmak için aynı transfer pipet kullanın, beyincik, beyin sapı, optik lob, ve omurilik parçaları bireysel 10 mililitre cam doku öğütücüler içine, ve yaklaşık 10 vuruş için dokuların her bir dizi eziyet için bir PTFE havaneli ve MV-1 çözüm beş mililitre kullanın. Her doku bulamacını buz üzerinde tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hipotalamus ve hipofiyi 100 mikrolitre MV-1 çözeltisine tek tek 1,7 mililitrelik tüplere yerleştirmek için forseps kullanın. Sonra, dikkatle bir cam micropestle ile her doku homojenize.Büyük bir omurgalı örneğini homojenize etmek için, kıymalı dokuyu 55 mililitrelik cam doku öğütücüye aktarmak için yontma kesme pipeti kullanın ve öğütücüyü bir baş üstü karıştırıcıya takın. Önerilen MV-1 çözeltisi hacminin yarısını, tabloda belirtildiği gibi homojenize edilen belirli CNS kısmına göre ekleyin ve havai karıştırıcıyı dakikada yaklaşık 150 dönüşe çevirin. Homojen bir bulamaç elde edilene kadar, ek homojenizasyon için daha fazla MV-1 çözeltisi eklemek için tepedeki karıştırıcıyı kapatmadan önce cam tüpü yaklaşık 30 saniye boyunca dikkatlice yukarı ve aşağı hareket ettirin.Sonra homojenize dokuyu buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mikro damar arınması için, CNS dokusu santrifüj ile homojendir ve süpernatasyonları atın. Küçük bir omurgalı örnek mikrodamar izolasyoniçin, pipet korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik pelet, taze beş mililitre, buz gibi MV-2 çözeltisi örnek başına, yaklaşık 10 kez, her tüp için buz gibi MV-2 çözeltisi beş mililitre eklemeden önce.Tüpleri karıştırmak için dikkatlice çevirin ve bir mililitre MV-2 çözeltisinde hipotalamus ve hipofiz peletlerini yeniden askıya alın. Büyük omurgalı numune mikrodamar izolasyonu için, korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik mikrodamar peletlerine 20 mililitre buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve dakikada 40 dönüşte peletleri dakikada yaklaşık 5 dakika süreyle yeniden askıya alın. Yeniden süspansiyon sonunda, cns doku lycates santrifüj ile ayırın ve yavaş yavaş supernatant dikkatle tüp duvarlarından sıvı arayüzü üzerinde kalın ve yoğun miyelin tabakası ayırmak için duvar boyunca geçmesine izin vermek için her tüp döndürün.Miyelin ve sıvı arayüzleri atın ve her tüpün iç duvarını düşük tiftik lisi ile sarılmış bir spatula ile lekelayın. Daha sonra, aşırı sıvıyı emmek için bükülmüş düşük tiftik lisi kullanın ve her peleti bir mililitre MV-3 çözeltisinde yeniden askıya almak için düşük bağlayıcı ipuçları kullanın. Mikrodamar elution ve filtrasyon için, her CNS doku mikrodamar bulamaç taze MV-3 çözeltisi birkaç mililitre karıştırın ve agregaları önlemek için karıştırırken, ayrı 50 mililitre konik tüpler içine bir Pruitt süzgeç aracılığıyla her süspansiyon zorlanma.CNS bölgesi ne göre bir modifiye filtre tutucuüzerine 20 mikrometre naylon net filtre yerleştirin. Filtre tutucuyu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve filtreyi beş mililitre buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslayın, tamponun filtre tutucudan konik tüpe dökülmesini önleyin. Eluted mikrodamarları her 20 mikrometrenaylon ağ filtresine aktarın ve mikrodamarları 5 ila 10 mililitre buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.Her filtreyi buz gibi MV-3 çözeltisi içeren tek tek gagalara aktarmak için forseps kullanın ve mikro damarları ayırmak için her filtreyi yaklaşık 30 saniye hafifçe sallayın. 15 mililitrelik konik bir tüpe geçtikten sonra, santrifüj ile mikrodamarları toplayın ve her peleti bir mililitrelik buz gibi MV-3 çözeltisinde yeniden askıya almak için düşük bağlayıcı lı bir pipet kullanın. Daha sonra, küçük omurgalı örneklerden mikrodamar süspansiyonları 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 20, 000 kez G'de beş dakika süreyle dört derece santigrat olarak aktarın.Büyük omurgalı örnekleri için süspansiyonu tek tek beş mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve santrifüj için dört mililitre MV-3 çözeltisi ekleyin ve dört santigrat derecede 2, 000 kez G'de beş dakika süreyle santrifüj için. Nörovasküler ünitenin içsel bileşenleri mikrodamarlar içinde tespit edilebilir, gösterildiği gibi izole, CD31 için immünetiketleme ile, PDGFR-beta, ve aquaporin dört, kortikal dahil, serebellar, hipofiz, hipotalamik, beyin sapı, ve spinal mikrodamarlar. Aynı şekilde, yapışıklık protein VE-kadherin, sıkı kavşak proteinleri CLDN5 ve Zonula Oklüdens-1, üç hücreli kavşak protein angulin-1 ve bazal markes chemokine ligand CXCL motif 12 ve gama-glutamyltransferaz-1 ifadesi görselleştirilebilir.Ayrıca, mikrodamarların çoğunluğu alfa düz kas aktinin ekspresyonu yoksun, bu izolasyon protokolü seçici küçük kalibreli mikrodamarları hedefleyen gösteren. Kuş, liard, kurbağa ve balık gibi diğer küçük lissensefalik omurgalılardan elde edilen mikrodamarlar bazı morfolojik özellikleri paylaşarak, bu yöntemin türler arasındaki nörovasküler birimlerdeki farklılıkların daha fazla nitelendirilmesinde yararlı olduğunu düşündürmektedir. Protein ekspresyonundaki değişikliklerin nicelleştirilmesi, deneysel otoimmün ensefalomiyelitin doruğunda, omurilik mikrodamarları boyunca vasküler hücre adezyon molekülü bir, ve junctional adezyon molekülü B'de bir artış olduğunu ortaya koymaktadır.Ancak hipofiz mikrodamarlarında vasküler hücre adezyon molekülü de önemli ölçüde artmış, hipotalamus ve beyin sapı mikrodamarlarında azalmıştır. Buna ek olarak, tüm CNS dokularında kronik deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit sırasında vasküler hücre adezyon molekülü bir ekspresyonda, hipotalamus ve hipofiz mikrodamarlarında ise junctional adezyon molekülü B ekspresyonunda değişiklikler gözlenmektedir. Batı blot, PCR ve immünohistokimya gibi kantitatif analizler, kan-beyin bariyeri içinde gen ve protein ekspresyonu desenleri içine anlayışlar ortaya çıkarmak için bu işlemden sonra yapılabilir.Paraformaldehit akut toksik reaktif, ve her zaman uygun PPE giyerken duman kaputu altında ele alınmalıdır.

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, nöronlar ve glial hücrelerle birlikte kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturan bir farenin beyninden sağlam damarların izolasyonunu göstermektedir. İzole edilmiş damarlar, beyin homeostazının korunmasındaki rollerini incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Fare Beyin Damarlarının İzole Edilmesi: Murin Beyin Örneğinden Sağlam Damarları İzole Etmek İçin Bir Protokol

Bu video, ötenazi uygulanmış sıçanlardan beyin mikro damarlarını izole etme sürecini göstermektedir. Beynin diseksiyonunu, dokunun temizlenmesini ve mekanik sindirimi ve ardından mikro damarların saf fraksiyonunu izole etmek için tekrarlanan santrifüjlemeyi içerir.

Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Bu protokol, farelerde geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben enfarktüs hacimlerini ve kan-beyin bariyeri bozulmasını azaltan tekrarlayan hipoksik ön koşullandırmayı veya sistemik hipoksiye kısa süreli maruziyetleri tanımlar. Ayrıca, nörovasküler korumanın etkinliğini değerlendirmek için inme sonrası enfarktüs hacminin ve kan-beyin bariyeri bozulmasının ikili miktar tayinini detaylandırır.

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Fare beyninin damar bölmesinin saflaştırılmasına izin veren bir protokol tarif ediyoruz. İzole beyin damarları, sıkı bağlantılarla bağlanmış ve sürekli bir bazal lamina, perisitler, vasküler düz kas hücreleri ve ayrıca perivasküler astroglial membranlarla çevrili endotel hücrelerini içerir.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

Bu el yazması, basınç miyografisi, immünofloresan, biyokimya ve moleküler çalışmalarda kullanılmak üzere farelerden intraserebral arteriyollerin (parankimal arteriolleri, penetran arteriolleri ve pre-kılcal arteriolleri kapsayan bir grup kan damarı) izolasyonu için basit ve tekrarlanabilir bir protokolü açıklamaktadır.

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.

Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Öğrenin, merkezi sinir sistemi mikrodamarlarını ultrasantrifüj gerektirmeden bir günde izole etme yöntemini. Bu teknik, lissensefalik ve giriseefalik omurgalılar arasında karşılaştırmalı vasküler analiz yapmayı sağlar.

Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

Daha fazla video keşfet