Name: Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster pupalarından GFP işaretli dolaylı uçuş kası diseksiyonu yapmayı. Bu yöntem proteomik ve derin dizileme için yüksek kaliteli örnekler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Andreas Ladurner ve Frank Schnorrer'a cömert destekleri için minnettarız. Sandra Esser'e mükemmel teknik yardım için ve Akanksha Roy'a kütle spektrometresi verilerini ürettiği için teşekkür ederiz. Biz sinek sağlamak için Bloomington ve Viyana stok merkezleri kabul ediyoruz. Her ikisi de LMU Biyomedikal Merkezi'nde (Martinsried, DE) kütle spektrometresi örneklerinin analizi için konfokal görüntüleme ve Zentrallabor für Proteinanalytik ile ilgili yardımları için Core Facility Bioimaging'e teşekkür ederiz. Çalışmalarımız Deutsche Forschungs Gemeinschaft (MLS, SP 1662/3-1), Ludwig-Maximilians-University München (MLS), Frederich-Bauer Stiftung (MLS) ve International Max entegre protein bilimi merkezi (CIPSM) tarafından desteklendi. Planck Araştırma Okulu (EN).

1. Pupa evreleme
<ol><li>Şişelerde istenilen genotipin uçlarını yükseltmek(Şekil 1E). Ya diseksiyon stok taze bir flip yapmak ya da en az 20 kadın bakire sinekler ile bir haç ayarlayın. Sinekler pupate başlayana kadar şişe leri koruyun.</li>
	<li>Isledilmiş bir fırça ile pre-pupa toplayın ve 60 mm Petri kabında ıslak filtre kağıdına aktarın(Şekil 1F).</li>
	<li>Seks pupa, deney için uygun cinsiyet toplama (Şekil 1G). Erkekler, aksi takdirde opak pupa yarı saydam topları olarak görünür testisler, varlığı ile tanımlanır.</li>
	<li>Petri kabını saat, tarih ve genotip ile etiketleyin, ardından pupayı istenilen aşamaya kadar yaşlayın(Şekil 1H). NOT: Daha yüksek sıcaklıklarda artan Gal4 aktivitesi devir verimi40artırdığı için, haçları/stokları ve yaş pupalarını sıcaklık kontrollü bir kuluçka makinesinde muhafaza edin (örneğin, RNAi haçlar için 25 °C veya 27 °C). Birkaç gün yaşlanırken pupaların kurumaması için nem oranının yeterince yüksek olduğundan emin olun.</li>
</ol>2. IFM Diseksiyon Önce 48 h APF
<ol><li>İki #5 biyoloji sınıf forsepsi, pipet, pipet uçları, kuru buz ve (RNA örnekleri için) izolasyon reaktifi dahil olmak üzere gerekli ekipmanı bir araya getirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Buna ek olarak, soğuk siyah diseksiyon yemekleri (Malzeme Tablosubakınız), 1x fosfat-tamponlu salin (PBS) tampon, ve buz üzerinde 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri.</li>
	<li>Islak bir fırça kullanarak, sahnelenmiş pupayı soğuk 1x PBS ile yaklaşık üçte ikisi dolu siyah bir kesişen tabağa aktarın(Şekil 2A,B). Floresan diseksiyon mikroskobuna geçin. NOT: 30 dk'lık bir zaman dilimi içinde kesilebildiği kadar pupa kullanın. Deneyime bağlı olarak, bu 3-15 pupa arasında değişmektedir. Siyah diseksiyon yemekleri alternatifleri tartışmak için Ek Yöntemler bakın.</li>
	<li>#5 forceps kullanarak, siyah bir diseksiyon çanak altına pupa birini itin ve açıkça pupa görmek için mikroskop zoom ve odak ayarlayın(Şekil 2C).</li>
	<li>Bir forceps ile pupa ön kavramak(Şekil 2D),sonra diğer forceps tek bir ucu ile pupa dürtmek biraz karın içinde merkezi kapalı, toraks hemen arkasında. Bu, pupayı yerinde tutar ve IFM'lerin karın içine girmesini önler(Şekil 2E). NOT: Pupal bütünlüğü bozulur bozulmaz, bu noktadan itibaren diseksiyon uzunluğunu zamanlamaya başlayın. Kas ölümünü ve buna bağlı transkripsiyon ve proteomik değişiklikleri en aza indirmek için tanımlanmış bir diseksiyon uzunluğu (örneğin 20-30 dakika) kullanın. Bu süre içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinek inceleyin.</li>
	<li>İlk çömleçleri kullanarak, pupal kılıfın ön yarısını çıkarın (Şekil 2F).</li>
	<li>Thorax'ın hemen arkasında maruz kalan pupayı çimdiklemek ve karnı torakstan ayırmak için aynı çömetüleri kullanın (Şekil 2G).</li>
	<li>Forsepsleri kullanarak, toraksın ön kısmını hafifçe sıkın (<35 h APF için) veya floresan olarak etiketlenmiş IFM'leri ortaya çıkarmak için toraksı açın (Şekil 2H). IFM'ler epidermisten kolayca uzaklaşacaktır, çünkü erken zaman noktalarındaki tendon ekleri kırılgandır. Kalan karkas çanak karşı tarafına itmek için forceps kullanarak atın.</li>
	<li>Yinelenen adımları 2.3-2.7, ek pupa incelemek.</li>
	<li>IFM liflerini forceps ile toplayın ve siyah kesme kabının altındaki bir yığın halinde düzenleyin(Şekil 2I,J). Forceps kullanarak görüş alanı dışına iterek herhangi bir enkaz kaldırın. NOT: Uygulama ile, forceps ipuçları birbirine dokunmadan yakın bir yakına getirilebilir. Bu teknik gevşek onları yok etmeden IFMs kapmak için kullanılabilir. Alternatif yöntemler, IFM'leri tek bir ucu veya tamamen kapalı forsepsle hafifçe itme veya kaldırmayı veya IFM ile yağ veya başka bir doku almayı ve 2.10 adımda açıklandığı gibi yağın çıkarılmasını içerir.</li>
	<li>IFM olmayan kasları, yağ, miğfiz, vb. çıkarmak için çerkesleri kullanarak IFM kas örneğini kalite kontrolü(Şekil 2K,L). NOT: Mef2-Gal4 ile IFM, floresan yoğunluğu na ve kas şekline göre atlama kası ve larva kaslarının çıkarılmasına olanak sağlayan erken zaman noktalarındaki diğer kas tiplerine göre daha güçlü bir şekilde etiketlenir (Şekil 2K,K' Yağ ve miğfer dokusu farklı görünür ve kasa özgü floresan etiketi ile etiketlenmez (Şekil 2K,K'). IFM etiketini alan diğer Gal4 satırlarının tartışma bölümüne bakın.</li>
	<li>Kırpılmış pipet ucu kullanarak IFM yığınını 250 μL soğutulmuş 1x PBS(Şekil 2M-O)ile dolu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Hemen bölüm 4'e gidin. NOT: IFM örnekleri sadece pipet ucunun yan tarafına yapışarak kaybedilebilir. IFM'leri toplamadan önce tamponu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme standart ipuçlarını daha az yapışkan hale getirebilir ve silikonlu veya perfluoroalkoxy (PFA) uçları (Bkz. Malzeme Tablosu)ile daha düşük yüzey gerilimleri numune kaybını önlemeye yardımcı olabilir.</li>
</ol>3. IFM Diseksiyon 48 h APF sonra
<ol><li>İki #5 biyoloji sınıf forseps, ince makas, standart cam mikroskop slaytlar, çift sopa bant, pipet, pipet uçları, kuru buz ve (RNA uygulamaları için) izolasyon reaktifi dahil olmak üzere gerekli ekipmanları bir araya getirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Buz üzerinde 1x PBS ve mikrosantrifüj tüpler chill.</li>
	<li>Hafifçe ıslak bir fırça kullanarak, sahnelenen pupayı mikroskop kaydıranınüzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bantşeridine aktarın(Şekil 3A). Pupayı aynı yönde (ventral aşağı ve ön salığın altına doğru) yönlendirilmiş bir çizgiye yerleştirin. NOT: Boya fırçası veya filtre üzerinde çok fazla su kullanmamaya dikkat edin, yoksa pupa iyi yapışmaz. Pupa yapışmaz, ilk kuru filtre veya doku kağıt aktararak kuru. 30 dk'lık bir zaman dilimi içinde, ideal olarak ~10 pupa olarak birçok pupa monte edilebildiği gibi.</li>
	<li>Pupal kılıfından pupa çıkarın. Ayrı kızdırmak ve ön spiracles üzerinde pupal durumda açmak için forceps kullanın(Şekil 3B).</li>
	<li>Bir çift forceps'ü arka ya doğru yavaşça kaydırArak, püreler hareket ettikçe pupal kılıfı keserek(Şekil 3B'). Altta yatan pupa yırtılmamaya dikkat edin. Pupayı açılan kasadan kurtarın ve hemen ikinci bir mikroskop slaytında 1x PBS'ye aktarın(Şekil 3B",C).</li>
	<li>Satırdaki tüm pupalar için 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın, ardından çift yapışkanlı bant kaydırasını bir kenara koyun.</li>
	<li>İnce makas kullanarak, pupanın karnını torakstan kesip ayrı bir yığına itin(Şekil 3D,D'). Kalan pupa için tekrarlayın. NOT: Pupal bütünlüğü bozulur bozulmaz, 3.6 adımla diseksiyon un uzunluğunu zamanlamaya başlayın. Hücre ölümünü ve buna bağlı transkripsiyonve proteomik değişiklikleri önlemek için 20-30 dakika içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinek inceleyin. 1 d yetişkin veya >90 h pupa diseksiyon yaparken, daha sonraki adımların başını ince makasla çıkarmak genellikle uygundur.</li>
	<li>Bir kağıt parçası kullanarak, 1x PBS çoğunluğu kaldırmak (genellikle askıda yağ ile bulutlu) yanı sıra karın yığını(Şekil 3E). Kalan torakslar taze, soğutulmuş 1x PBS bir damla ekleyin.</li>
	<li>Tek bir hareketle uzunlamasına vücut ekseninden aşağı yaslayarak toraksı ikiye(Şekil 3F,F') kesmek için makası kullanın. Alternatif olarak, kafa çıkarılmışsa, önce başın bağlı olduğu makası takın ve IFM'ler arasında toraksın üst yarısını uzunlamasına kesin. Sonra, aynı yönde ikinci bir kesim ile toraks ventral tarafı kesti.</li>
	<li>Tüm pupaların kesilmesi için 3.7 ve 3.8 adımlarını tekrarlayın ve kaydıraktan merkezine yakın toraks hemisleri yığını oluşturur. Hemisections kurumasın böylece slayt üzerinde yeterli soğutulmuş 1x PBS olduğundan emin olun. NOT: 48 saat APF'den sonra IFM'ler, eğitimli göze standart bir kesme mikroskobu altında görülebilecek kadar büyüktür. Protokolün bu noktasında, floresan etiketli kaslar IFM tanımlamasına veya eğitim amaçlarına yardımcı olmak için floresan diseksiyon kapsamına taşınabilir, ancak bu gerekli değildir.</li>
	<li>IFM'leri göğüs kafesinde niçin parçalara ayırın. #5 forceps kullanarak hemikesitlerden birini izole edin (Şekil 3G,H). IFM'lerin ortasına ve altına bir çözgünün uçlarını yavaşça yerleştirin (Şekil 3G',H'). İlk çifenleri hareketsiz tutarken, IFM'nin bir ucunu mite ve tendondan kesmek için ince makas kullanın. Daha sonra IFM'in diğer ucunu kesip teptiz edin (Şekil 3G'',H''). NOT: İlk IFM kesildikten sonra toraksın oryantasyonuna bağlı olarak, ikinci IFM kesiminin daha kolay olması için toraks180° döndürmek yararlıdır.</li>
	<li>IFM demetini torakstan forceplarla çıkarın (Şekil 3G''',H'''), su gerilimini yerinde tutmak için PBS kabarcığının kenarına aktarır (Şekil 3I). Karkas'ı kaydıranın karşı tarafına doğru itin. Kalan toraks hemisleri için tekrarlayın, diseksiyon lu IFM'ler koleksiyonu oluşturur. NOT: IFM'ler düzgün bir yığında kalmazsa, 1x PBS'nin bir kısmını bir dokuyla çıkarın. Tüm PBS'nin buharlaşmasına izin vermemeye ve parçalanmış IFM'lerin ve hemithoraxe'lerin tampon la kaplı kalmasını sağlamaya dikkat edin.</li>
	<li>Tüm IFM'leri inceledikten sonra, incelenmiş kas üzerinde hızlı bir kalite kontrolü yapın. #5 forceps kullanarak, örnek içine kendi yolunu bulmuş olabilir herhangi bir atlama kas veya mitirkül parçaları kaldırmak(Şekil 3J-K''). NOT: Atlama kası IFM'den farklı görünür. Floresan altında Mef2-Gal4 etiketli kas diseksiyon varsa, atlama kas zayıf bir floresan ve farklı bir şekil ve doku vardır. Normal ışık altında, IFM'ler opak, sütlü sarı iken neredeyse yarı saydam görünür(Şekil 3J-J'',K).</li>
	<li>Su gerilimi kullanarak, bir çift forceps(Şekil 3L)arasında parçalanmış IFM'leri yakalayın (ancak ezmeyin). IFM'leri önceden 250 μL soğutulmuş 1x PBS(Şekil 3M)ile doldurulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın. Bölüm 4 ile hemen devam edin. NOT: Forseps uçları birbirine yakın bir yere getirildiğinde ve bir tampon çözeltisi dışına kaldırıldığında, su gerilimi forseps uçları arasında bir tampon kabarcığı yakalanmasına neden olur. IFM'ler de bu baloncukta mevcutsa, çözeltiden çıkarılabilir ve kolayca başka bir tampon dolu hazneye aktarılabilir. Tampon baloncuktan yakalanan dokunun bükülmesini önlemek için, uçları birbirine dokunmadan birbirine yaklaştırmak için püreleri sıkmak önemlidir.</li>
</ol>4. Pelet ve IFM Örneğini Koruyun
<ol><li>1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü 3-5 dk 2.000 x g'de bir masa üstü santrifüjde santrifüj ederek IFM'leri peletleyin(Şekil 4A,B).</li>
	<li>Pipet ucu(Şekil 4C) kullanarak arabelleğiçıkarın.
</li>
	<li>RNA uygulamaları için, IFM peletini istenilen RNA izolasyon tamponunun 50-100 μL'inde yeniden askıya alın (bkz. Malzeme Tablosu, Şekil 4D). Aksi takdirde, adım 4.4'e geçin. NOT: IFM'ler kütle spektrometresi preparatları veya RNA'nın ticari kitlerle izole edilmesi için 4.2. RNA uygulamaları için, IFM peletinin izolasyon tamponu içinde derhal yeniden dondurulması ve dondurulması ile daha iyi sonuçlar elde edilir.</li>
	<li>Numuneyi kuru buzda dondurma veya sıvı nitrojende çabuk dondurma(Şekil 4E). -80 °C'de, aşağı akım analizi için numune hazırlığıiçin sonraki adımlara hazır olana kadar saklayın. NOT: Kriyopreservation sonra, örnekler downstream soruşturma için işleme önce birkaç ay saklanabilir.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, Drosophila IFM'leri erken ve geç evre pupalardan protein, DNA, RNA veya diğer makromoleküllerin aşağı izole edilmesi için incelemek için temel tekniği sıyoruz. Protokol, YETIŞKIN sineklerden IFM'i incelemek için kolayca uyarlanabilir. MRNA-Seq, proteomik ve RT-PCR uygulamaları için diseksiyon protokolümüzün yardımcı programını gösteriyoruz. Daha az başlangıç malzemesi ve daha düşük girdi konsantrasyonlarına sahip numunelerin analizine olanak sağlayacak omik teknolojilerinsürekli iyileştirilmesi ile bu diseksiyonlar büyük olasılıkla birçok ek uygulama için değerli hale gelecektir. IFM'ler insan miyopatileri için kurulmuş bir model olduğundan4,24 ve kas tipi spesifik gelişim9,12, örneğin, IFM ile zenginleştirilmiş metabolomikler, kromatin konformasyonu araştırmaları 3C veya 4C ile, CLiP etkileşimleri veya miofibrillogenez fosfo-proteomik yoluyla ağ değerlendirmesi birleştirme.
Bu diseksiyonlarsaf ifm numunesi yerine IFM için zenginleştirilmiş bir numune ürettiği göz önünde bulundurulması önemlidir. Bu motor nöron innervasyonu nedeniyle kaçınılmazdır, tendon ekleri ve kas liflerinin trakeal invazyonu. Biyoinformatik analizi IFM zenginleştirilmiş gen veya proteinleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak daha fazla deney aslında IFM özgü olduğunu göstermek için gereklidir. Örnek saflık Stripe45 (tendon), Act79B4,44 (tübüler kas), Act88F15 (IFM) veya syb46 (nöronal spesifik) gibi yayınlanmış dokuya özgü belirteçler kullanılarak test edilebilir. Veri kümelerini IFM'ye özgü içeriğe normalleştirmek için bu tür belirteçleri kullanmak mümkün olabilir, ancak kullanıcılar, normalleşme için kullanılan genlerin ekspresyonundaki zamansal değişikliklerin , örneğin IFM'ye özgü genler veya tubulin gibi, böyle bir yaklaşımı saptırabileceği konusunda uyarılır.
Genetik olarak kodlanmış dokuya özgü etiketleme yöntemleri, örneğin EC etiketleme47,48 veya PABP etiketleme49,RNA izole etmek için50 son yıllarda geliştirilmiştir, hangi gerçekten elde yardımcı olabilir dokuya özgü RNA örneği. Ancak, EC-etiketlemesinekler sürekli besleme gerektirir 47 ve bu nedenle pupal aşamalarında geçerli değildir. PABP etiketli transkripsiyonların duyarlılığı ve bütünlüğü51sınırlaması olabilir. Bireysel kas liflerini izole etmek için FACS yaklaşımları IFM'lerin büyük boyutu ve sinital doğası ile karmaşık. INTACT52,53 tarzı yaklaşımlar IFM'lerden belirli hücre altı bölmeleri izole etmek için uygulanabilir, ifm çekirdekleri veya mitokondri saf popülasyonları izole etmek için yararlı olabilir. Manuel diseksiyonlar, çoğu aşağı uygulama için sağlam IFM dokusu elde etmek için hala geçerli standarttır.
Numune kalitesi, diseksiyon işlemindeki birkaç kritik adıma bağlıdır. Diseksiyonlar teknik olarak zorludur, diseksiyon hızı ve numune saflığı deneyimle artmaktadır. Deterjansız soğutulmuş tamponda kısa süreler (20-30 dk) diseksiyon ve hemen donma, fare tendon izolasyonu için daha önce de görüldüğü gibi numune bütünlüğünükorumaya yardımcı olur54. IFM'ler peletteki tüm arabelleği çıkardıktan sonra başarılı bir şekilde kurumaya biçilebilir, ancak özellikle RNA izolasyonu için, izolasyon arabelleğindeki dondurucu numuneler daha iyi sonuçlar verme eğilimindedir. 20 ayrı diseksiyondan ifm'ler RNA veya protein izolasyonundan önce birleştirilir, bu da ölçeklendirmeye ve yeterli malzemenin toplanmasına izin verir, hatta erken zaman noktalarından veya mutantlardan16,32, downstream analizi için.
RNA uygulamaları için en kritik adım RNA'nın kendisinin yalıtımı olabilir. Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform izolasyon (yukarıdaki yöntem 1) en ticari kitleri test daha iyi performans ve, daha önce belirtildiği gibi, önemli ölçüde daha az pahalı55. Ticari kitleri ile RNA izolasyon verimleri gözlenen değişkenlik önceki gözlemler ilerle aynı fikirde56,57. Biz daha fazla tüm RNA kurtarmak için izopropanol yağış sırasında glikojen ekleyin. RNA veriminin ötesinde, numunenin diseksiyon ve izolasyon işlemleri sırasında parçalanmadığından veya bozulmadığından emin olmak için RNA bütünlüğünü doğrulamak önemlidir. Ayrıca RNase-free çalışmak esastır. Son olarak, RT-kit seçimi ters transkripsiyon sürecinin hassasiyetini etkileyebilir. Sık sık ayrıntılı olarak tartışılmamakla birlikte, tüm bu noktalar IFM örneğinin kalitesini ve akış aşağı uygulamalarından elde edilen verileri etkiler.
Birçok önemli değişiklik protokolü mevcut IFM diseksiyon protokollerinden ayırıyor. IFM immünoresans için ayrıntılı bir diseksiyon protokolü19mevcut olmasına rağmen, bu protokol IFM dokusunun daha hızlı izolasyonsağlayan pupal diseksiyonlar için farklı bir yaklaşım sunar. Bu proteom veya transkripsiyon değişiklikleri önlemek için sınırlı diseksiyon süreleri ile IFM doku (nispeten konuşma) büyük miktarlarda toplanması sağlar. Diğer protokoller bireysel miyofibrils39 GFP boyama görselleştirmek için yetişkin IFM diseksiyon veya larva vücut duvarı kasları nın boyanması için58, ama pupal aşamalarında diseksiyon adresi veya RNA veya protein izolasyonu için. Bu yaklaşım aynı zamanda pupal IFM'lerin kriyos38'den mikrodisseksi için mevcut protokolden farklıdır , bu daha saf bir IFM örneği oluşturabilir, ancak daha fazla emek yoğundur ve daha az malzeme üretir. Diğer hızlı yetişkin IFM diseksiyon protokolleri ile karşılaştırıldığında38,39, IFM'ler stres indüksiyonve diğer önemli ifade değişiklikleri sınırlamak için deterjan olmadan PBS tampon izole edilir.
Bu protokoldeki en önemli ilerleme, ifm'lerin erken pupal aşamalarında izole edilmesine olanak sağlayan canlı, floresan bir muhabirin dahil edilmesidir. Biz standart olarak Mef2-GAL459 sürüş ya UAS-CD8:::GFP veya UAS-GFP::Gma60kullanın. Bu, IFM'nin diferansiyel etiketlemesini (uçuş kasları diğer pupal kaslara göre daha güçlü bir şekilde etiketlenmiş ve farklı biçimlidir) ve örneğin kurtarma veya RNAi deneyleri gibi GAL4-UAS tabanlı manipülasyonların performansına olanak tanır. RNAi ile ilişkili erken öldürücülüğü önlemek için mef2-GAL4'ü küvet-GAL80ts ile veya RNAi verimliliğini40artırmak için UAS-Dcr2 ile birleştirmek de mümkündür.
Ek GAL4 sürücüleri veya GFP-hatları kas tipi özgüllük, zamansal ifade deseni değişir ve sürücü gücü19,61 yerine Mef2-GAL4 kullanılabilir kullanılabilir. Örneğin, Act88F-GAL4 ilk olarak 24 saat APF civarında ifade edilir, bu nedenle önceki zaman dilimleri için kullanılamaz; ancak IFM'yi güçlü bir şekilde etiketler ve RNAi ile ilişkili erken öldürücülüğü önlemek yararlı olabilir. Onu-GFP veya Act88F-GFP etiket IFM, yine zamansal kısıtlamalar ile, ama marker ifade GAL4 bağımlılığı önlemek ve ilgi bir mutant arka plan ile birlikte yararlı olabilir. Diğer olası işaret satırlarının listeleri mevcuttur19. Ayrıca transgenlerin ve GAL4/UAS sisteminin kullanımının gen ekspresyonu eserlerine neden olabileceği de unutulmamalıdır, bu nedenle uygun kontrollerin kullanılması önemlidir, örneğin sürücü çizgisi vahşi tip arka plan gerilimine geçilir, böylece bu tür yapılar muhtemelen tüm örneklerde aynı.
Eşlik eden video ile, Bu ayrıntılı protokol pupal IFM diseksiyonu daha erişilebilir hale getirmek ve kas gelişimi çalışma omik yaklaşımların kullanımını teşvik amaçlamaktadır. Drosophila genetiğinin ve hücre biyolojisinin gücünü, parçalanmış IFM ile erişilebilen biyokimya ve omik tahlillerle biriktirmek miyogenez ve kas fonksiyonunun mekanistik anlayışını ilerletme potansiyeline sahiptir. Transkripsiyon ve proteom regülasyonunun sistem düzeyindeki gözlemlerini metabolik ve fonksiyonel çıktılara bağlayan gelecekteki çalışmalar, kas tipi spesifik gelişim ve kas bozukluklarının patogenezi hakkında daha derin bir anlayış sağlayacaktır.

Modern omics teknolojileri kas gelişimi ve insan kas bozuklukları nın altında yatan mekanizmalar hakkında önemli bilgiler sağlar. Örneğin, hayvan modellerinde genetik ve biyokimyasal doğrulama ile birlikte transkripsiyon verilerinin analizi, rbm20 birleştirme faktörü kaybının 30'dan fazla sarcomere hedef ağı düzenlemesi nedeniyle dilate kardiyomiyopatiye neden olduğunu ortaya koymuştur. daha önce kalp hastalığı ile ilişkili genler, titindahil 1,2,3.
İkinci bir örnekte, hücre kültürü, hayvan modelleri ve insan hastalardan yapılan çalışmalar, kas körünün (MBNL) ve CELF14,5'inyükseltisini nedeniyle RNA regülasyonunda bir bozulmadan miyotonik distrofi olduğunu göstermiştir. MBNL ve CELF1 arasındaki çapraz düzenleyici ve zamansal dinamikler (CUGBP1 veya Bruno Benzeri 2 olarak da adlandırılır) miyotonik distrofi hastalarında kalıcı embriyonik birleştirme paternlerini açıklamaya yardımcı olur. Ayrıca, yanlış düzenlenmiş hedeflerin büyük ağ hastalığın karmaşık doğasını açıklamak için yardımcı olur4,6,7,8. Bu çalışmaların çoğu insan kas hastalığının altında yatan mekanizmaları anlamak için genetik model organizmalarda omik yaklaşımlar kullanır. Ayrıca, hastalıklı veya yaşlanan kas değişiklikleri anlamak için sağlıklı kas temporal ve doku tipi özel gen ekspresyonu, protein modifikasyonu ve metabolik desenler ilk anlamanın önemini vurgulamak.
Drosophila melanogaster başka köklü genetik model organizmadır. Sarcomere yapısı yanı sıra bireysel sarcomere bileşenleri yüksek omurgalılar4,9,10sinekler korunmuş ve dolaylı uçuş kasları (IFM) çalışma için güçlü bir model haline gelmiştir kas gelişiminin birden fazla yönü11,12. İlk olarak, fibriller uçuş kasları fonksiyonel ve morfolojik olarak tübüler vücut kaslarından farklıdır11,13, kas tipi spesifik gelişimsel mekanizmaların araştırılmasına izin. Spalt majör (Salm)14,Ekstradentisle (Exd) ve Homotoraks (Hth)15 gibi transkripsiyon faktörleri fibriller kader düzenleyicileri olarak tanımlanmıştır. Ayrıca, Salm downstream, CELF1 homolog Bruno1 (Bru1, Aret) bir fibrillar özgü yapıştırma programı16,17yönlendirir.
İkinci olarak, IFM'ler miyoblast füzyonu ve miyotube eki miofibrillogenez ve sarcomere olgunlaşma9,18,19miyobez kendisi sürecini anlamak için önemli bir modeldir. Üçüncü olarak, Drosophila genetik bireysel proteinler, protein etki alanları ve protein izoformlar sarcomere oluşumu, fonksiyon ve biyofiziksel özellikleri20,21,22 katkıları nın araştırılmasına izin verir ,23. Son olarak, IFM modelleri miyotonik distrofi, miyofibriller miyopatiler, kas dejeneratif bozuklukları, aktinopatiler, vb24,25,26 gibi birden fazla insan kas bozuklukları, çalışma için geliştirilmiştir ,27, ve hastalık mekanizmaları ve potansiyel tedaviler28,29,30 içine önemli bilgilersağlamıştır. Böylece, Drosophila kas tipi spesifik transkripsiyon mekanizmaları da dahil olmak üzere miyogenez alanında birçok açık soruları ele almak için yararlı bir modeldir, splicing, ve kromatin düzenleme, kas gelişiminde metabolizmarolü gibi. Modern omics teknolojilerinin uygulanması, drosophilamevcut genetik, biyokimyasal ve hücre biyolojik tahliller geniş bir yelpazede özellikle birlikte , önemli ölçüde kas anlayışını ilerletmek için potansiyele sahiptir gelişme, yaşlanma ve hastalık.
IFM'ler sinekteki en büyük kaslardır, yetişkinlerde toraksın tüm uzunluğu boyunca yaklaşık 1 mm'ye yayılan31,32. Ancak, bu küçük boyut doku tipi özel bir şekilde Drosophila omics teknolojileri uygulamak için yeterli örnek elde etme zorluğu oluşturur. Ayrıca, IFM'ler pupal evrelerinde oluşan erişkin kasların bir parçasıdır. Miyoblastlar, puparium oluşumundan (APF) sonra 24 saat civarında tendlere bağlanan ve 30 h APF(Şekil 1A-D)18,33civarında miyofibrillogenezi başlatmak için gerekli bir sıkıştırma adımından geçilen miyotüpler oluşturmak için birleşirler, 34'e kadar.
Miyofiberler daha sonra toraksın tüm uzunluğuna kadar uzanır, miyofibriller yaklaşık 48 saat APF'ye kadar sarcomere ilavesine odaklanmış bir başlangıç büyüme evresinden geçer ve daha sonra sarcomerelerin uzunluk ve genişlikte uzadığı bir olgunlaşma aşamasına geçerler ve 72 h APF (Şekil 1A-D)32,35tarafından streç aktivasyon kurmak için remodeled . Lif olgunlaşmabaşlangıcı en azından kısmen Salm ve E2F32,36,37tarafından kontrol edilir ve birden fazla IFM özgü sarcomere protein izoformları olan birleştirme Bru1 tarafından kontrol edilir bu sırasında dahil edilir faz16,17. Olgun uçar 90-100 h APF eclose. Bu kas gelişimi çalışma için, IFM yeterli miktarda izole edilmesi gerektiği anlamına gelir, kalite, ve birden fazla pupal zaman noktalarından saflık omik yaklaşımlar kullanarak analizi kolaylaştırmak için.
IFM diseksiyonu için çeşitli protokoller yayınlanmıştır. Bu protokoller amaçlanan uygulamalar için iyi çalışır, ancak hiçbiri omics yaklaşımlar için idealdir. Pupal ve erişkin IFM'lerin immünorfülolojisi için IFM morfolojisini koruyan protokoller19, mekanik değerlendirme için IFM liflerini izole31, veya kriyokesilerden pupal IFM mikrodisyonu kullanan38 çok özel ve zaman ve omik uygulamaları için yeterli miktarda IFM dokusu elde etmek için emek yoğun. Diğer protokoller özellikle yetişkin IFM38hızlı diseksiyon için geliştirilmiştir,39, bu nedenle pupal aşamaları için geçerli değildir, ve ideal olmayan veya uyumsuz olabilir tamponlar kullanın, örneğin, RNA izolasyon. Bu nedenle, biyokimya veya omik uygulamaları için pupal IFM izole etmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Burada 16 h APF'den yetişkin evrelerine kadar mRNA-Seq analizinde başarıyla kullanılan pupal evrelerinde IFM diseksiyonu için bir protokol salıyoruz16,32. Protokol, pupal ve yetişkin gelişiminin tüm aşamalarında IFM'leri tanımlamak için yeşil floresan protein (GFP) etiketi kullanır ve floresan diseksiyon mikroskobu altında canlı diseksiyonun alabını sağlar. Bu yaklaşım, mevcut IFM diseksiyon protokollerinden daha yüksek bir iş gücüyle daha az emek yoğundur. Bu, numunelerin hızlı izolasyonve kriyopreservation sağlar, omics yaklaşımlar yanı sıra standart ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu için birkaç tur diseksiyon sonra yeterli malzeme üreten (RT-PCR) veya batı lekeleme.
Protokolü, 48 saat APF'den önce (IFM ekleri daha ince olduğunda) ve 48 saat APF'den sonra (pupal vücut planı ve IFM ekleri iyi tanımlandığında) ifmlerin nasıl hızla kesiştiğini gösteren iki bölümhalinde sıyoruz. Yüksek kaliteli RNA'yı tüm zaman noktalarında parçalanmış IFM'lerden izole edebileceğimizi ve RNA yalıtımı ve ters transkripsiyona yönelik farklı yaklaşımlar hakkında veri sunabileceğimizi gösteriyoruz. Son olarak, celf1 homolog Bruno1'i kullanarak mRNA-Seq, kütle spektrometresi ve RT-PCR'ye diseksiyon protokolünün uygulanmasını örnek olarak gösteriyoruz. Biz Bruno1 mutant IFM proteomics verilerinde sarcomere protein izoformlarının yanlış ekspresyonu göstermek ve Myosin ağır zincir C-terminal splice olay Bruno1 düzenleme incelemek(Mhc). Bu sonuçlar, omik verilerin genetik ve biyokimyasal deneyleri tamamlayarak biyolojik fenomenlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını nasıl sağlayabileceğini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>5x High Fidelity (HF) tampon</td><td>Thermo Fisher</td><td>F518L</td><td></td></tr><tr><td>60 mm kültür kapları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z643084-600EA</td><td>Greiner tabakları, 60 mm x 15 mM, havalandırmalı</td></tr><tr><td>Siyah diseksiyon kabı (cam)</td><td>Augusta Laborbedarf</td><td>42021010</td><td>Lymphbecken, siyah cam, 4 cm x 4 cm</td></tr><tr><td>Siyah silikon diseksiyon kapları: aktif kömür tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9157</td><td>Ayrıca çoğu eczaneden temin edilebilir</td></tr><tr><td>Siyah silikon diseksiyon kapları: Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>Yemekler, Sylgard'ın (~ 50g) aktif kömür tozu (200 mg) ile karıştırılması ve Petri kaplarında (~ 4 60 mm tabaklar) kürlenmesiyle yapılır.</td></tr><tr><td>Mavi havaneli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td>Sterilize edilebilen herhangi bir pelet tokmağı, motorlu bir öğütücü ile de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Cep telefonu kamerası, Samsung Galaxy S9</td><td>Samsung</td><td>SM-G960F/DS</td><td>mikroskop altında çekilmemiş fotoğraflar için kullanılır</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,0500</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop, Leica SP8X dik konfokal</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop, Zeiss LSM 780 ters konfokal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>www.zeiss.com</td></tr><tr><td>Çift yapışkanlı bant</td><td>Scotch/3M</td><td>3M ID 70005108587</td><td>Çift taraflı bant, çoğu ofis malzemesi işleyicisinde bulunur</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td>Inox düz uçlu 11 cm forseps, 0,05 mm x 0,02 mm uçlu EtOH</td></tr><tr><td>(%100, RNase) ile Biyoloji sınıfı ücretsiz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>floresan diseksiyon mikroskobu kamerası, Leica DFC310 FX kamera</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Floresan diseksiyon mikroskobu yazılımı, Leica Application Suite (LAS) sürüm 4.0.0</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Floresan diseksiyon mikroskobu, Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td></td><td>www.leica-microsystems.com</td></tr><tr><td>Sinek: Bru1 [M2]</td><td></td><td></td> <td>Sinek stoğu; Bu kağıt</td></tr><tr><td>Fly: Bru1 [M3]</td><td></td><td></td> <td>Fly stok; Bu kağıt</td></tr><tr><td>Fly: Mef2-GAL4</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC:27390</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: salm[1]</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>3274</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: salm[FRT]</td><td></td><td></td><td>Fly stock; bakınız Spletter et al., Elife, 2018</td></tr><tr><td>Fly: UAS-Bru1IR</td><td>Vienna Drosophila Araştırma Merkezi</td><td>GD41568</td><td>Fly stock, RNAi saç tokası</td></tr><tr><td>Fly: UAS-GFP::Gma</td><td>Bloomington Stok Merkezi</td><td>BDSC:31776</td><td>Sinek hisse senedi</td></tr><tr><td>Fly: UAS-mCD8a::GFP</td><td>Bloomington Stok Merkezi</td><td>BDSC:5130</td><td>Fly hisse senedi</td></tr><tr><td>Fly: w[1118]</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>3605</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Fly: weeP26</td><td></td><td></td><td>Fly stock; bakınız Clyne ve diğerleri, Genetik, 2003</td></tr><tr><td>GFP tespit reaktifi, GFP-Booster</td><td>ChromoTek</td><td>gba488-100</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü işleme yazılımı, Photoshop CS6</td><td>Adobe</td><td></td><td>www.adobe.com</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>2-propanol</td></tr><tr><td>Yöntem 1 (RNA izolasyonu): TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Guanidinyum izotiyosiyanat ve fenol monofazik çözelti</td></tr><tr><td>Yöntem 2 (RNA izolasyonu): Yöntem 1 + TURBO DNA'sız Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1907</td><td>TRIzol izolasyonu ve ardından DNA'yı çıkarmak için bir kit ile tedavi</td></tr><tr><td>Yöntem 3 (RNA izolasyonu): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kiti</td><td>Zymo Research</td><td>R2070S</td><td>TRIzol'de RNA izolasyonu, ancak faz ayrımı kullanmak yerine ticari sütunlar üzerinden. Monarch DNase I Reaksiyon tamponunda Monarch Dnase I ile gerçekleştirilen önerilen DNaz tedavisi.</td></tr><tr><td>Yöntem 4 (RNA izolasyonu): RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Sağlanan DNaz tedavisini kullandık. IFM peletleri, hayvan dokuları için önerildiği gibi RTL tamponunda homojenize edildi.</td></tr><tr><td>Yöntem 5 (RNA izolasyonu): ReliaPrep RNA Doku Miniprep Sistemi</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td>için protokol uyguladık ' Fibröz Dokulardan RNA'nın Saflaştırılması'.</td></tr><tr><td>Yöntem 6 (RNA izolasyonu): Monarch Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>T2010G</td><td>Dokular/lökositler için protokolü uyguladık ve 300 & mu'da parçaladık; L RNA koruma reaktifi.</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM12400</td><td>RNaz içermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1,5 mL</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Thermo Fisher</td><td>12342108</td><td>Standart slaytlar, şarjsız, 1 mm</td></tr><tr><td>Mikrotom bıçakları</td><td>PFM Medical</td><td>207500003</td><td>C35 tüy 80 mm</td></tr><tr><td>Monarch DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>T2004-21</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNase I Reaksiyon Tamponu</td><td>Yeni İngiltere Biolabs</td><td>T2005-21</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Thermo Fisher</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0480X</td><td></td></tr><tr><td>Boya Fırçası</td><td>Marabu</td><td>1910000000</td><td>Marabu Fino Round No. 0 veya herhangi bir sanat kaynağından benzer fırça</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS tamponu (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 L çözeltiler için fosfat tamponlu tuzlu su tabletleri, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA PureTip Pipet Uçları</td><td>Elemental Scientific</td><td>ES-7000-0101</td><td>Numune kaybını azaltmak için standart pipet uçları için isteğe bağlı ikame; 100 mL, 0,8 mm delikli</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polimeraz</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530XL</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5161</td><td>Üniversal 200 mL pipet ipuçları</td></tr><tr><td>Preomics iST 8x Kiti</td><td>Preomics</td><td>P.O.00001</td><td>kütle spektrometresi için peptit hazırlama kiti</td></tr><tr><td>Q Eksaktif kütle spektrometresi</td><td>Thermo Fisher</td><td>725500</td><td>kütle spektrometresi, LMU Biyomedikal Merkezi Qubit RNA Test Kiti Protein Analiz Ünitesinde gerçekleştirildi</td></tr><tr><td></td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-phalloidin</td><td>Invitrogen, Moleküler Problar</td><td></td><td></td>10063052</tr><tr><td>RNA konsantrasyonu Yaklaşımı 1 & RNA bütünlük izleri, Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA konsantrasyonu Yaklaşım 2, Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNA konsantrasyonu Yaklaşım 3, Qubit 4 Florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chips</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Promega</td><td>A7937</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen su, Dietil pirokarbonat (DEPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC, suyu gece boyunca arıtır ve ardından tüm RNase'yi çıkarmak için otoklavda bulunur.</td></tr><tr><td>RT Kiti #1: Süper Komut Dosyası III Ters Transkriptaz Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td>ters transkripsiyon kiti</td></tr><tr><td>RT Kiti #2: LunaScript</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td>ters transkripsiyon kiti</td></tr><tr><td>RT Kiti #3: QuantiNova Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>205410</td><td>ters transkripsiyon kiti</td></tr><tr><td>Sürgülü montaj tamponu, Vectashield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td>DAPI içeren</td></tr><tr><td>İstatistiksel yazılım: GraphPad Prism</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>İstatistiksel yazılım: Microscoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Paketin bir parçası olarak satın alınan: Office Home & Öğrenci 2019</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5405000760</td><td>Eppendorf Santrifüj 5425 veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Doku / Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td>Standart kağıt mendil</td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350796</td><td>Plastik pipet</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>15000-00</td><td>3 mm kesici kenar, uç çapı 0,05 mm, uzunluk 8 cm</td></tr><tr><td>Whatman kağıdı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004-070</td><td>Filtre kağıdı daireleri, Grade 4, 70 mm</td></tr></tbody></table>

omics yaklaşımlar için drosophila melanogaster uçuş kasları diseksiyon

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila uçuş kası transkripsiyonel düzenleme, alternatif birleştirme, metabolizma ve mekanobiyoloji gibi çeşitli süreçleri incelemek için güçlü bir modeldir, tüm etkisi kas gelişimi ve miofibrillogenesis. Kütle spektrometresi veya derin sıralama ile üretilenler gibi Omics verileri, bu biyolojik süreçlere önemli mekanik bilgiler sağlayabilir. Bu tür yaklaşımlar için, omik parmak izlerinin hem seçiciliğini hem de özgüllüğünü artırmak için dokuya özgü numunelerin analiz inde faydalıdır. Burada canlı pupa dan floresan etiketli uçuş kası diseksiyon uiçin bir protokol sunmak omik uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş kas örnekleri oluşturmak için. İlk olarak erken pupal evrelerde uçuş kaslarının nasıl diseksiyon unu (<48 h sonra puparium oluşumu [APF]), kaslar yeşil floresan protein (GFP) etiketleme ile ayırt edilebilir olduğunda açıklar. Daha sonra geç pupa (>48 h APF) veya yetişkinlerden kasların nasıl kesiştiğini, kasların bir diseksiyon mikroskobu altında ayırt edilebilir olduğunu açıklarız. Eşlik eden video protokolü bu teknik olarak talep edilen diseksiyonları kas ve Drosophila araştırma toplulukları için daha yaygın olarak erişilebilir hale getirecektir. RNA uygulamaları için, farklı zaman noktalarında ve farklı yaklaşımlarla izole edilebilen RNA'nın miktarını ve kalitesini tarıyoruz. Ayrıca Bruno1 (Bru1) miyozin ağır zincir(Mhc)birleştirme bir zamansal değişim için gerekli olduğunu göstermek, diseksiyon kasları mRNA-Seq için kullanılabilir gösteren, kütle spektrometresi, ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) Uygulama. Bu diseksiyon protokolü dokuya özgü omik analizlerinin desteklenmesine yardımcı olacaktır ve genellikle miyogenezin birden fazla biyolojik yönünü incelemek için uygulanabilir.

Drosophila uçuş kası transkripsiyonel düzenleme, alternatif birleştirme, metabolizma ve mekanobiyoloji çalışma güçlü bir modeldir. Biz proteomics ve derin sıralama için ideal son derece zenginleştirilmiş örnekler oluşturmak için canlı pupa floresan etiketli uçuş kası diseksiyon için bir protokol salıyoruz. Bu örnekler kas gelişiminin çeşitli yönleri ne önemli mekanistik anlayışlar sunabilir.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Protokol, gen ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için pupa gelişimi sırasında drosophila'dan çeşitli zaman noktasında GFP etiketli dolaylı uçuş kasının diseksiyonu kolaylaştırıyor. Bu teknikler kullanılarak, rt-PCR, batı leke veya omik yaklaşımlar için uygun minimum RNA protein bozunması ile yüksek zenginleştirilmiş uçuş kas örneği elde edilebilir. Bu özel diseksiyonlar pratik ve beceri gerektirir, ancak kesilebilir pupa sayısı ve örneklerin kalitesi deneyimi ile geliştirmek.Bu diseksiyonun görsel gösterimi, uçuş kaslarının kas dışı dokulardan nasıl ayırt edilebildiğini belirlemek ve uçuş kaslarının pupal numunelerden hızlı bir şekilde izole edilmesi için çok önemlidir. Pupa sahnelemek için, 60 milimetrelik Petri kabına pre-pupa toplamak ve aktarmak için ıslak bir fırça kullanın ve bir dürbün mikroskobu altında pupa seks. Erkekler, opak pupaüzerinde yarı saydam küreler olarak görünen testislerin varlığıyla tanımlanır.Yemeği sineklerin zamanı, tarihi ve genotipiyle etiketledikten sonra, pupayı uygun aşamaya kadar 25 ila 27 derece lik bir inkübatörde yaşlayın. 48 H APF'den önce IFM diseksiyonu için, uygun şekilde hazırlanmış pupayı soğutulmuş PBS ile dolu 2/3'lük siyah bir diseksiyon kabına aktarmak için ıslak bir fırça kullanın. Floresan diseksiyon mikroskobu altında, siyah diseksiyon çanak altına pupa birini itmek için 5 forceps kullanın.Pupa açıkça görselleştirilene kadar mikroskop yakınlaştırma ve odak ayarlayın. Pupanın ön kısmını kavramak için bir çift forceps kullanarak, ikinci bir çift forceps tek bir ucu ile pupa dürtmek, karın biraz kapalı-merkez, toraks hemen arkasında. Pupal kılıfın ön yarısını çıkarmak ve karını torakstan ayırmak için toraksın hemen arkasındaki açıkpayı çimdiklemek için ilk keter leri kullanın.Daha sonra, floresan etiketli IFM'leri ortaya çıkarmak için toraksın ön kısmını hafifçe sıkın. Daha sonra, kalan leşi yemeğin karşı tarafına atmak için terpleri kullanın ve sonraki pupayı aynı şekilde inceleyin. Tüm pupa kesildi kten sonra, IFM lifleri toplamak için keterkullanın ve siyah kesme çanak altında bir yığın halinde lifleri düzenlemek.Herhangi bir enkazı görüş alanının dışına itmek için çalgılar kullanın ve ifm olmayan kasları, yağları, piriçleri veya diğer istenmeyen dokuyu örneklerden çıkarın. Daha sonra, IFM yığınını 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarmak için kırpılmış pipet ucu kullanın. 48 H APF'den sonra IFM diseksiyonu için, sahnelenen pupayı mikroskop kaydıranın üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant şeridine aktarmak için hafifçe ıslak bir fırça kullanın.Bir çizgi içinde pupa Orient, ventral tarafı aşağı, ve slayt altına doğru ön. Tüm pupa yerleştirildiğinde, ayrı kızdırmak ve ön spiracles üzerinde ilk pupal durumda açmak için forceps kullanın, ve yavaşça posterior doğru, forceps dorsally bir çift slayt, forceps hareket olarak pupal durumda kesme. Pupayı açılan kasadan kurtarın ve hemen ikinci bir mikroskop slaytında pupayı bir damla PBS'ye aktarın.Tüm pupa serbest bırakıldığında, uzak toraks pupa karın kesmek için ince makas kullanın, ve ayrı bir yığın içine karın itin. Tüm toraks lar çıkarıldığında, PBS çoğunluğu ve karın yığını kaldırmak için bir kağıt mendil kullanın. Kalan torakslara taze, soğutulmuş PBS bir damla ekleyin, tek bir hareketle toraks ikiye bölmek için uzunlamasına vücut ekseni boyunca kafa kesmek için makas kullanmadan önce.Tüm pupalar incelendiğinde, hemikesitlerden birini seçmek için 5 forceps kullanın ve ifm'lerin ortasına ve altına bir tane tane sinin uçlarını nazikçe yerleştirin. İlk çift forceps'ü hala tutarak, pupa180 derecedöndürmeden önce, IFM'nin bir ucunu miğkül ve tendondan uzaklaştırmak için ince makas kullanın. IFM paketini torakstan PBS kabarcığın kenarına aktarmak için, paketi yerinde tutmak için su gerilimini kullanarak forcep'leri kullanın.Ardından, karkas slaytın karşı tarafına doğru itin ve IFM'lerin geri kalanını aynı şekilde inceleyin. IFM'lerin tümü toplandığında, numunelerin içine giden yolu bulmuş olabilecek herhangi bir atlama kası veya manikür parçalarını çıkarmak için 5 forceps kullanın. Daha sonra bir çift forceps arasında parçalanmış IFM'leri nazikçe yakalamak ve IFM'leri 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirmek için su gerilimini kullanın.BRUNO1 IR IFM'lerden alınan mRNA sıralama verileri, yabani tip sıralama verilerine göre gen birimi düzeyinde ekspresyon değişiklikleri gösterir. Diseksiyonlu IFM'lerde tüm proteom kütle spektrometresi kullanılarak protein ve protein izoform düzeylerinde de benzer bir düzenleme gözlenmektedir. Mhc'nin son introniçine bir protein tuzak hattı yerleştirildikten sonra, GFP etiketli proteinin dahil edilmesi IFM'de M-line'ın her iki tarafında 90 H APF'de iki nokta olarak gözlemlenebilirken, bacak kası dokusunda GFP sinyali sarcomere M-line boyunca düzgün bir şekilde gözlemlenebilir.Parçalanan IFM'de RT-PCR kullanılırken, GFP etiketli ekson 34-37 olayından etiketsiz ekson 34-35 olayına kadar bir Mhc izoform anahtarı, 27 santigrat derecede puparium oluşumundan 30 ila 48 saat sonra tespit edilebilir. MRNA dizileme verilerinden, bacak ve atlama kas dokuları üç Mhc izoformunu da ifade eder ve olgun kaslarda GFP etiketli izoformun ekspresyonunu korur. Hem Spalt majör mutant ve BRUNO1 IR-IFM, gfp etiketli Mhc izoform un ekspresyonunu kapatmayı başaramadılar, bu da bacak ve atlama kas dokusuna benzeyen izoform bir ifade profili ile sonuçlandı.RNA bozulmasını önlemek için diseksiyonlar30 dakikadan daha az bir dakika içinde yapılmalıdır unutmayın. Ve, diğer hücre tipleri tarafından kontaminasyon sınırlamak için dikkat etmek. Bu yöntem, RT-PCR veya batı lekeleme gibi biyokimyasal yaklaşımlara uygun IFM ile zenginleştirilmiş örneklerin yanı sıra kütle spektrometresi, yüksek iş elde ekiseri, kromatin konformasyon yakalama ve metabolomik gibi omik stil yaklaşımları oluşturur.Bu diseksiyonlar Drosophila'daki güçlü genetik yaklaşımları, gelişme ve gen düzenlemesinin temel mekanizmalarını araştırmak için sistem düzeyinde verilerle tamamlayabilir.

dissection-drosophila-melanogaster-flight-muscles-for-omics

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Drosophila Larvaların NMJ Diseksiyon

Kas hasarı altta yatan mekanizmaların belirlenmesi çok önemlidir. Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu kas morfoloji ve protein ve diğer kas hücre bileşenleri lokalizasyonu analizi sağlar.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

Drosophila uçuş kasları, kas gelişimi ve fizyolojisi için model bir sistem olarak kullanılır. Bu video, yetişkinlerin uçuş kaslarını açıklar ve pupalardan RNA dizilimi için uygun olan dolaylı uçuş kaslarının geliştirilmesini incelemek için bir protokolü vurgular.

Drosophila Geç Pupa İndirekt Uçuş Kası (IFM) Diseksiyonu: Yüksek Verimli Doku Toplama Yöntemi

Bu video, Drosophila'nın dorsal longitudinal kaslarındaki nöromüsküler kavşakların yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokolü göstermektedir. Prosedür, nöronların ve kasların iki farklı antikorla boyanmasını ve mutant ve vahşi tip sinekler arasındaki floresan modellerinin karşılaştırılmasını içerir. Mutant sineklerde nöronal lekelenmede bir azalma, kas yapısı bozulmadan kalırken nörodejenerasyonu gösterir.

Drosophila'da Dorsal Longitudinal Kas Nöromüsküler Kavşaklarının Yapısal Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Drosophila larva dendritik arborization (da) nöronları kullanarak nöronal morfolojilerinden Çalışmaları Immünofloresan nöronal ve epidermal proteinlerin in situ görselleştirme yarar. Larva vücut duvarı kas dokusu kaldırarak da nöronlar ve çevresindeki epidermal hücrelerin immünoflüoresans analizi artıran bir prosedür açıklanmaktadır.

Kaldırılması<em&gt; Drosophila</emDuyu Nöronlar ve Epidermal Hücre İmmünofloresan Analizi Larvaların Fileto dan&gt; Kas Dokusu

Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA'ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila , miyogenezin temel mekanizmalarını anlamak için güçlü bir modeldir. Toraks hemi-sezaritlerinin diseksiyonu ve hazırlanması için bu protokol, hem pupa hem de yetişkin aşamalarından dolaylı uçuş kasının mikroskopi analizini sağlar. Bu protokol, hücresel morfolojinin, protein lokalizasyonunun, kas yapısının ve miyogenezin diğer birçok yönünün konfokal görüntülenmesini sağlar.

Mikroskopi Yaklaşımları için Drosophila melanogaster Dolaylı Uçuş Kaslarının Diseksiyonu

Öğrenin Drosophila melanogaster pupalarından GFP işaretli dolaylı uçuş kası diseksiyonu yapmayı. Bu yöntem proteomik ve derin dizileme için yüksek kaliteli örnekler sağlar.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Daha fazla video keşfet