Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

Bu protokol, farklı merkezi sinir sistemi bölgeleri arasında mikrovaskülkülatür karşılaştırmasağlar, çünkü önemli olduğu gibi, farklı bireyler arasında. Bu mikrodamar izolasyon tekniği tek bir gün içinde tamamlanabilir ve ultrasantrifüj ve enzimatik ayrışma ihtiyacını ortadan kaldırır. Menenjler ve koroid pleksus çıkarma zor olabilir.

Her doku tam kaldırılmasını sağlamak için yavaş ve dikkatli bir şekilde çalışmak emin olun. Küçük bir lissencephalic omurgalı örnekten CNS doku diseksiyonu için, buzun üzerinde MV-1 solüsyonu içeren 15 mililitrelik konik tüp içine hasat beyin yerleştirin ve kafatasısella turcica hipofiz almak için forseps kullanın. Hipofiz buz üzerinde MV-1 çözeltisi 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüp yerleştirin ve vertebral sütun ortaya çıkarmak için deri ve kas çıkarın.

Uzuvları çıkardıktan sonra, göğüs kafesi ve iç organlar, bel vertebraforamen boyunca bir kaudal-rostral yönde, taze MV-1 çözeltisi ile vertebral kolon floş için 18 gauge iğne ile donatılmış bir 10 mililitreşşöyşş. Sonra taze MV-1 solüsyonu içeren 5 mililitrelik tüp omurilik yerleştirin. Sonra, diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabına beyin yerleştirin ve çift uçlu dikmek ile menenjler çıkarın.

Menenjit parçaları nın kalmadığından emin olmak için omuriliği kontrol ettiğinizden emin olun. Hipotalamus, beyincik, beyin sapı ve korteks ayırmak için forceps kullanın. Gerektiğinde, koku ampulleri ve talamus çıkarmak için forseps ve iris ve yay makas kullanın ve tüm beyin ventriküllerinden koroid pleksus kaldırmak için çift uçlu dikmek kullanın.

Büyük bir jirensefalik omurgalı örnekten CNS doku diseksiyonu için, bir diseksiyon mikroskop ve çift çatallı dikmek kullanın, forseps, ve iris ve yay makas her CNS dokumeningler kaldırmak için, beyin ventriküllerinden koroid pleksus herhangi bir parça kaldırmak için özen. Hasat edilen CNS dokularının homojenizasyonu için, her CNS bölgesini tek tek Petri tabakları içinde bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın. Küçük omurgalı örneklerden CNS dokuları homojenize etmek için, kıyma doku askıya almak için MV-1 çözeltisi bir mililitre eklemek için bir transfer pipet kullanın.

Sonra korteks dağıtmak için aynı transfer pipet kullanın, beyincik, beyin sapı, optik lob, ve omurilik parçaları bireysel 10 mililitre cam doku öğütücüler içine, ve yaklaşık 10 vuruş için dokuların her bir dizi eziyet için bir PTFE havaneli ve MV-1 çözüm beş mililitre kullanın. Her doku bulamacını buz üzerinde tek tek 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hipotalamus ve hipofiyi 100 mikrolitre MV-1 çözeltisine tek tek 1,7 mililitrelik tüplere yerleştirmek için forseps kullanın. Sonra, dikkatle bir cam micropestle ile her doku homojenize.

Büyük bir omurgalı örneğini homojenize etmek için, kıymalı dokuyu 55 mililitrelik cam doku öğütücüye aktarmak için yontma kesme pipeti kullanın ve öğütücüyü bir baş üstü karıştırıcıya takın. Önerilen MV-1 çözeltisi hacminin yarısını, tabloda belirtildiği gibi homojenize edilen belirli CNS kısmına göre ekleyin ve havai karıştırıcıyı dakikada yaklaşık 150 dönüşe çevirin. Homojen bir bulamaç elde edilene kadar, ek homojenizasyon için daha fazla MV-1 çözeltisi eklemek için tepedeki karıştırıcıyı kapatmadan önce cam tüpü yaklaşık 30 saniye boyunca dikkatlice yukarı ve aşağı hareket ettirin.

Sonra homojenize dokuyu buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mikro damar arınması için, CNS dokusu santrifüj ile homojendir ve süpernatasyonları atın. Küçük bir omurgalı örnek mikrodamar izolasyoniçin, pipet korteks, beyincik, beyin sapı, optik lob ve omurilik pelet, taze beş mililitre, buz gibi MV-2 çözeltisi örnek başına, yaklaşık 10 kez, her tüp için buz gibi MV-2 çözeltisi beş mililitre eklemeden önce.

Tüpleri karıştırmak için dikkatlice çevirin ve bir mililitre MV-2 çözeltisinde hipotalamus ve hipofiz peletlerini yeniden askıya alın. Büyük omurgalı numune mikrodamar izolasyonu için, korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik mikrodamar peletlerine 20 mililitre buz gibi MV-2 çözeltisi ekleyin ve dakikada 40 dönüşte peletleri dakikada yaklaşık 5 dakika süreyle yeniden askıya alın. Yeniden süspansiyon sonunda, cns doku lycates santrifüj ile ayırın ve yavaş yavaş supernatant dikkatle tüp duvarlarından sıvı arayüzü üzerinde kalın ve yoğun miyelin tabakası ayırmak için duvar boyunca geçmesine izin vermek için her tüp döndürün.

Miyelin ve sıvı arayüzleri atın ve her tüpün iç duvarını düşük tiftik lisi ile sarılmış bir spatula ile lekelayın. Daha sonra, aşırı sıvıyı emmek için bükülmüş düşük tiftik lisi kullanın ve her peleti bir mililitre MV-3 çözeltisinde yeniden askıya almak için düşük bağlayıcı ipuçları kullanın. Mikrodamar elution ve filtrasyon için, her CNS doku mikrodamar bulamaç taze MV-3 çözeltisi birkaç mililitre karıştırın ve agregaları önlemek için karıştırırken, ayrı 50 mililitre konik tüpler içine bir Pruitt süzgeç aracılığıyla her süspansiyon zorlanma.

CNS bölgesi ne göre bir modifiye filtre tutucuüzerine 20 mikrometre naylon net filtre yerleştirin. Filtre tutucuyu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve filtreyi beş mililitre buz gibi MV-3 çözeltisi ile ıslayın, tamponun filtre tutucudan konik tüpe dökülmesini önleyin. Eluted mikrodamarları her 20 mikrometrenaylon ağ filtresine aktarın ve mikrodamarları 5 ila 10 mililitre buz gibi MV-3 çözeltisi ile durulayın.

Her filtreyi buz gibi MV-3 çözeltisi içeren tek tek gagalara aktarmak için forseps kullanın ve mikro damarları ayırmak için her filtreyi yaklaşık 30 saniye hafifçe sallayın. 15 mililitrelik konik bir tüpe geçtikten sonra, santrifüj ile mikrodamarları toplayın ve her peleti bir mililitrelik buz gibi MV-3 çözeltisinde yeniden askıya almak için düşük bağlayıcı lı bir pipet kullanın. Daha sonra, küçük omurgalı örneklerden mikrodamar süspansiyonları 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 20, 000 kez G'de beş dakika süreyle dört derece santigrat olarak aktarın.

Büyük omurgalı örnekleri için süspansiyonu tek tek beş mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve santrifüj için dört mililitre MV-3 çözeltisi ekleyin ve dört santigrat derecede 2, 000 kez G'de beş dakika süreyle santrifüj için. Nörovasküler ünitenin içsel bileşenleri mikrodamarlar içinde tespit edilebilir, gösterildiği gibi izole, CD31 için immünetiketleme ile, PDGFR-beta, ve aquaporin dört, kortikal dahil, serebellar, hipofiz, hipotalamik, beyin sapı, ve spinal mikrodamarlar. Aynı şekilde, yapışıklık protein VE-kadherin, sıkı kavşak proteinleri CLDN5 ve Zonula Oklüdens-1, üç hücreli kavşak protein angulin-1 ve bazal markes chemokine ligand CXCL motif 12 ve gama-glutamyltransferaz-1 ifadesi görselleştirilebilir.

Ayrıca, mikrodamarların çoğunluğu alfa düz kas aktinin ekspresyonu yoksun, bu izolasyon protokolü seçici küçük kalibreli mikrodamarları hedefleyen gösteren. Kuş, liard, kurbağa ve balık gibi diğer küçük lissensefalik omurgalılardan elde edilen mikrodamarlar bazı morfolojik özellikleri paylaşarak, bu yöntemin türler arasındaki nörovasküler birimlerdeki farklılıkların daha fazla nitelendirilmesinde yararlı olduğunu düşündürmektedir. Protein ekspresyonundaki değişikliklerin nicelleştirilmesi, deneysel otoimmün ensefalomiyelitin doruğunda, omurilik mikrodamarları boyunca vasküler hücre adezyon molekülü bir, ve junctional adezyon molekülü B'de bir artış olduğunu ortaya koymaktadır.

Ancak hipofiz mikrodamarlarında vasküler hücre adezyon molekülü de önemli ölçüde artmış, hipotalamus ve beyin sapı mikrodamarlarında azalmıştır. Buna ek olarak, tüm CNS dokularında kronik deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit sırasında vasküler hücre adezyon molekülü bir ekspresyonda, hipotalamus ve hipofiz mikrodamarlarında ise junctional adezyon molekülü B ekspresyonunda değişiklikler gözlenmektedir. Batı blot, PCR ve immünohistokimya gibi kantitatif analizler, kan-beyin bariyeri içinde gen ve protein ekspresyonu desenleri içine anlayışlar ortaya çıkarmak için bu işlemden sonra yapılabilir.

Paraformaldehit akut toksik reaktif, ve her zaman uygun PPE giyerken duman kaputu altında ele alınmalıdır.