Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi
September 28th, 2019
Hücre dışı matriks ligandlar poliakrilamid hidrojeller üzerine uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı kolonilerde insan embriyonik kök hücrelerin kültürünü sağlamak için desenli olabilir. Bu yöntem, doku geometrisi, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler ve kader özellikleri arasındaki etkileşimi incelemek için çekiş kuvveti mikroskobu ve biyokimyasal tahlillerle kombine edilebilir.
Bu protokol, araştırmacıların hem hidrojel sertliği hem de kolonilerin geometrisi üzerinde tam kontrol esahip hidrojeller üzerinde kök hücre kolonileri kültür sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, araştırmacıların doku kültürü plastikten daha iyi fizyolojik ortamı taklit eden koşullarda kök hücre kolonilerini kültüre almalarına olanak sağlamasıdır. Bu protokolü ilk kez gerçekleştirirken, her malzemeden birkaç ekstra malzeme ürettiğinizi ve her adımda sorun giderebileceğinizve optimize edebilirsiniz diye floresan bir ligand kullandığınızdan emin olun.
Bu teknik, çeşitli malzemelerin hassas konumlandırma içeren birden çok adım içerir. Bu protokolün gerçekleştirildiğini gördükten sonra bu protokol için yazılı talimatları anlamak çok daha kolaydır. Bu yordamı başlatmak için PDMS tabanını PDMS kür leme maddesi ile 10'a 1 oranında ağırlıkla karıştırın ve iyice karıştırın.
Degas 30 ila 60 dakika veya tüm hava kabarcıkları kaldırılana kadar bir kurutucu bu karışımı. PdMS karışımını yavaş ve eşit bir şekilde hazırlanan gofretyüzeyine dökün. Gofret yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalışma yüzeyinde çanak dokunun.
PdMS'yi 70 derecede iki saat pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Daha sonra PDMS'yi her biri tek bir deneysel koşul için özellikler içeren yaklaşık 10 ila 10 milimetre kare şeklinde kesin. Bunlar, protokolün geri kalanı için pul olarak adlandırılır.
Bundan sonra, PDMS tabanını SEKIZe bir ağırlık oranında PDMS kürleme maddesi ile karıştırın ve iyice karıştırın. Karışımı 30 ila 60 dakika veya tüm hava kabarcıkları uzaklaştırılAna kadar kurutucuda degazlayın. Daha sonra, yavaş ve eşit temiz bir 100 milimetrelik çanak içine PDMS dökün.
Herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalışma yüzeyinde çanak dokunun. PdMS'yi 70 derecede iki saat pişirin ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Daha önce oluşturulan her damga için 15'e 15 milimetrelik PDMS karesi kesin.
Bunlar, protokolün geri kalanı için düz levhalar olarak anılacaktır. Oluşturulan her damgayı, standdaki özelliklerin düz bir PDMS levhasıyla temas etmesi için düz bir PDMS levhasına ters çevirin. Hatta temas sağlamak için pullu larla pulun üstüne hafifçe bastırın.
Daha sonra, her pul ve levha çiftinin üst arayüzüne UV-tedavi edilebilir polimer küçük bir damla yerleştirin. Polimer yerçekimi tarafından desteklenen yüzey gerilimi tarafından ikisi arasında kötü olacaktır. Pul ve levha arabiriminin kenarlarına UV-tedavi edilebilir polimer küçük bir damla yerleştirin.
Bu ligand çözüm tutacak bir kenarlık oluşturur. Sonra dikkatlice bir UV sterilizasyon kutusuna damga ve tokat çiftleri yerleştirin. Steril STR güç ayarını kullanın ve 10 dakika boyunca açığa çıkarın.
Bundan sonra, UV sterilizasyon kutusundan çiftleri çıkarın ve UV-tedavi edilebilir polimer oluşan düz levha ve şablon aşağı tutarken yavaşça damga kaldırmak için forseps iki çift kullanın. Forceps kullanarak, şablonu dikkatlice çıkarın ve PDMS'nin düz levhasıyla temas eden yüzeyin yukarı bakacak şekilde tersine çevirin. Ters kalıpları UV sterilizasyon kutusuna geri yerleştirin.
Steril STR güç ayarını kullanın ve üç dakika boyunca açığa çıkarın. Forceps kullanarak, dikkatle bir asit yıkanmış coverslip üzerine aşağı her şablon düz tarafı yerleştirilir özellikleri kapak kayma üzerinde ortalanmış olduğundan emin olun. Her şablonüstüne laboratuvar filmi küçük bir parça yerleştirin.
Şablon ve kapak arasında güçlü bir temas oluşturmak için şablonu sıkıca ve eşit bir şekilde bastırın. Bir tabak içinde şablonlar ile kapak fişleri yerleştirin. Bu yemeği bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve 30 saniye boyunca yüksek güçlü plazma uygulayın.
Sonra, her şablonun yüzeyine ligand çözeltisi pipet. 10 ila 10 milimetre kare puldan yapılan şablonlar için şablon başına 100 mikrolitre uygulayın. Bundan sonra, laboratuvar film kapak fişleri içeren çanak sarın ve bir gecede dört derece santigrat de kuluçka.
İlk olarak, kısa bir süre steril PBS içeren bir çanak batırmak için forceps kullanarak şablon ile coverslip yıkayın. Tekrar yıkamak için PBS ikinci aşamasına şablon ile coverslip batırın. Kapağın yüzeyindeki şablonu kapağı kırmamaya dikkat edin.
Daha sonra, pbs yıkama tuzları kaldırmak için ultra saf su içeren bir çanak içinde kısaca coverslip batırın. Fazla suyu uzaklaştırmak için kapak kaymasının kenarına hassas bir görev silme ye dokunun. Nitrojen gibi inert bir gaz Altında kapak kayma kuru.
Sonra, istenilen hidrojel elastikiyetini elde etmek için bir poliakrilamid çözeltisi hazırlayın. Her desenli coverslip için, bir glutaraldehit aktif alt hazırlamak üstüne yerleştirilen bir spacer ile dudak kapakları. Pipet arasında 75 ve 150 mikrolitre poliakrilamid çözeltisi her glutaraldehit merkezine aktif coverslip.
Forseps kullanarak, her glutaraldehit üzerine kayma kapsayacak şekilde desenli yerleştirin poliakrilamid ve spacer ile kayma poliakrilamid ve spacer ile kayma böylece desenli ligand poliakrilamid çözeltisi karşı karşıya. Dikkatle 15 mililitre konik alt tüpler ile uyumlu iplikleri ile bir kap tutucu içine her poliakrilamid sandviç yerleştirin. Yerinde poliakrilamid sandviç tutmak için her kap tutucu içine 15 mililitrekonik alt tüp vida.
Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 kez G kez salıncak kovatüpleri poliakrilamid sandviç santrifüj. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve tam polimerizasyon sağlamak için yönünü 50 dakika daha korumak için tüp raflara yerleştirin. Daha sonra sandviçleri tüplerden çıkarın ve PBS'ye batırın.
Laboratuvar filmi çanak sarın ve oda sıcaklığında üç saat veya dört derece santigrat gecede kuluçka. Bundan sonra, pbs batık kalır ise poliakrilamid sandviç ve kaymaları ve spacer kapsayacak şekilde desen dikkatlice kaldırmak için bir neşter ve forceps kullanın. Bir kapak tutucu içine desenli poliakrilamid ile her coverslip yerleştirin.
Contanın kapak fişinin üstüne ve spacer'In bulunduğu poliakrilamidin etrafına yer. Testereyle kesilmiş 15 milimetrelik konik alt tüpü kapak tutucuya vidalayın, alttaki desenli poliakrilamid ile bir kuyu oluşturarak. Bu montajlar kolay kullanım için standart 12 kuyu plakakuyularına sığar.
Bu tekniği yaparken, cam kapak yüzeyinde istenilen desenin oluşturulduğundan ve polimerizasyon sırasında poliakrilamid hidrojelin yüzeyine başarılı bir şekilde aktarıldığından emin olmak için floresan ligand kullanın. Bu yöntemiçin başarının nihai ölçüsü, desenli hidrojeller üzerinde istenilen geometrilerde hESC'leri kültüredebilme yeteneğidir. Metin protokolünde belirtildiği gibi kültürlü olduğunda, HESC'ler genellikle desenli geometrileri Y27632 medyadan tamamen kaldırıldıktan sonra 48 ila 72 saat boyunca tamamlamak için çoğalır.
Poliakrilamid hidrojellerde sınırlı geometrilerde hESC kolonilerinin kültüre edilmesi, çekiş kuvveti mikroskobu kullanılarak hücre tarafından oluşturulan çekiş kuvvetlerinin ölçülmelerine izin verir. Bu ölçümler floresan mikrosferlerin hidrojele yerlebir edilmesi ve bu boncukların fideleme den önce ve sonra konumlarının görüntülenmesi ile yapılır. Boncuk pozisyonlarının görüntüleri, daha sonra altta yatan çekiş gerilimlerini hesaplamak için kullanılabilecek boncuk yer değiştirmelerinin haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.
HESC'lerin dairesel kolonilerinde, en büyük çekiş gerilimleri kolonilerin çevre kenarına yakın bulunurken, kolonilerin merkezi düzgün bir şekilde düşük çekiş gerilimleri gösterir. Çekiş gerilimlerinin gözlenen tek düze olmayan dağılımlarına rağmen, bakım koşullarında desenli daireler olarak kültürlenen HESC'ler, pluripotency marker Oct 3/4 ve hücre yapışma molekülü E-kadherinin tek tip ekspresyonu gösterirler. Bu teknik, araştırmacıların insan embriyolarını insan embriyolarını daha iyi modellemelerine olanak sağlayacak ve sonuçta insanların nasıl geliştiğine dair önemli içgörülere yol açacaktır.
Bu prosedür, bir araştırmacının yumuşak hidrojeller üzerinde tanımlanmış geometriler deki hücreleri kültüre getirmeyi amaçladığı herhangi bir uygulamaya uyarlanabilir. Bu prosedür çoğu biyokimyasal asitle uyumludur ve araştırmacıların doku geometrisi ve hücre tarafından oluşturulan kuvvetler gibi şeylerin protein ekspresyonunu ve hücre sinyalini nasıl etkilediği hakkındaki soruları yanıtlamalarına olanak sağlar. Birçok araştırmacı şimdi erken insan gelişimini modellemek için insan embriyonik kök hücreleri kullanıyor.
Bu teknik, araştırmacıların fizyolojik ortamı daha iyi taklit eden koşullarda bu önemli soruları yanıtlamalarına olanak sağlayacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, araştırmacıların poliakrilamid hidrojeller üzerinde insan embriyonik kök hücre kolonilerini kültür etmesini sağlar, hidrojel sertliği ve koloni geometrisi üzerinde kontrol sağlar. Bu yöntem, geleneksel doku kültürü plastiklerinden daha iyi fizyolojik ortamları taklit eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Biyomalzemeler
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- Ekstrasellüler matris ligandları hidrojeller üzerinde desenlenebilir.
- Hidrojeller, hücre kültürü için esnek bir substrat sunar.
- Hücrelerin ürettiği güçleri anlamak doku mühendisliği için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, çekiş kuvvet mikroskobu ile birleştirilebilir.
Çalışmanın Amacı
- Kontrollü bir ortamda kök hücre kolonilerinin kültürünü sağlamak.
- Doku geometrisi ve hücre davranışı arasındaki ilişkiyi araştırmak.
- Kök hücre kader belirlemesi için koşulları optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- PDMS tabanının sertleştirici madde ile 10:1 oranında karıştırılması.
- Ekstrasellüler matris ligandlarının hidrojeller üzerinde desenlenmesi.
- Analizler için çekiş kuvvet mikroskobunun kullanılması.
- Hücre davranışı değerlendirmek için biyokimyasal testlerin yapılması.
Ana Sonuçlar
- Esnek substratlar üzerinde kök hücre kolonilerinin başarılı bir şekilde kültür edilmesi.
- Geometri ile ilgili hücrelerin ürettiği güçlerin daha iyi anlaşılması.
- Kök hücre kültür koşullarının optimize edilmesinin iyileştirilmesi.
- Hidrojellerin geleneksel kültür yöntemlerine göre avantajlarının gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu protokol, kök hücre araştırmaları için sağlam bir yöntem sunar.
- Fizyolojik koşulların daha iyi taklidini sağlar.
- Gelecekteki çalışmalar, bu teknik üzerine gelişmiş doku mühendisliği için inşa edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables precise control over stem cell colony geometry and substrate mechanics, providing a physiologically relevant system to study early human development. By decoupling biochemical and mechanical cues, it supports mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening workflows. The approach enhances predictive confidence in stem cell-based models used for drug discovery and developmental toxicology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how tissue-level mechanics influence stem cell fate specification and germ layer formation.
- Operational Value: Provides a tunable system to isolate mechanical variables in pathway interrogation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, geometry-controlled colonies for reproducible compound screening in developmental pathways.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined extracellular matrix patterning and hydrogel stiffness control.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of mechanotransduction in human development, informing disease-relevant models of morphogenesis.
- Operational Value: Enables traction force microscopy readouts as quantitative biomarkers of cellular mechanical state.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where geometric and mechanical control is needed to de-risk stem cell models prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how physical constraints regulate pluripotency and differentiation signaling.
- Screening: Delivers geometry-defined, mechanically characterized colonies for consistent compound response assessment.
- Analytics: Provides traction force mapping and fluorescence-based readouts to correlate mechanics with gene expression.
- Translational Research: Connects in vitro mechanical phenotypes to in vivo embryogenesis for improved model validity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying mechanosensitive targets across multiple developmental pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stem cell models by controlling confounding mechanical variables.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized ligand patterning and hydrogel fabrication.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing physiological relevance of early-stage assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on mechanical sensitivity in human-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, hydrogel preparation, and stem cell culture techniques.
- Depends on access to UV sterilization, plasma cleaning, and traction force microscopy equipment.
- Necessitates standardization across teams for consistent stencil fabrication and ligand patterning.
- Involves optimization steps for different extracellular matrix ligands and hydrogel stiffness ranges.
- Limited by the need for careful handling during polyacrylamide sandwich assembly to avoid delamination.
