Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Bu endotel hücre kültür sisteminin kullanımı kan akışında durumun asimilasyon sağlar. Ve bu durumla, bakteriyel vektörlerin ve bu süreçte yer alan hücre vektörlerinin tanımlanması da dahil olmak üzere bakteriyel enfeksiyon süreçlerini analiz edebiliriz. Bu teknik, bakteriyel enfeksiyonların damar bütünlüğü üzerindeki etkisini keşfetmenin, morfogenez mekanizmaları üzerindeki etkisini de içeren, inflamasyon yanıtları ve bağışıklık regülasyonu üzerindeki etkisini keşfetmenin yolunu açmaktadır.

Bu teknik endotel hücrelerinin bazı özel işleme gerektirir ve bu nedenle görsel bir açıklama sadece sözlü bir açıklama daha iyidir. Bu yöntem endotel hücre farklılaşması, yara iyileşmesi, tümör oluşumu ve anjiyogenez gibi perfüzyonvasküler sistemlerle ilişkili araştırmanın diğer çeşitli alanlarına ilişkin içgörüler sağlar. Önemli adımlardan biri standart hücre ekimi yanı sıra birincil endotel hücrelerinin doğru işleme olduğunu.

Bu teknik, sadece sözlü açıklama ile açık olamazdı bazı özel hücre kültürü işleme gerektirir. Başlamak için, temiz bir tezgah kullanarak steril bir ortamda çalışmak. Bir sıcaklık dengelenmiş kanal slayt tek bir rezervuar içine% 2 steril filtredomuz jelatin PBS çözeltisi 100 mikrolitre enjekte etmek için bir pipet kullanın.

Jelatin kaplı kanal slaytını ince bir polistiren veya strafor plakaüzerine yerleştirin ve bir mililitreLu şırınga ile slayt sıcaklığında bir düşüşü önleyin ve dört kat 10'luk mikrolitreyi mililitre başına beşte 10 ila 5'lik HUVEC süspansiyonu tohuma ekleyin ve HUVEC'i yetiştirin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 60 dakika HUVEC ile kanal slayt kuluçka. Bundan sonra, kanal slaytının her iki ucundaki her orta hazneyi 60 mikrolitre ECGMS ortamı ile doldurun.

37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle bir saat daha kuluçkaya yat. Daha sonra, mikroakışkan pompayı ayarlamak için, önce dengedeki perfüzyon setini pompa ünitesine bağlayın, 13,6 mililitre ECGMS ortamı ile doldurun ve pompa kontrol yazılımını çalıştırın. Akışkan birim kurulumu nun menüsünde, pencereleri aşağı kaydırma'yı kullanarak yeterli perfüzyon kümesini ve oda slayt türünü seçin.

Orta viskozite için yazılımda santimetre kare başına 0,007 dyne saniye seçin. Kuvöz dışında, hava basıncı tüpüne kurutma silika boncukları ile dolu bir cam şişe bağlayın. Yazılım menüsünde akış parametrelerini seçin, basıncı 40 milibar'a ayarlayın ve sürekli orta akışı başlatarak pompa tüplerini sıvı ortamla temizleyin.

Biz subconfluently yetiştirilen HUVECs kullanarak sıkı bir hücre eki sağlamak ve ayrıca pompa sistemi için bağımsız güç kaynağı kullanarak yanı sıra sistem den hava kabarcıkları alma odaklanmak. Hava kabarcıklarını çıkarmak ve pompa sisteminde hava kabarcıklarının dolaşmadığından emin olmak için boru bağlantılarına dokunun. Kanal kaydırasını bağlamak için, pompa kontrol yazılımındaki akış sirkülasyonunu durdurun ve Luer bağlantısının yakınındaki tüpleri sıkıştırarak orta akışı ve perfüzyon borusunu tutun.

Kanal slaytını bağlayarak hava kabarcıklarından kaçının. Pompa kontrol yazılımı gelişmiş sekmesinde, akış ekimi için istenen kesme stres döngüleri programlamak için yazılım aracı döngüsü oluşturucu kullanın. Akış dolaşımı için kesme gerilim düzeylerini programla ve uzun süreli perfüzyona başlayın.

30 dakika boyunca dakikada 5,44 mililitrelik bir akış hızına karşılık gelen santimetre kare başına beş dyne ile başlayın ve ardından dakikada 10,85 mililitrelik bir akış hızına karşılık gelen santimetre kare 10 dyne kesme stresinde sürekli akış. Kontrol dengeli rezervuar pompalama. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir kuvöz bağlı kanal slayt ile akışkan birim yerleştirin.

Mikroskop yazılım denetimini başlatın ve uygun filtre ayarlarını seçerek floresan mikroskobik izleme için ilke ayarlarını ayarlayın. Mikroskobik görüntüleme için, akışkan üniteyi 37 santigrat derecelik ısıtma odasına yerleştirin. Kanal slaytını önceden ısıtılmış bir mikroskobun sahnesine yerleştirin.

Histamin ve bakterilerin akış dolaşımına enjekte edilmeden önce hücre morfolojisini ve HUVEC tabakasının bütünlüğünü kontrol edin. Akış ayarını koruyun. Perfüzyon tüpünde dolaşan ECGMS ortamına bir enjeksiyon portu aracılığıyla 100 milimolar histamin stok çözeltisinin 136 mikrolitresini enjekte ederek VWF'nin endotel canlı Palade cisimlerinden salınımını teşvik edin.

Multimerized VWF dizelerin immünoresans tespiti için, 200 mikrolitre PBS hacminde 200 mikrolitre LIK BIR VWF özel FITC konjuge antikor 20 mikrogramı ECGMS ortamının 13.6 mililitrelik sirkülasyonuna enjekte edin. HUVEC hücre yüzeylerinde oluşturulan VWF dizeleri Pnömokok eki ölçmek için, enjeksiyon portu kullanarak ECGMS orta içine bir mililitre maksimum hacimde Pnömokok lar ifade mililitre RFP başına sekizinci CFU 1.35 kez 10 enjekte. Mikroskop büyütme için 63X yağ daldırma hedefi seçin ve mikroskop yazılımındaki floresan filtre ayarlarını Pnömokok'u ifade eden RFP algılama filtresi için 540 nanometre algılama filtresiyle RFP kanalına ayarlayın.

VWF dizeleri bakteriyel eki nicelik için, her biri yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren en az 30 temsili alan görünümleri Z yığınları anlık oluşturmak ve Pnömokok miktarını saymak. İmmünfloresan boyama dan önce fiksasyon sonrası bakterie bağlılığı değerlendirmek için, akışı durdurun, pompa haznelerinden 10 mililitre ECGMS ortamını çıkarın ve %5 paraformaldehit ile birlikte 10 mililitre PBS ekleyin ve el yazmasına göre ilerleyin. Bu protokolde, deneysel basamaklar, hücre kültürü şişelerinde yer biraraya gelmesiiçin birincil endotel hücrelerinin önceden yetiştirilmesiyle başlar.

Hücreler daha sonra jelatin kaplı kanal slayt içine tohumlu. Bakteriler agar plakaları üzerinde yetiştirilir ve ardından karmaşık bir sıvı ortamdan orta kütük fazına kadar ekim yapılır. Mikroakışkan hücre kültürü için, endotel hücreleri ile bir kanal slayt pompa sisteminin akışkan bir birimin perfüzyon tüpleri bağlı ve hücre farklılaşması için sürekli akış tabi.

VWF dizeleri üretimi santimetre kare başına 10 dyne saniye lik bir kesme stresinde histamin enjeksiyonu ile indüklendi ve FITC etiketli VWF spesifik antikorlar kullanılarak immünororesans tespiti ile mikroskobik olarak izlendi. Bakterileri sirkülasyon ortamına ifade eden kırmızı floresan proteininin enjeksiyonundan sonra, VWF dizelerine pnömokok eki 450 nanometrede floresan emisyon ile gerçek zamanlı olarak mikroskobik olarak görüntülendi. PfA kullanarak hücrelerin fiksasyonu sonra, diferansiyel immünfloresans boyama belirli enfeksiyon zaman noktalarında bakteriyel eki görselleştirme sağlar.

Bu işlemin en önemli adımı fizyolojik kesme stres düzeylerini ayarlayarak ve aşırı pompa basıncı dalgalanmaları kaçınarak slayt yüzeyinde sıkı bir hücre eki sağlamaktır. Mikroskobik görselleştirmeye ek olarak, bu teknik yeni anti-enfektifin farmakolojik etkilerini incelemek ve aynı zamanda vasküler enfeksiyon süreçlerinin uzun vadeli sonuçlarını analiz etmek için uygulanabilir. Bu pompa sistemi aerosoller yoluyla herhangi bir iletimi önlemek için hava basıncı ile bakteriyel patojenler perfuses.

Biyogüvenlik önlemlerine uyulması tavsiye edilir.