Name: Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Keşfedin pnömokok enfeksiyonunu sürekli akış koşullarında birincil insan endotel hücrelerinde. Bu yöntem, bakteri yapışmasını mikroskobik olarak görselleştirerek damar bütünlüğü ve immün yanıtlar üzerine bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje DFG (BE 4570/4-1) tarafından S.B.'ye finanse edilmiştir.

<ol><li>Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae%3A+transmission%2C+colonization+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).</li>
<li>Bergmann, S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+pneumococcal+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Versatility of pneumococcal surface proteins.</a> Microbiology. 152, 295-303 (2006).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+required+for+vitronectin-mediated+internalization+of+Streptococcus+pneumoniae+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells.</a> Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).</li>
<li>Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+bacterial+enolase+and+plasminogen+promotes+adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+epithelial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae+is+a+plasmin%28ogen%29-binding+protein+displayed+on+the+bacterial+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface.</a> Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+plasmin%28ogen%29-binding+motif+in+surface+displayed+alpha-enolase+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).</li>
<li>Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nine+residue+plasminogen-binding+motif+of+the+pneumococcal+enolase+is+the+major+cofactor+of+plasmin-mediated+degradation+of+extracellular+matrix%2C+dissolution+of+fibrin+and+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration.</a> Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).</li>
<li>Jagau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+mediates+pneumococcal+aggregation+and+adhesion+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).</li>
<li>Tischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+local+disorder+in+a+clinically+elusive+von+willebrand+factor+provokes+high-affinity+platelet+clumping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping.</a> Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).</li>
<li>Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+von+willebrand+factor+and+its+function+in+platelet+adhesion+and+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+Research+Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation.</a> Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).</li>
<li>Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+willebrand+factor+in+cardiovascular+disease%3A+Focus+on+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes.</a> Circulation. 117, 1449-1459 (2008).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124, 1412-1425 (2014).</li>
<li>Luttge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+induces+exocytosis+of+weibel-palade+bodies+in+pulmonary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).</li>
<li>Cornish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+in+a+Pipe+of+Rectangular+Cross-Section%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+A%22%5BJournal%5D)">Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section.</a> Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).</li>
<li>Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+von+Willebrand+Factor+Pathophysiology+Using+a+Flow+Chamber+Model+of+von+Willebrand+Factor-platelet+String+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation.</a> Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).</li>
<li>Bergmann, S., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+cells+to+engineered+and+explanted+tissues%3A+New+perspectives+in+bacterial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology.</a> International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).</li>
<li>Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+a+miniaturized+capillary+electrophoresis-based+chemical+analysis+system+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip.</a> Science. 261 (5123), 895-897 (1993).</li>
<li>Magnusson, M. K., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+Structure%2C+assembly%2C+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).</li>
<li>Zerlauth, G., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibronectin+as+a+marker+for+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases.</a> The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).</li>
<li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2012.+Microfluidic+3D+cell+culture%3A+potential+application+for+tissue-based+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).</li>
<li>Fiddes, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circular+cross-section+PDMS+microfluidics+system+for+replication+of+cardiovascular+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions.</a> Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).</li>
<li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralarge+von+willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128, 50-59 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).</li>
<li>Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wall+shear+stress+as+measured+in+vivo%3A+consequences+for+the+design+of+the+arterial+system%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).</li>
<li>Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+Weibel-+Palade+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of Weibel- Palade bodies.</a> Blood. 117, 5033-5043 (2011).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+A+manual+of+basic+Technique%2C+5th+edition%22">Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition</a>. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+JA+%22Epithelial+cell+culture-+a+practical+approach%22">Epithelial cell culture- a practical approach</a>. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).</li>
<li>Elm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectodomains+3+and+4+of+human+polymeric+Immunoglobulin+receptor+%28hpIgR%29+mediate+invasion+of+Streptococcus+pneumoniae+into+the+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).</li>
<li>Nerlich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+endothelial+cells+by+tissue-invasive+M3+type+group+A+streptococci+requires+Src+kinase+and+activation+of+Rac1+by+a+phosphatidylinositol+3-kinase-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).</li>
<li>Ho, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-cell+patterning+lab+chip%3A+mimicking+the+morphology+of+liver+lobule+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue.</a> Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328, 1662-1668 (2010).</li>
<li>Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-on-a-chip%3F+The+perspectives+on+use+of+microfluidics+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine.</a> Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

VWF gibi mekanoduyaran konak proteinleri ile bakteri etkileşiminin simülasyonu, tanımlanmış, tek yönlü ve sürekli sıvı akışını sağlayan ve dolayısıyla güvenilir kesme gerilimi üreten, perfusable bir hücre kültür sistemi gerektirir . Birçok mikroakışkan pompa sistemleri zaten tarif edilmiştir. Bergmann ve ark. kapsamlı bir inceleme farklı iki ve üç boyutlu hücre kültürü modelleri17temel yönlerini özetler.
Mikroakışkan teknoloji çok genç bir teknik 1990'ların başında kont...

Pnömokok enfeksiyonlarının patogenezi, plazminojen ve VWF1gibi ekstrasellüler matriks bileşikleri ve insan hemostaz bileşenlerinin çeşitliliği ile çok yönlü bir etkileşim ile karakterizedir,2, 3,4,5,6,7,8. Multidomain glikoprotein VWF vasküler trombüs oluşumu yerinde trombosit işe ve fibrin incorporation aracılık ederek dengeli bir hemostaz anahtar düzenleyici olarak hizmet vermektedir9. Kanama kontrolü ve yara iyileşmesi için fonksiyonel, aktif VWF'nin önemi von Willebrand hastalığı ile gösterilmiştir, yaygın bir kalıtsal kanama bozukluğu10.
Globüler VWF kadar bir konsantrasyonda insan kan sisteminde dolaşır 14.0 μg/mL11,10. Vasküler yaralanmaya yanıt olarak, endotel Weibel Palade Organları (WBP) tarafından VWF lokal sürümü belirgin artmıştır11,12. Önceki çalışmalar, pnömokok insan endotel hücrelerine bağlılık ve gözenek oluşturan toksin pnömolysin üretimi önemli ölçüde luminal VWF salgılanmasını uyarır göstermektedir13. Kan akışının hidrodinamik kuvvetleri mechanoresponsive VWF etki alanlarının yapısal bir açılış neden. 10 dyn/cm2 akış hızlarında VWF, subendothelium10,12'yebağlı kalan birkaç yüz mikrometreye kadar uzun protein dizelerine multimerize eder.
Pnömokokların endotel yüzeyi ile etkileşiminde kesme stresi altında oluşturulan çok merize VWF dizelerin işlevini anlamak için mikroakışkan tabanlı hücre kültürü enfeksiyonu yaklaşımı oluşturulmuştur. Yazılım kontrollü hava basıncı pompa sistemine sahip mikroakışkan bir cihaz kullanıldı. Bu, hücre kültürü ortamının tanımlı akış hızına sahip sürekli, tek yönlü bir sirkülasyonunu sağladı. Bu nedenle, sistem endotel hücrelerinin yüzeyinde tanımlanmış bir kesme stresi uyguladı, hangi özel kanal slaytlar içinde bağlı kaldı. Bu yaklaşım, VWF dizelerinin tanımlanmış sabit akış koşullarında farklılaştırılmış endotel hücrelerinde üretildiği insan vasküler sisteminin kan dolaşımı içindeki kesme kuvvetinin simülasyonuna olanak sağladı. Bu amaçla, endotel hücreleri akış sırasında mikroskobik analizler için uyarlanmış belirli kanal slaytlarında (bkz. Malzemeler Tablosu)yetiştirilmiştir. Mikroakışkan pompa sistemi, yoğun endotel hücre tabakasıüzerinde genişletilmiş VWF dizeleri oluşumu için gerekli olan yüksek tanımlı ve kontrollü kesme gerilimi durumunu sağlamıştır. Konfluently yetiştirilen insan göbek ven endotel hücrelerinin VWF-salgılanması uyarılmasından sonra (HUVEC) histamin takviyesi tarafından, dize oluşumu bir kesme stresi uygulanarak indüklendi () 10 dyn / cm2. Kesme gerilimi hücre tabakasıüzerinde hareket eden kuvvet olarak tanımlanır. Yaklaşık cornish et göre hesaplanır. 1. denklem 1 ile al.14: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ01.jpg">
Dyn/cm2'dekikesme gerilimi , η = viskozite (dyn)/cm2, h =kanal yüksekliğinin yarısı, w = kanal genişliğinin yarısı ve Φ = mL/dk'da akış hızı.
Denklem 1'in sonucu, kullanılan farklı slaytların farklı yükseklik ve genişliklerine bağlıdır (bkz. Malzemeler Tablosu). Bu çalışmada 0.4 μm'lik bir Luer kanal slaytı kullanılmıştır ve bu slayt 131.6'dır (bkz. formül 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ02.jpg">
37 °C'de ortamın viskozitesi 0.0072 dyn/cm² olup, 10 dyn/cm² kesme gerilimi kullanılmıştır. Bu da 10,5 mL/dk akış hızıile sonuçlandı (bkz. formül 3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60323/60323equ03.jpg">
Burada, konak vaskülatürde bakteriyel enfeksiyon mekanizmalarının araştırılması ve görüntülenmesi için tek yönlü laminar akış sistemi kullanılarak mikroakışkan hücre culturing prosedürünün uyarlanma ve ilerlemesi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Endotel tabakalarında VWF dizeleri üretimi de sürekli ve sürekli kesme stresi uygulamak mümkün diğer pompa sistemleri kullanılarak uyarılabilir15.
VWF dize oluşumunun akışı ve uyarılmasında biraraya gelmek için birincil endotel hücrelerinin ekiminden sonra, kırmızı floresan proteini (RFP)16'yı sürekli mikroskobik kontrol altında endotel hücre tabakasına eklenmiştir. Endotel hücrelerinin yüzeyindeVWF dizeleri bakteri eki mikroskobik görselleştirilmiş ve VWF özgü floresan etiketli antikorlar kullanılarak gerçek zamanlı olarak üç saate kadar izlendi. Bu yaklaşımla VWF'nin vasküler endotel'e bakteriyel bağlanmasını teşvik eden bir yapışma kofaktör olarak rolü8olarak belirlenmiştir.
Protein salgısı nın mikroskobik görselizasyonu na ve konformasyonel değişikliklere ek olarak, bu yöntem bakteriyel enfeksiyon süreçlerinin tek adımlarını gerçek zamanlı olarak izlemek ve farklı zaman noktalarındaki bağlı bakteri miktarını ölçmek için kullanılabilir. Enfeksiyon. Özel yazılım kontrollü pompa sistemi de birkaç gün için tanımlanmış sabit akış koşullarında endotel hücreleri kültür imkanı sağlar ve tanımlanmış darbeli orta akış kuluçka sağlar. Ayrıca, bu yöntem farklı hücre türleri kullanılarak uygulanabilir. Boyama protokolünün uyarlanması aynı zamanda ökaryotik hücrelere dahil edilen bakterilerin algılanmasını ve görüntülenmesini sağlar.
Bu makale, patofizyolojik süreçlerin verimli ve çok yönlü bir karakterizasyonu için tanımlanmış, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım olarak kullanılabilecek bu gelişmiş deneysel protokolü açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>10303002</td>, <td>slaytların luer bağlantısını kullanarak jelatin enjeksiyonu için 1 mL</td></tr><tr><td>hacim 2 mL Luer-şırınga</td><td>Sarstedt</td><td>9077136</td><td>Kanal odası kızaklarının luer bağlantılarına sıvıları eklemek/enjekte etmek için</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>eBioscience şimdi Thermo Fisher</td><td>00-4555-56</td><td>proteaz karışımı endotel hücrelerinin nazikçe ayrılması için kullanılır</td></tr><tr><td>AlexaFluor350-konjuge Phalloidin</td><td>Abcam</td><td>ab176751</td><td>üreticiden konsantrasyon temin edilemez, stok çözeltisi 300 tet için yeterlidir, şirket 100 ve mikro kullanılmasını önerir; L 1: 1.000 seyreltme, mavi floresan (DAPI filtre ayarları)</td></tr> <tr><td>AlexaFluor488 konjuge keçi türevi anti-fare antikoru</td><td>Thermo Fisher Sientific</td><td>A11001</td><td>stok konsantrasyonu: PFA fiksasyonundan sonra mikroakışkan slaytta insan VWF'sinin immün boyanması için 2 mg/mL, yeşil floresan</td></tr><tr><td>AlexaFluor568-konjuge keçi türevi anti-tavşan antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>stok konsantrasyonu: pFA fiksasyonundan sonra mikroakışkan slaytta pnömokokların immün boyanması için 2 mg/mL, kırmızı floresan</td></tr><tr><td>Bacto Todd-Hewitt-Broth</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>BD 249210</td><td>kompleks bakteri kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-25G</td><td>çözündürülmüş, bloke edici tamponun hazırlanması için</td></tr><tr><td>TPP</td><td>90026 filtreli</td> <td>hücre kültürü şişeleri</td><td>25 cm2 yüzeyli kaplamasız hücre kültürü şişelerinde HUVEC'in alt kültivasyonu</td></tr><tr><td>Santrifüj Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>392304</td><td>bakterilerin döndürülmesi (>2 mL hacimlerde)</td></tr><tr><td>Santrifüj Allegra X-30</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>B06314</td><td>ökaryotik hücrelerin döndürülmesi</td></tr><tr><td>Santrifüj Z 216 MK</td><td>Hermle</td><td>305.00 V05 - Z 216 M</td><td>bakterilerin geri dönmesi (2 mL'den küçük hacimler)</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>3886.2</td>, <td>kırmızı floresan proteini ve kloramfenikol direnci taşıyan genetik yapı ile dönüştürülmüş pnömokokların yetiştirilmesi için 0.2 mg / mL'lik bir konsantrasyonda kullanılır kaset</td></tr><tr><td>Perfüzyon tüpü için kelepçe</td><td>Sıvıyı</td> tüpte tutmak için ibidi <td>10821</td><td>bevor sürgüyü pompa sistemine bağlama</td></tr><tr><td>CO2-İnkübatör</td><td>Fisher</td><td>Scientific MIDI 40</td><td>inkübatör boyutu, bağlı kanal kızağı ile akışkan ünitenin boyutuna mükemmel bir şekilde uyarlanmıştır ve 37 ° C'de akış ekimi için kullanılmıştır; C ve %5 CO2</td></tr><tr><td>CO><-İnkübatör</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18 AIC</td>, <td>tanımlanmış bir atmosferde bakteri ve hücrelerin inkübasyonu için %5 CO2 ve 37 &°C; C</td></tr><tr><td>Kolombiya kan agar plakaları</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>PA-254005.06</td><td>S. pneumoniae için agar bazlı kompleks kültür ortamı %7 koyun kanı ile desteklenmiş</td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td></td><td>Dell Latitude 3440</td><td>Basınç pompası yazılımı ile Comuter</td></tr><tr><td>Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM)</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td>Floresan filtresi, Xenon-ışık kaynağı (SP8, DMi8) ve DFC 365 ile donatılmış bir floresan ünitesine sahip, ısıtılabilir bir hazne ile kaplanmış bir tablaya sahip bir ters mikroskop FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapiksel)</td></tr><tr><td>Di Potasyum hidrojen fosfat (KH2P<O>sub4)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, PBS</td><td>tamponu için kullanılan</td>Karlsruhe <td>3904.1</td></tr><tr><td>Kurutma malzemesi</td><td>Merck</td><td>101969</td><td>bir cam şişede kullanılan kurutma için turuncu silika boncuklar boru adaptörü ile</td></tr><tr><td>EKGM takviyesi Karışımı</td> Endotel hücrelerinin ön kültivasyonu için gerekli olan EKGM ortamı için <td>Promocell</td><td>C-39215</td><td>takviye karışımı: 0.02 mL/mL Fetal buzağı serumu, 0.004 mL/mL endotel hücre büyüme takviyesi, 0.1 ng/mL epidermal büyüme faktörü, 1 ng/mL bazik fibroblast büyüme faktörü, 90 & g/mL heparin, 1 & mikro; g/mL Hidrokortizonlu</td></tr><tr><td>EKGMS</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>EKGM, hücre yapışmasını artırmak için %5 [a/a] FCS ve 1 mM MgSO4 ile desteklenmiştir</td></tr><tr><td>Endotel Hücre büyüme ortamı (EKGM, kullanıma hazır)</td><td>Promocell</td><td>C-22010</td><td>HUVEC kültür ortamı, zaten ek karışımın tüm bileşenleri ile desteklenmiştir</td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>biyokrom şimdi Merck</td><td>S 0415</td><td>enfeksiyon analizleri için kullanılan hücre kültürü takviyesi</td></tr><tr><td>FITC konjuge keçi anti-insan VWF antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>stok konsantrasyonu: 10 mg / mL, akışta küresel ve multimerize VWF'nin immünotespiti için</td></tr><tr><td>Akışkan Ünite</td><td>IBIDI</td><td>10903</td><td>akış yetiştiriciliği için akışkan ünite</td></tr><tr><td>Jelatin (domuz)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G-1890-100g</td><td>mikroslide kanal yüzeyinin ön kaplaması için</td></tr><tr><td>Endotelyal Weibel Palade Cisimciklerinden VWF sekresyonunun indüksiyonu için</td> <td>histamin dihidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H-7250-10MG</td></tr><tr><td>İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC)</td><td>Promocell</td><td>C-12203 Lot-No. 396Z042</td><td>havuzlanmış donörden alınan primer endotel hücreleri, sıvı nitrojen içinde kripkoservte depolanmış,</td></tr><tr>fare (monoklonal) <td>Santa Cruz</td><td>sc73268'den</td> <td>türetilen insan VWF'ye özgü antikoru</td><td>stok konsantrasyonu: 200 & PFA fiksasyonundan sonra mikroakışkan slaytta VWF'nin immün boyanması için g/mL</td></tr><tr><td>Enjeksiyon Portu</td><td>Akış sirkülasyonu sırasında rezervuar borusuna histamin veya bakteri enjeksiyonu için</td><td>ibidi</td><td>10820</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 35M</td><td>ters ışık mikroskobu 400x büyütmeye izin veren 40x su objektifi kullanarak ökaryotik hücre ayrılması ve hücre sayımının kontrolü için 400x büyütmeye</td></tr> <tr><td>izin verirLuer-slaytlar I0.4 (ibiTreat472microslides)</td><td>ibidi</td><td>80176</td><td>fludik yetiştirme için fiziksel olarak modifiye edilmiş slaytlar (&mu; &ndash; Slayt I0.4Luer, kanal yüksekliği 0.4 mm, kanal hacmi 100 &mu; l, 2,5 cm'lik bir büyüme alanı ve 25,4 cm'lik bir kaplama alanı 2) Her türlü akış tahlili için uygun olan fiziksel işlem, hidrofilik ve yapışkan bir yüzey oluşturur.</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (MgSO4, susuz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>EKGMS ortamının hazırlanması için</td></tr><tr><td>Mikroakışkan Pompa</td><td>ibidi</td><td>10905</td><td>hava basıncı pompası</td></tr><tr><td>Neubauer hücre sayma odası</td><td>Karl Hecht GmbH & Co KG</td><td>40442002</td><td>HUVEC'ler için mikroskobik sayma odası</td></tr><tr><td>Paraformaldehit %16 (PFA)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710-S</td><td>numunelerin çapraz bağlanması için</td></tr><tr><td>Perfüzyon Seti ibidi</td><td></td><td>10964</td><td>Perfüzyon Seti Sarı/Yeşil 1,6 mm boru çapına, 50 cm tüp uzunluğuna, toplam 13,6 mL çalışma hacmine, 2,8 mL ölü tüp hacmine ve 10 mL rezervuar boyutuna sahiptir. &mikro;-slayt L0.4Luer ile birlikte, 37 & derecede; C ve 0.0072 dyn x s/cm2 viskoziteye 3.8mL/dk ila 33.9 mL/dk akış hızı aralığı ve 3.5 dyn/cm2 ve 31.2 dyn/cm2 arasında kesme gerilimine ulaşılabilir. mikroakışkan</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td></td><td></td> için 50 cm <td>uzunluğunda, çözelti aşağıdaki kimyasallar kullanılarak hazırlandı: 0.2 g / L KCl, 1.44 g / L Na2HPO4, 0.24 g / L KH2PO4, pH 7.4</td></tr><tr><td>Plastik küvetler</td><td>Sarstedt</td><td>67,741</td> <td>(2 x optik) 600 nm'de OD ölçümü için</td></tr><tr><td>Pnömokok'a özgü antiserum</td><td>Pineda</td><td></td><td>, ısıyla inaktive edilmiş Streptococcus pneumoniae NCTC10319 ve D39 kullanılarak tavşanda yetiştirildi, proteinA-sefaroz kolonu kullanılarak IgG ile saflaştırıldı.</td></tr><tr><td>Polistiren veya strafor plaka</td><td></td><td></td><td>Bu, kanal slaytlarında ekilen hücreler üzerinde soğuk stresi önlemek için bir önlem adımıdır. Ambalaj kutusu-malzemesi gibi her türlü strafor kullanılabilir. Plaka 0,5 cm kalınlığında olabilir ve 20 cm2 boyutunda olmalıdır.</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6781.1</td><td>PBS tamponu için kullanılır</td></tr><tr><td>Pompa Kontrol Yazılımı (PumpControl v1.5.4)</td><td>ibidi</td><td>v1.5.4</td><td>Basınç pompasını kontrol etmek, akış koşullarını ayarlamak ve akışı başlatmak/sonlandırmak için bilgisayar yazılımı</td></tr><tr><td>Reaksiyon tüpleri 1.5/2.0 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706/ 72.695.500</td><td>antikor dilüsyonları için gereklidir</td></tr><tr><td>50 mL'lik reaksiyon tüpleri hacim</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,48,004</td><td></td></tr><tr><td>RFP eksprese eden pnömokoklar</td><td>Ulusal Tip Kültürleri Koleksiyonu, Halk Sağlığı İngiltere</td><td>10,319</td><td>Streptococcus pneumoniae serotip 47, genoma entegre edilmiş ahiston benzeri proteine kaynaşmış RFP'yi eksprese eder</td></tr><tr><td>Serolojik pipetler 5, 10 mL</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025/ 86.1254.025</td> daha <td>büyük hacimleri</td></tr> <tr><td>pipetlemek içinSodyum Karbonat (Na2CO<>3, susuz)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>451614-25G</td><td>100 mM Sodyum Karbonat tamponu hazırlanması için</td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2PO4)</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>P030.2</td>, <td>PBS tamponu için kullanılır</td></tr><tr><td>Spektral Fotometre Libra S22</td><td>Biochrom</td><td>80-2115-20</td><td>600 nm'de bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunun (OD) ölçümü</td></tr><tr><td>Blokaj tamponunun hazırlanması için</td><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>PFA fiksasyonundan sonra ökaryotik hücre geçirgenliği için dH20'da seyreltilmiş% 0.1 uç konsantrasyonda kullanılır</td></tr><tr><td>Maya özütü</td><td>oksoid</td><td>LP0021</td><td>bakteriler, %1 [a/a] maya özütü ile THB takviyesinde yetiştirilir = tam bakteri yetiştirme ortamı THY</td></tr></tbody></table>

sürekli akışta birincil İnsan endotel hücrelerinin pnömokok enfeksiyonu

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Streptococcus pneumoniae'nin endotel hücrelerinin yüzeyi ile etkileşimi Von Willebrand Factor (VWF) gibi mekanosiz proteinler aracılığıyla kan akışında aracılık edilir. Bu glikoprotein, kesme stresine yanıt olarak moleküler konformasyonunu değiştirir ve böylece geniş bir konak-ligand etkileşimi spektrumu için bağlayıcı bölgeleri açığa çıkarır. Genel olarak, tanımlanmış bir kesme akışı altında primer endotel hücrelerinin kültürlenme belirli hücresel farklılaşma ve bir kan damarının iç astar fizyolojisi andıran istikrarlı ve sıkıca bağlı endotel tabakasıoluşumunu teşvik bilinmektedir . Bu nedenle, bakteriyel patojenler ve mekanosensit proteinleri içeren konak vaskülatür arasındaki etkileşimlerin fonksiyonel analizi, yüzeyini etkilediği bilinen fizyolojik akış kuvvetlerini simüle eden pompa sistemlerinin kurulmasını gerektirir. vasküler hücreler.
Bu çalışmada kullanılan mikroakışkan cihaz, tanımlanmış akış hızına sahip sıvıların sürekli ve darbesiz dolaşımını sağlar. Bilgisayar kontrollü hava basıncı pompa sistemi sürekli, tek yönlü ve kontrollü bir ortam akışı oluşturarak endotel hücre yüzeylerine tanımlanmış bir kesme gerilimi uygular. Hücrelerin morfolojik değişimleri ve bakteriyel eki mikroskobik olarak izlenebilir ve mikroskobik görüntüleme için tasarlanmış özel kanal slaytları kullanılarak akışta ölçülebilir. Genel olarak bağışıklık etiketleme ve mikroskobik analizlerden önce örnek fiksasyon gerektiren statik hücre kültürü enfeksiyonunun aksine, mikroakışkan slaytlar hem proteinlerin, bakterilerin hem de hücresel bileşenlerin floresan tabanlı saptanmasını sağlar. örnek fiksasyondan sonra; seri immünofloresan boyama; ve gerçek zamanlı olarak doğrudan floresan tabanlı algılama. Floresan bakteriler ve spesifik floresan etiketli antikorlar ile birlikte, bu enfeksiyon prosedürü vasküler süreçler ile ilgili bilimsel uygulamaların büyük bir spektrum için verimli bir çoklu bileşenli görselleştirme sistemi sağlar.

Sürekli tek yönlü akış ta birincil HUVEC Culturing mechanosensitive VWF13ile dolu hücresel WPBs üretimi teşvik bir confluent ve sıkıca paketlenmiş hücre tabakasıoluşumunda sonuçlanır,14. Bu protokol, insan kan akışında makas stres durumunu taklit gerektiren enfeksiyon analizi için bir hava basıncı pompa tabanlı, darbesiz sirkülasyon sisteminin kullanımını açıklar.
Bu sistem, akış koşullarının tanımlanmış, yazılım kontrollü bir ayarını ...

Bu çalışmada, tanımlanmış akış koşullarında kesme stresi altında farklılaştırılmış insan primer endotel hücrelerinin yüzeyinde üretilen pnömokok komponent dizelerine bağlıpnozyağının mikroskobik takibi açıklanmaktadır. Bu protokol, diferansiyel immünboyama prosedürleri uygulanarak belirli hücre yapılarının ayrıntılı görselleştirilmesi ve bakterilerin sayısallaştırılması için genişletilebilir.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Bu endotel hücre kültür sisteminin kullanımı kan akışında durumun asimilasyon sağlar. Ve bu durumla, bakteriyel vektörlerin ve bu süreçte yer alan hücre vektörlerinin tanımlanması da dahil olmak üzere bakteriyel enfeksiyon süreçlerini analiz edebiliriz. Bu teknik, bakteriyel enfeksiyonların damar bütünlüğü üzerindeki etkisini keşfetmenin, morfogenez mekanizmaları üzerindeki etkisini de içeren, inflamasyon yanıtları ve bağışıklık regülasyonu üzerindeki etkisini keşfetmenin yolunu açmaktadır.Bu teknik endotel hücrelerinin bazı özel işleme gerektirir ve bu nedenle görsel bir açıklama sadece sözlü bir açıklama daha iyidir. Bu yöntem endotel hücre farklılaşması, yara iyileşmesi, tümör oluşumu ve anjiyogenez gibi perfüzyonvasküler sistemlerle ilişkili araştırmanın diğer çeşitli alanlarına ilişkin içgörüler sağlar. Önemli adımlardan biri standart hücre ekimi yanı sıra birincil endotel hücrelerinin doğru işleme olduğunu.Bu teknik, sadece sözlü açıklama ile açık olamazdı bazı özel hücre kültürü işleme gerektirir. Başlamak için, temiz bir tezgah kullanarak steril bir ortamda çalışmak. Bir sıcaklık dengelenmiş kanal slayt tek bir rezervuar içine% 2 steril filtredomuz jelatin PBS çözeltisi 100 mikrolitre enjekte etmek için bir pipet kullanın.Jelatin kaplı kanal slaytını ince bir polistiren veya strafor plakaüzerine yerleştirin ve bir mililitreLu şırınga ile slayt sıcaklığında bir düşüşü önleyin ve dört kat 10'luk mikrolitreyi mililitre başına beşte 10 ila 5'lik HUVEC süspansiyonu tohuma ekleyin ve HUVEC'i yetiştirin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 60 dakika HUVEC ile kanal slayt kuluçka. Bundan sonra, kanal slaytının her iki ucundaki her orta hazneyi 60 mikrolitre ECGMS ortamı ile doldurun.37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle bir saat daha kuluçkaya yat. Daha sonra, mikroakışkan pompayı ayarlamak için, önce dengedeki perfüzyon setini pompa ünitesine bağlayın, 13,6 mililitre ECGMS ortamı ile doldurun ve pompa kontrol yazılımını çalıştırın. Akışkan birim kurulumu nun menüsünde, pencereleri aşağı kaydırma'yı kullanarak yeterli perfüzyon kümesini ve oda slayt türünü seçin.Orta viskozite için yazılımda santimetre kare başına 0,007 dyne saniye seçin. Kuvöz dışında, hava basıncı tüpüne kurutma silika boncukları ile dolu bir cam şişe bağlayın. Yazılım menüsünde akış parametrelerini seçin, basıncı 40 milibar'a ayarlayın ve sürekli orta akışı başlatarak pompa tüplerini sıvı ortamla temizleyin.Biz subconfluently yetiştirilen HUVECs kullanarak sıkı bir hücre eki sağlamak ve ayrıca pompa sistemi için bağımsız güç kaynağı kullanarak yanı sıra sistem den hava kabarcıkları alma odaklanmak. Hava kabarcıklarını çıkarmak ve pompa sisteminde hava kabarcıklarının dolaşmadığından emin olmak için boru bağlantılarına dokunun. Kanal kaydırasını bağlamak için, pompa kontrol yazılımındaki akış sirkülasyonunu durdurun ve Luer bağlantısının yakınındaki tüpleri sıkıştırarak orta akışı ve perfüzyon borusunu tutun.Kanal slaytını bağlayarak hava kabarcıklarından kaçının. Pompa kontrol yazılımı gelişmiş sekmesinde, akış ekimi için istenen kesme stres döngüleri programlamak için yazılım aracı döngüsü oluşturucu kullanın. Akış dolaşımı için kesme gerilim düzeylerini programla ve uzun süreli perfüzyona başlayın.30 dakika boyunca dakikada 5,44 mililitrelik bir akış hızına karşılık gelen santimetre kare başına beş dyne ile başlayın ve ardından dakikada 10,85 mililitrelik bir akış hızına karşılık gelen santimetre kare 10 dyne kesme stresinde sürekli akış. Kontrol dengeli rezervuar pompalama. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir kuvöz bağlı kanal slayt ile akışkan birim yerleştirin.Mikroskop yazılım denetimini başlatın ve uygun filtre ayarlarını seçerek floresan mikroskobik izleme için ilke ayarlarını ayarlayın. Mikroskobik görüntüleme için, akışkan üniteyi 37 santigrat derecelik ısıtma odasına yerleştirin. Kanal slaytını önceden ısıtılmış bir mikroskobun sahnesine yerleştirin.Histamin ve bakterilerin akış dolaşımına enjekte edilmeden önce hücre morfolojisini ve HUVEC tabakasının bütünlüğünü kontrol edin. Akış ayarını koruyun. Perfüzyon tüpünde dolaşan ECGMS ortamına bir enjeksiyon portu aracılığıyla 100 milimolar histamin stok çözeltisinin 136 mikrolitresini enjekte ederek VWF'nin endotel canlı Palade cisimlerinden salınımını teşvik edin.Multimerized VWF dizelerin immünoresans tespiti için, 200 mikrolitre PBS hacminde 200 mikrolitre LIK BIR VWF özel FITC konjuge antikor 20 mikrogramı ECGMS ortamının 13.6 mililitrelik sirkülasyonuna enjekte edin. HUVEC hücre yüzeylerinde oluşturulan VWF dizeleri Pnömokok eki ölçmek için, enjeksiyon portu kullanarak ECGMS orta içine bir mililitre maksimum hacimde Pnömokok lar ifade mililitre RFP başına sekizinci CFU 1.35 kez 10 enjekte. Mikroskop büyütme için 63X yağ daldırma hedefi seçin ve mikroskop yazılımındaki floresan filtre ayarlarını Pnömokok'u ifade eden RFP algılama filtresi için 540 nanometre algılama filtresiyle RFP kanalına ayarlayın.VWF dizeleri bakteriyel eki nicelik için, her biri yaklaşık 10 morfolojik olarak bozulmamış HUVEC içeren en az 30 temsili alan görünümleri Z yığınları anlık oluşturmak ve Pnömokok miktarını saymak. İmmünfloresan boyama dan önce fiksasyon sonrası bakterie bağlılığı değerlendirmek için, akışı durdurun, pompa haznelerinden 10 mililitre ECGMS ortamını çıkarın ve %5 paraformaldehit ile birlikte 10 mililitre PBS ekleyin ve el yazmasına göre ilerleyin. Bu protokolde, deneysel basamaklar, hücre kültürü şişelerinde yer biraraya gelmesiiçin birincil endotel hücrelerinin önceden yetiştirilmesiyle başlar.Hücreler daha sonra jelatin kaplı kanal slayt içine tohumlu. Bakteriler agar plakaları üzerinde yetiştirilir ve ardından karmaşık bir sıvı ortamdan orta kütük fazına kadar ekim yapılır. Mikroakışkan hücre kültürü için, endotel hücreleri ile bir kanal slayt pompa sisteminin akışkan bir birimin perfüzyon tüpleri bağlı ve hücre farklılaşması için sürekli akış tabi.VWF dizeleri üretimi santimetre kare başına 10 dyne saniye lik bir kesme stresinde histamin enjeksiyonu ile indüklendi ve FITC etiketli VWF spesifik antikorlar kullanılarak immünororesans tespiti ile mikroskobik olarak izlendi. Bakterileri sirkülasyon ortamına ifade eden kırmızı floresan proteininin enjeksiyonundan sonra, VWF dizelerine pnömokok eki 450 nanometrede floresan emisyon ile gerçek zamanlı olarak mikroskobik olarak görüntülendi. PfA kullanarak hücrelerin fiksasyonu sonra, diferansiyel immünfloresans boyama belirli enfeksiyon zaman noktalarında bakteriyel eki görselleştirme sağlar.Bu işlemin en önemli adımı fizyolojik kesme stres düzeylerini ayarlayarak ve aşırı pompa basıncı dalgalanmaları kaçınarak slayt yüzeyinde sıkı bir hücre eki sağlamaktır. Mikroskobik görselleştirmeye ek olarak, bu teknik yeni anti-enfektifin farmakolojik etkilerini incelemek ve aynı zamanda vasküler enfeksiyon süreçlerinin uzun vadeli sonuçlarını analiz etmek için uygulanabilir. Bu pompa sistemi aerosoller yoluyla herhangi bir iletimi önlemek için hava basıncı ile bakteriyel patojenler perfuses.Biyogüvenlik önlemlerine uyulması tavsiye edilir.

pneumococcus-infection-primary-human-endothelial-cells-constant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Steril bir sürekli akış devresi, laminer akış kayma gerilmesi tabi yapışık hücrelere için bir yöntem tarif. Hücrelerin yapışma, morfoloji, şeffaf oda ile devre metaboliti analizi ve gelecek deneyler ya da kültür için kayma maruz kaldıktan sonra hasat hücreleri için alınan numuneler incelenmiştir olabilir.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Kaynak: Jagau, H. ve diğerleri. Sabit akışta birincil insan endotel hücrelerinin pnömokok enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, sabit ortam akış koşulları altında endotel hücreleri üzerindeki Von Willebrand Faktörü (VWF) dizilerine pnömokok bağlanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesini göstermektedir. VWF salınımını uyarmak, dizileri etiketlemek ve bakteri bağlanmasını ölçmek için adımları özetlemektedir.

Sabit Medya Akışı Altında Primer İnsan Endotel Hücrelerine Pnömokok Bağlanmasının Değerlendirilmesi

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Burada, pnömonektomiyi taklit etmek için tasarlanmış bir çip üzerinde organ (OOC) sistemi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, glikokaliks bozukluğu ile pnömonektomi sonrası komplikasyonlar arasındaki potansiyel ilişkiyi araştırır.

Pnömonektomi Sonrası Endotelyal Glikokaliksin 3D Akışkan Çipte Modellenmesi - Vasküler Tabanlı Çip Üzerinde Organ Sistemi Üretmeye Yönelik Bir Yaklaşım

Keşfedin pnömokok enfeksiyonunu sürekli akış koşullarında birincil insan endotel hücrelerinde. Bu yöntem, bakteri yapışmasını mikroskobik olarak görselleştirerek damar bütünlüğü ve immün yanıtlar üzerine bilgi sağlar.

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Daha fazla video keşfet