Name: Bakteriyel Solgunluk Hastalığının Basit Genetik Analizi için Ralstonia Solanacearum ile Aşılama Takip Domates Kökü Dönüşümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Keşfedin domates kök dönüşümü ve Ralstonia solanacearum ile aşılama yöntemini bakteriyel solgunluk hastalığının genetik analizi için. Bu teknik hızlı gen manipülasyonu ve minimal ekipman gereksinimi sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Macho laboratuvarının tüm laboratuvar üyelerine yararlı tartışmalar için, alvaro López-García'ya istatistiksel tavsiyeler için ve Xinyu Jian'a bu çalışma sırasında teknik ve idari yardım için teşekkür ederiz. Biz floresan görüntüleme ile yardım için PSC Hücre Biyolojisi çekirdek tesisi teşekkür Bu çalışma Çin Bilimler Akademisi Stratejik Öncelik Araştırma Programı (hibe XDB27040204), Şangay Merkezi Bitki Stres Biyolojisi (Çince) tarafından desteklendi Bilimler Akademisi) ve Çince 1000 Talents programı.

NOT: Bu yöntemin önemli bölümleri, bitki malzemelerinin vitro olarak işlenmesini içerir ve bu nedenle DsRed floresanlarının görselleştirilmesi de dahil olmak üzere tüm bu işlemler sırasında steril koşulların tutulması önemlidir. Tüm dönüşüm sürecinde domates fideleri 25−28 °C ve 16 saat açık/koyu (130 μmol foton m-2s-1 ışık) olarak büyür. Plakalar gaz değişimi ve transpirasyonu kolaylaştırmak için mikropore bant ile mühürlenir.
1. Domates bitkileri ve Agrobacterium rhizogenes hazırlanması
<ol><li>Sterilize domates tohumları(Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Domates Genetik Kaynak Merkezi, TGRC) ile 5% (v / v) 5 dakika boyunca sodyum hipoklorit. Yıkayın 4-5 kez distile steril su ile ve tohumlar yavaş yavaş steril suda gece boyunca çimlenme kolaylaştırmak için sallayarak tutmak.</li>
	<li>Domates tohumlarını yarım güçlü Murashige ve Skoog (1/2 MS) orta sakarozsuz (2,21 g/L MS, %8 w/v agar) aktarın. Tohumları 25−28 °C'de karanlıkta üç günbekletin (Şekil 1A). NOT: Her yapı için genellikle yaklaşık 40 tohum gereklidir.</li>
	<li>Otoklav 8,5 cm2 kare filtre kağıtları. Kare filtre kağıtlarını 1/2 MS orta içeren 9 cm2 kare petri kapların içine yerleştirin (kağıdı agarın üzerine yerleştirin) ve her tabağa altı tane çimlenmiş domates tohumu yerleştirin(Şekil 1B). Plakayı mikropore bantla kapatın ve çimlenmiş tohumları 25−28 °C'de 3−4 gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bitki dönüşümüne iki gün kala 28 °C'de katı LB orta (uygun antibiyotiklerle) Agrobacterium rhizogenes MSU440 yetiştirin. NOT: A. rhizogenes Dr Juan Antonio López Ráez, EEZ-CSIC, Granada, İspanya tarafından sağlanmaktadır. Bu makalede açıklanan deneyde, pK7GWIWG2_II-RedRoot içeren A. rhizogenes::CESA6 veya boş bir vektör, kontrol olarak kullanılmıştır. pK7GWIWG2_II-RedRoot bir muhabir gen içerir, DsRed, Arabidopsis thaliana ubiquitin organizatörü tarafından tahrik (pAtUBQ10), ve spectinomycin direnç confers (50 g/mL). 5'iönceden bildirildiği gibi gen ekspresyonu için diğer vektörleri kullanmak mümkündür. Bu çalışmada, SlCESA6 susturma için özel parçanın amplifikasyonu ters transkripsiyon (RT) PCR kullanılarak domatesten izole edilmiş RNA(S. lycopersicum cv. Moneymaker) kullanılarak elde edilmiş ve p-ENTR/D-TOPO vektörüne bağlanmış(Tablo 1). Daha sonra, SlCESA6-RNAi parçası pK7GWIWG2_II-RedRoot ikili vektörü içine klonlandı.</li>
</ol>2. Bitki dönüşümü ve seçimi
<ol><li>Steril bir neşter kullanarak, domates fidelerinin hipokotilinin altını ve raküli kesin (Şekil 1C,D).</li>
	<li>Hasat A. plastik ipuçları veya neşter bıçak kullanarak LB orta yüzeyinden rhizogenes biyokütle ve dikkatle bakteriyel biyokütle kesilmiş domates fideleri daldırma(Şekil 1E).</li>
	<li>A. rhizogenesile aşılama dan sonra, yüksek nem tutmak ve hayatta kalma ve yeni kök gelişimini kolaylaştırmak için 2 cm x 4 cm yarım dairesel filtre kağıdı(Şekil 1F)ile domates fidelerini kaplayın.</li>
	<li>Dönüştürülmüş domates fidelerini 6-7 gün saklayın. Daha sonra, yeni ortaya çıkan tüylü kökleri kesmek için steril bir neşter kullanın(Şekil 1G,H; bu adımda, kökleri henüz dönüştürülmüş değildir) ve fideler yeni tüylü kökleri üretmek için izin.</li>
	<li>İkinci nesil yeni tüylü kökler ortaya çıktıktan sonra(Şekil 1I),fidelerin üstündeki filtre kağıdını çıkarın ve plakayı tekrar mikropore bantla kapatın. NOT: Bu noktada, dsRed floresan belirteci dönüşüm vektörü varlığı yeni köklerde dönüşüm verimliliğini görselleştirmek için izin verir.</li>
	<li>DsRed floresansını görselleştirmek için, in vivo görüntüleme tesisi için stereomikroskop veya başka bir ekipman kullanın(Şekil 1J). Pozitif (kırmızı floresan) dönüştürülmüş kökleri işaretleyin ve steril bir neşter kullanarak negatif dönüşümsüz kökleri (kırmızı floresan yok) çıkarın.</li>
	<li>Kırmızı floresan gösteren fideleri, ana kök olarak dönüştürülmüş kökün gelişimini kolaylaştırmak amacıyla 1/2 MS orta içeren yeni bir plakaya aktarın (Şekil 1K). Floresan köklerin(Şekil 1L)ortaya çıkışını daha sonraki zaman noktalarında kontrol etmek için aynı plakada kırmızı floresan göstermeyen fideleri saklayın.</li>
	<li>Antibiyotik seçimine dayalı alternatif yöntem<ol>
<li>Adım 2.5'e alternatif olarak, uygun antibiyotikle 1/2 MS orta içeren yarı dolgulu 9 cm2 kare tabak hazırlayın. Hazırlık işlemi sırasında plakaları yaklaşık 5° eğimli bir şekilde orta olmadan boş bir alan oluşturmak için(Şekil 2A),sürgünlerin antibiyotikle temastan kaçınarak büyümesini sağlar.</li>
		<li>2.6. adıma alternatif olarak, ilk dönüştürülmeyen tüylü kökleri kestikten sonra ortaya çıkan (adım 2.4), kökleri olmayan fideleri uygun büyüklükte filtre kağıtları kullanarak yarı dolgulu plakalara aktarır(Şekil 2B). NOT: Pozitif kontrol olarak, aynı antibiyotik direnci ve muhabir geni içeren bir plazmid ile birkaç fide dönüştürmek için tavsiye edilir (Bu protokolde, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamisin 50 g/mL).</li>
		<li>Adım 2.7 alternatif, fideler yeni kıllı kökleri geliştirmek ve bu kökleri antibiyotik seçimi önlemek olabilir, çünkü filtre sandviç kağıtları yüzeyi ile doğrudan temas olmayan bu kökleri kesti. NOT: Antibiyotik etkisi nedeniyle kök gelişimi antibiyotiksiz plakalara göre daha yavaş olabilir. Yeni dönüştürülmüş kıllı kökler, kökleri olmayan fideleryarı dolmuş tabaklara (adım 2.8.2) aktardıktan sonra 14−18 gün içinde ortaya çıkar (Şekil 2C-E).</li>
	</ol></li>
	<li>Fidelerin üzerini 2 cm x 4 cm yarım daire filtre kağıdı ile kapatın, tabağı kapatın ve yeni tüylü kökler geliştirmeleri için fideleri kuluçkaya yatırın. NOT: Antibiyotik kullanarak A. rizogenlerin ortadan kaldırılmasına gerek yoktur. MS ortamının üstündeki filtre kağıdı ve sakaroz eksikliği5plakaüzerindeki A. rhizogenes'in yayılmasını engeller.</li>
	<li>İlk kök seçiminden beş ila yedi gün sonra, yeni dönüştürülmüş kökleri seçmek ve dönüştürülmeyen kökleri kaldırmak için seçim işlemini yineleyin. Dönüştürülmüş kökler içeren fideleri 1/2 MS orta içeren yeni bir plakaya aktarın.</li>
</ol>3. Aşılama kaplarına transfer
<ol><li>Köklerin yüzeyinin bakteriyel inoküle maruz kalacakları aşı kapları hazırlayın: aşı kaplarını suyla ıslatın, fazla suyu dökün ve plastik bir ekim tepsisine koyun. Dönüştürülmüş kökleri olan seçili fideleri cımbız kullanarak aşılama kaplarına aktarın(Şekil 3A).</li>
	<li>Tepsiyi plastik ambalaj veya şeffaf bir kapakla kaplayın ve 25−28 °C ve %65 nemde (16 saat/8 h ışık/koyu; 130 μmol foton m-2s-1 ışık) yüksek nem seviyesini korumak için saklayın Şekil 3B). Beş ya da altı gün sonra kapağı çıkarın. NOT: Dönüştürülmüş domates bitkileri toprağa aktardıktan iki-üç hafta sonra aşılamaya hazırdır (Şekil 3C). Topraktaki büyüme sırasında, domates bitkileri dönüştürülmeyen yeni kökler üretebilir. Bu fenomenin kapsamını belirlemek için kırmızı floresan 3 haftalık dönüştürülmüş domates bitkilerinin köklerinde görselleştirildi. Çoğu kök (%80-%100) kırmızı floresan gösterdi, onlar gerçekten dönüştürülür gösteren(Şekil 3D,E).</li>
</ol>4. Toprak-sırılsıklam aşılama
<ol><li>R. solancearum (bu protokolde GMI1000 süzme) phi sıvı ortamda(Tablo 211) bir orbital shaker (200 rpm) 28 °C sabit faza kadar büyümek.</li>
	<li>Bakteri kültürünün optik yoğunluğunu 600 nm (OD600)olarak ölçerek bakteri sayılarını belirleyin. Bakteri kültürünü su ile seyrelterek 0.1'in OD600'ü (burada kullanılan koşullarda yaklaşık 108 koloni oluşturan üniteye [CFU]/mL) karşılık gelir.</li>
	<li>Dönüştürülmüş domates bitkilerini içeren 16−20 aşılama kabını bir aşılama tepsisine (29 cm x 20 cm; Şekil 4A).</li>
	<li>Aşı kaplarını içeren tepsiye 300 mL (bitki başına~15 mL) bakteriyel inokül (OD600 0,1) dökün. Onları 20 dakika boyunca inoculum ıslatın (Şekil 4B).</li>
	<li>Çömlekçilik toprak tabakası ile yeni bir tepsi hazırlayın. Aşılanmış kapları yeni tepsiye taşıyın(Şekil 4C)ve tepsileri %75 nem, 26−28 °C ve 12 saat ışık ve 12 saat karanlık (130 μmol foton m-2s-1 ışık) ile bir büyüme odasına yerleştirin.</li>
</ol>5. Enfeksiyon parametrelerinin belirlenmesi ve istatistiksel analiz
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi skor hastalığı belirtileri12,13, arasında değişen bir ölçek kullanarak 0 (hiçbir belirti) 4 (tam solma)(Şekil 4D-H), Iki hafta boyunca Ralstonia aşılama sonra her gün. NOT: Hastalık indeksi verileri zaman içinde aynı deneysel birimden (her bitki) toplanır.</li>
</ol>6. Gen ekspresyonu analizi
NOT: Transgenin ekspresyonu veya hedef genin susturulması RT-PCR veya kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) ile belirlenebilir.
<ol><li>Örnekler toplayın ve dönüştürülmüş kök sisteminin temsili bir bölümünden RNA ayıklayın (hedef gen üzerindeki etkisini değerlendirmek için) ve yaprakları (iç kontrol olarak).</li>
	<li>Toplam DNase ile tedavi edilen RNA'nın 1 μg'si kullanılarak cDNA sentezleyin.</li>
	<li>QRT-PCR ile hedef genlerin gen ekspresyonunu analiz edin. 2-ΔΔCT yöntemi14kullanarak göreli transkripsiyon düzeylerini hesaplayın , temizlik geni15olarak SlEFα-1 kullanarak . NOT: Astar dizileri Tablo 1'delistelenmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Elphinstone, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElphinstone%2C+JG+%22The+current+bacterial+wilt+situation%3A+a+global+overview.+In%3A+Bacterial+Wilt+Disease+and+the+Ralstonia+solanacearum+Species+Complex%22">The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex</a>. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).</li>
<li>Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+JB+%22Compendium+of+Tomato+1094+Diseases%22">Compendium of Tomato 1094 Diseases</a>. , APS Press. St Paul, MN. (1991).</li>
<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+of+homogalacturonan%2C+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
<li>Hernández-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li>
<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ralstonia solanacearum tarım için önemli bir tehdit oluşturmaktadır; ancak, tarımsal önemi doğal konakları ile etkileşimi hala diğer bakteriyel patojenler ile karşılaştırıldığında, özellikle bitki türlerinde kötü anlaşılmaktadır. Çoğu durumda, genetik analiz zaman ve giderleri genetik konak bitkiler değiştirmek için gerekli tarafından engellenir. Bu sorunu çözmek ve domateste R. solanacearum enfeksiyonunun genetik analizini kolaylaştırmak için, domates köklerinin Agrobacterium rhizogenes-aracıl...

Ralstonia solanacearum, bakteriyel solgunluk hastalığının nedensel ajan, diğerleri arasında patates, domates, tütün, muz, biber ve patlıcan da dahil olmak üzere bitki türlerinin geniş bir yelpazede enfekte olabilir dünya çapında bir dağıtım ile yıkıcı bir toprak kaynaklı vasküler patojen, diğerleri arasında1,2. Ralstonia'nın neden olduğu verim kayıpları, çeşitlerin, iklimin, toprağın ve diğer faktörlere bağlı olarak domates, patates veya muz üretiminin %80-90'ına ulaşabilir3. Ancak, Ralstonia modeli, Pseudomonas syringae veya Xanthomonas sppgibi bakteriyel bitki patojenlerini içeren diğer modellere kıyasla oldukça az keşfedilmemiştir. Ayrıca, bitki-mikrop etkileşimleri en çalışmalar model bitki Arabidopsis thalianaodaklanmıştır. Bu modelleri kullanarak araştırma büyük ölçüde bitki-bakteri etkileşimleri anlayışımıza katkıda bulunmuş olsa da, onlar ekin bitkilerde bu etkileşimleri anlamak için mevcut gerekliliği ele almamıştır. Araştırma Ralstonia ve bitki bitkileri arasındaki etkileşimi anlamak için bakteriyel solgunluk hastalığı ile mücadele için sürdürülebilir çözümler geliştirmek için gerekli olan ancak şu anda etkileşimin farklı bileşenleri karakterize etmek için basit deneysel tahliller eksikliği engellenir. Özellikle, domates, Ralstoniaiçin doğal bir ev sahibi , dünya çapında ikinci en önemli bitkisel ürün ve hastalıkların bir bolluk etkilenir4, bakteriyel solgunluk hastalığı da dahil olmak üzere. Bu çalışmada, domatesralstonia enfeksiyonu genetik analizi gerçekleştirmek için kolay bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem agrobacterium rhizogenesdayanmaktadır -domates köklerinin aracılı dönüşümü, seçim marker olarak DsRed floresan kullanarak5, Ralstonia toprak sırılsıklam aşılama takip ortaya çıkan bitkilerin, dönüştürülmüş kökleri içeren ilgi inşa ifade içeren. Kök dönüşüm testinin çok yönlülüğü, rnai aracılığında gen aşırı ekspresyonu veya gen susturma gerçekleştirmeyi sağlar.
Bu yöntemin potansiyel bir sınırlama dönüştürülmeyen köklerin artık büyüme oluşur. Bu plazmid kullanılan durumlarda özellikle dönüştürülmüş köklerin seçimi sağlayan bir muhabir gen yoksun olduğu durumlarda önemlidir. Bu sorunu çözmek için, antibiyotik seçimine dayalı alternatif bir yöntem geliştirdik, bu da dönüşümsüz köklerin büyümesini engellerken, aynı yandan da antibiyotiğe dirençli dönüştürülmüş köklerin büyümesini sağladı. A. rhizogenes sürgünlerin dönüşümüne neden olmadığından, antibiyotiğe karşı duyarlıdırlar ve bu nedenle antibiyotik içeren ortamdan ayrı tutulmalıdırlar.
Ralstonia karşı bitki direnci iyi anlaşılamamasına rağmen, çeşitli raporlar bakteriyel solgunluk 6 gelişmiş direnç için hücre duvarı değişiklikleri ilişkili var66 ,7,8,9. Bu hücre duvarı değişiklikleri vasküler gelişimi etkilediği ileri sürülmüştür, bitki içinde Ralstonia yaşam tarzı için önemli bir yönü10. Arabidopsis thaliana selüloz sintazları CESA4, CESA7 ve CESA8 kodlama genlerde mutasyonlar ikincil hücre duvar bütünlüğünü bozan gösterilmiştir, Ralstoniagelişmiş direnç neden , Hangi ABA sinyalizasyon bağlı gibi görünüyor8. Bu nedenle, bizim yöntem için kavram kanıtı olarak, biz SlCESA6 RNAi aracılı gen susturma yapıldı(Solyc02g072240),ikincil bir hücre duvarı selüloz synthase, ve AtCESA8 ortolog (At4g18780). Ralstonia ile sonraki toprak sırılsıklam aşılama slCESA6 bakteriyel solgunluk belirtilerine karşı direnci ni artırdı gösterdi, Ralstonia hücre duvar aracılı direnç büyük olasılıkla domates korunmuş olduğunu düşündüren, ve domates kökleribakteriyel solgunluk direnci genetik analizi yürütmek için yöntemimizi doğrulayan. Burada, genetik yaklaşımların bakteriyel solgunluk hastalığını nispeten kısa sürede ve küçük ekipman ve bitki büyüme alanı gereksinimleriyle anlamasını sağlayan bu yöntemi ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.

<table><tbody><tr><td>90 mm kare Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD (Becton ve Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaamino asitler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre kağıdı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Bitki Görüntüleme Sistemi NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiffy tencere</td><td>Jiffy Ürünleri Uluslararası A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro gözenekli bant</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog ortamı (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pindstrup substrat</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neşter ve bıçak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hipoklorit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril temiz tezgah</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahtman kağıdı</td><td>Wahtman International Ltd. Maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bakteriyel solgunluk hastalığının basit genetik analizi için ralstonia solanacearum ile aşılama takip domates kökü dönüşümü

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum, tarım için önemli bir tehdit neden, bitki türlerinin geniş bir yelpazede enfekte olabilir yıkıcı bir toprak kaynaklı vasküler patojendir. Ancak, Ralstonia modeli önemli ölçüde bakteriyel bitki patojenleri içeren diğer modellere göre underexploreed, Arabidopsis Pseudomonas syringae gibi . Ralstonia ve bitki bitkileri arasındaki etkileşimi anlamayı hedefleyen araştırmalar, bakteriyel solgunluk hastalığına karşı mücadele etmek için sürdürülebilir çözümler geliştirmek için gereklidir, ancak şu anda yerli konak bitkilerdeki etkileşimin farklı bileşenlerini karakterize etmek için basit deneysel tahlillerin olmaması engellenmiştir. Bu senaryoda, biz domates Ralstonia enfeksiyonu genetik analizi gerçekleştirmek için bir yöntem geliştirdik, Ralstoniadoğal bir ev sahibi . Bu yöntem, domates köklerinin Agrobacterium rhizogenes-aracılıdönüşümüne dayanır ve bunu ralstonia toprak-ıslatma aşılaması ile ortaya çıkan bitkilerin, ilgi yapısını ifade eden dönüştürülmüş kökleri içeren aşılamaya dayanmaktadır. Kök dönüşüm testinin çok yönlülüğü, rnai aracılığında gen aşırı ekspresyonu veya gen susturma gerçekleştirmeyi sağlar. Kavramın bir kanıtı olarak, domates kökleri Nde SlCESA6 RNAi aracılı susturma Ralstoniadirenç verilen göstermek için bu yöntemi kullandı. Burada, genetik yaklaşımların bakteriyel solgunluk hastalığını nispeten kısa sürede ve küçük ekipman ve bitki büyüme alanı gereksinimleriyle anlamasını sağlayan bu yöntemi ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.

Şekil 5 boş bir vektör (EV) ile dönüştürülmüş kökleri ile domates bitkileri hastalık belirtileri gelişimini gösterir ve kökleri bir RNAi ile dönüştürülmüş bitkiler SlCESA6 hedefleme(Solyc02g072240). Hastalık indeksi verileri(Şekil 5A)zaman içinde aynı deneysel birimden (her bitki) 0'dan 4'e rasgele bir ölçeğe göre toplanır ve parametrik veriler için standart testlerin kullanımını ekarte eden Bir...

Burada, bakteriyel solgunluk hastalığı nın incelenmesi için basit genetik analiz yapmak için Ralstonia solanacearum ile aşılama takip domates kökü dönüşümü için çok yönlü bir yöntem satMaktadır.

Bakteriyel Solgunluk Hastalığının Basit Genetik Analizi için Ralstonia Solanacearum ile Aşılama Takip Domates Kökü Dönüşümü

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Bilim adamları domates bakteriyel solgunluk hastalığının basit genetik analizi ni yapmak için izin verir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, gen ekspresyonu ve sonraki tahlillerin manipülasyonunun kısa sürede ve ekipman ve bitki büyüme alanının küçük gereksinimleriyle yapAbildiğidir. Bu yöntem çok yönlüdür ve hem patojen aşılama ve diğer fizyolojik tahlilleri gerçekleştirmek için diğer bitki bitkilere uygulanabilir.Fidelerin in vitro manipülasyonu sırasında kısırlığı korumak için, akış kaputunun dışında yken plakaları kapalı tutmak önemlidir. Bu kolay bir tekniktir, ancak manipülasyon için birden çok adım gerektirir. Bu yöntemin görselleştirilmesi, el yazmasında açıklanması zor olan küçük hilelerin görülmesine yardımcı olacak ve diğer araştırmacıların bu yöntemi laboratuvarlarında uygulamalarına yardımcı olacaktır.Bu prosedürü göstermek için yardımcı Achen Zhao, bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Domates tohumlarını sterilize edip yıkadıktan sonra, onları sakarozsuz yarım güçlü Murashige ve Skoog ortamına aktarın. Tohumları 25 ile 28 derece arasında bir sıcaklıkta karanlıkta üç gün bekletin.Yarım mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı içeren dokuz santimetre karelik Petri yemeklerinin içine otoklavlı 8,5 santimetre karelik filtreler yerleştirin ve her tabağa altı tane çimlenmiş domates tohumu yerleştirin. Mikropore bant ile plaka mühür ve 3-4 gün boyunca 25-28 santigrat derece çimlenmiş tohumları kuluçka. Bitki dönüşümünden önce 28 santigrat derecede iki gün boyunca uygun antibiyotikler ile katı LB orta Agrobacterium rhizogenes MSU440 büyümek.Steril bir neşter kullanarak, radicle ve domates fidelerinin hipokotil alt kesti. LB ortamının yüzeyinden A.rhizogenes biyokütlesi hasat etmek için plastik uçlar veya neşter bıçak kullanın ve dikkatlice bakteriyel biyokütle kesilmiş domates fideleri daldırma. Bundan sonra, yüksek nem tutmak ve hayatta kalma ve yeni kök gelişimini kolaylaştırmak için iki santimetre-dört santimetre yarım daire filtre kağıdı ile domates fideleri kapağı.Fidelerin transpirasyona izin veren bir ortamda yüksek nemde tutulması önemlidir. Bunu yapmak için, filtre kağıdı ile fideler kapağı ve Micropore bant ile plaka kapatın. Dönüştürülmüş domates fidelerini 25 ila 28 santigrat derece arasında bir büyüme odasında altı ila yedi gün saklayın.Sonra yeni ortaya çıkan tüylü kökleri kesmek için steril bir neşter kullanın, ve fideler yeni tüylü kökleri üretmek için izin. İkinci nesil yeni tüylü kökler göründükten sonra, fidelerin üstündeki filtre kağıdını çıkarın ve plakayı tekrar Mikropore bandıyla kapatın. DsRed floresansını veya in vivo görüntüleme tesisi için başka herhangi bir ekipmanı görselleştirmek için, kırmızı floresan tarafından tanımlanabilen pozitif dönüştürülmüş kökleri işaretleyin.Kırmızı floresan eksikliği ile tespit edilebilir negatif olmayan dönüşümolmayan kökleri kaldırmak için bir neşter kullanın. Ana kök olarak dönüştürülmüş kökün gelişimini kolaylaştırmak için kırmızı floresan gösteren fideleri yarı mukavemetli Murashige ve Skoog ortamı içeren yeni bir tabağa aktarın. Daha sonraki zaman noktalarında floresan köklerin ortaya çıkışını kontrol etmek için aynı plaka içinde kırmızı floresan göstermeyen fideler tutun.Fidelerin üzerini iki santimetreye dört santimetrelik yarım daireşeklinde bir filtre kağıdıyla kapatın, tabağı kapatın ve yeni kıllı kökler geliştirmeleri için fideleri kuluçkaya yatırın. Köklerin yüzeyinin ilk olarak aşı kaplarını suyla ıslatarak, fazla su dökerek ve plastik bir ekim tepsisine koyarak bakteriin yüzeyine maruz kalacakları aşı kaplarını hazırlayın. Cımbız kullanarak, dönüştürülmüş kökleri ile seçilen fideler aşılama kapları aktarın.Tepsiyi plastik bir sargı veya şeffaf bir kapakla kaplayın ve %65 nem oranıyla 25 ila 28 santigrat derecede tutun. Beş ya da altı gün sonra kapağı çıkarın. 28 santigrat derece bir orbital shaker beş LB sıvı ortamda Ralstonia büyümek, 200 rpm sallayarak, sabit faza kadar.Bakteri sayılarını belirlemek için optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün. 1 OD600 su ile bakteri kültürünü seyreltin. Dönüştürülmüş domates bitkilerini içeren 16 ila 20 aşı kabını aşı tepsisine yerleştirin.Sonra tepsiye seyreltilmiş bakteriyel inoculum 300 mililitre dökün ve bitkilerin 20 dakika boyunca inoculum emmek için izin verin. Bundan sonra, çömlekçilik toprak tabakası ile yeni bir tepsi hazırlayın. Aşılanmış kapları yeni tepsiye taşıyın ve tepsileri %75 nem, 26 ila 28 derece arasında bir sıcaklık ve 12 saatlik ışık ve 12 saatlik karanlık bir fotoperiile bir büyüme odasına yerleştirin.Burada, domates kökleri dönüştürülür ve bakteriyel solgunluk hastalığı nın çalışması için basit genetik analiz yapmak için Ralstonia ile aşılanır. Hastalık belirtilerinin gelişimi boş bir vektör ile dönüştürülmüş kökleri ile domates bitkileri ve domates CESA6 hedefleyen bir RAI yapı ile dönüştürülmüş olanlar izlenir. Hastalık indeksi verileri, zaman içinde aynı deneysel birimden sıfırdan dörde kadar rasgele bir ölçeğe göre toplanır ve parametrik veriler için standart testlerin kullanımını göz ardı eden Gaussian dağılımını takip etmez.Standart bir yaklaşım olarak, bir U Mann-Whitney, iki kuyruklu, parametrik olmayan test hem kontrol ve enfeksiyon eğrileri karşılaştırmak için kullanılır. Bu analize göre, her iki eğrinin ortancaları arasındaki fark önemsiz gibi görüner. Ayrıca hastalık ilerleme eğrisi altında alan ölçmek mümkündür, hangi tek bir değer de hastalık ilerleme birden fazla gözlem birleştirerek sağlar.Hastalık ilerleme eğrisi altında alan, enfeksiyon sürecinin sonunda domates CESA6 RNAi bitkilere göre kontrol tesisleri için daha yüksek bir değer gösterir, domates CESA6 susturulan bitkiler kontrol tesisleri daha Ralstonia enfeksiyonuna karşı daha dayanıklı olduğunu gösteren. Güven aralıkları, yüksek olasılıkla, belirli bir değişkenin popülasyon değerinin bulunduğu bir değer aralığını tahmin etmenin bir yolunu sunar. Burada görüldüğü gibi, kontrol ve enfeksiyon eğrileri için%95 güven aralığının alanı, CESA6 susturulduğunda daha yüksek bir direnç şansı tahmin eder.Hastalık indeksi değerleri, sıfıra karşılık gelen ikiden daha düşük bir hastalık indeksi ve bire karşılık gelen ikiden daha yüksek bir hastalık indeksi göz önüne alındığında ikili veriye dönüştürülebilir. Bu Ralstonia aşısı sonrası bir sağkalım eğrisi temsilsağlar. Gehan-Breslow-Wilcoxon istatistiksel testine göre kontrol ve enfekte bitkiler arasındaki sağkalım oranı arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildir.CESA6'nın ekspresyonu, aşılama adımından önce rastgele seçilmiş iki kökte analiz edilir ve Ralstonia'ya karşı gelişmiş direncin CESA6'nın azaltılmış ifadesi ile ilişkili olduğunu gösterir. İki seçim turundan sonra ,%35-40 arasında bir dönüşüm oranı elde edilebilir ve bu değer ek seçim turları gerçekleştirilerek artırılabilir. Bu işlemi gerçekleştirirken, fidelerin yüksek nemi korumak için bir filtre kağıdı parçasıyla kaplı tutulması ve gaz değişimini sağlamak için plakaların Mikropore ile mühürlemesi önemlidir.Kök dönüşümünden sonra, tedavilerin çoğu kök fizyolojisi gözlem veya moleküler biyoloji, hücre biyolojisi veya biyokimya kullanarak bitki yanıtı çalışma için uygulanabilir. Esas olarak, bu teknik sınırlı kaynaklara sahip araştırmacılar domates kökleri bakteriyel enfeksiyon genetik analizi gerçekleştirmek için izin verecektir.

tomato-root-transformation-followed-inoculation-with-ralstonia

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kaynak: Hassan, J. A. ve diğerleri. Pseudomonas syringae pv'ye Direncin Yüksek Verimli Tanımlanması.  Fide Taşkın Tahlili kullanılarak Domateste Domates. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, bakteri süspansiyonu ile aşılanmış on günlük fideler kullanılarak farklı domates türlerinde bakteri direncini taramak için bir yöntem göstermektedir. Bakterilerin stomaları nasıl istila ettiğini, bitki bağışıklığını baskılamak için efektör proteinleri nasıl ilettiğini ve bitki tepkilerinin duyarlı ve dirençli...

Domateslerde Bakteriyel Direncin Taranması için Fide Taşkın Testi

Kaynak: Matthysse, A. G. Laboratuvarda Ölçülen Bitki Yüzeylerine Bakterilerin Yapışması. J. Vis. Exp., (2018)Bu video, vahşi tip ve selüloz eksikliği olan patojenik bakteriler tarafından domates fidelerinin kök kolonileşmesini ölçmek için bir protokol gösterilmektedir. Sıkı yapışan bakteri sayımları, vahşi tip suşun daha fazla yapışma ve mikrokoloni oluşumu göstererek, selülozun stabil kök kolonizasyonundaki rolünü vurgular.

Patojenik bir bakteri tarafından domates fidanlarının kök kolonizasyonunun canlı hücre sayıları kullanılarak değerlendirilmesi

DNA, düzeneğini kullanarak çok CRISPR vektörleri CRISPR çok sayıda yapı yapım tek klonlama reaksiyonda paralel yapılabilir basit bir işlem vektörleri. Domates kıllı kökleri CRISPR vektörleri doğrulamak ve mutant malzemeleri üretmek için mükemmel bir model sistem.

Domates Tüylü Roots Üretimi ile yüksek verim CRISPR Vektör İnşaat ve DNA Değişiklikler Karakterizasyonu

Burada sunulan Protokolü amacı endosphere izole Bacillus mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Bu yöntem önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tanımlamasını kolaylaştırır ve prensip olarak diğer endophytes ve bitkilerle küçük ayarlamalar için geçerli olduğunu.

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için

Burada, iki protokol dönüştürmek patates bitkiler için mevcut. Süre kendi kendine yayılan olabilir bir vahşi türü çekimi transgenik kıllı kökleri Agrobacterium rhizogenes üretmek Agrobacterium tumefaciens dönüşümün tam transjenik bitki için yol açar. Biz o zaman organizatörü etkinlik dönüştürülmüş kökleri boyama GUS tarafından tespit.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Fide sel testi Pseudomonas syringae bakteridirenç için yabani domates katılımları hızlı tarama kolaylaştırır. Bu tetki, fide bakteri büyüme testi ile birlikte kullanılan, daha fazla bakteriye altta yatan direnç karakterize yardımcı olabilir, ve direnç genetik temelini belirlemek için popülasyonları tarama için kullanılabilir.

Pseudomonas syringae pv Direnci yüksek-Throughput Tanımlama. Fide Sel Asası Kullanarak Domates

Bu protokol, bitki köklerini toprak kaynaklı mikroplarla aşılamak için stratejilerin ayrıntılı bir özetini sunar. Verticillium longisporum ve Verticillium dahliae mantarları için örneklendirilen üç farklı kök enfeksiyon sistemi tanımlanmıştır. Potansiyel uygulamalar ve olası aşağı akış analizleri vurgulanır ve her sistem için avantajlar veya dezavantajlar tartışılır.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

Burada, transgenik soya fasulyesi tüylü köklerinin yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz.

Gen fonksiyonunun analizi için soya fasulyesi tüylü kök transformasyonu

Protokol, Solanum tuberosum köklerinin in vivo sera koşullarında bitki parazitik nematodları ve optik mikroskopi ile kök yapısının histokimyasal analizi için patates in vitro transgenik kökleri ile enfeksiyonunu açıklar.

İndüklenen Yapısal Değişikliklerin Değerlendirilmesi için Patates Köklerinin Bitki Paraziti Nematodlarla İn vivo ve İn vitro Enfeksiyonu

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Keşfedin domates kök dönüşümü ve Ralstonia solanacearum ile aşılama yöntemini bakteriyel solgunluk hastalığının genetik analizi için. Bu teknik hızlı gen manipülasyonu ve minimal ekipman gereksinimi sunar.

Bakteriyel Solgunluk Hastalığının Basit Genetik Analizi için Ralstonia Solanacearum ile Aşılama Takip Domates Kökü Dönüşümü

Daha fazla video keşfet