Name: Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküreden Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, yetişkin fare beyninden bölgeye özgü mikroglia izolasyonunu ve derin tek hücreli RNA sıralama için kütüphane hazırlama yöntemini. Bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı beyinde mikroglial heterojenliği incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno ve Spyros Darmanis'e bu protokolün geliştirilmesi sırasında ki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford Paylaşılan FACS Tesisi, özellikle Meredith Weglarz ve Lisa Nichols teşekkür ederiz; Yen Tran, Michael Eckart Stanford Protein ve Nükleik Asit Tesisi (PAN) filme için büyük destek için. Bu çalışma JPB Vakfı ve Vincent J. Coates Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Kemirgenlerle ilgili tüm prosedürler, ulusal ve eyalet yasalarına ve politikalarına uygun olan Stanford Üniversitesi yönergelerine uygundur. Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi'nin Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Paneli tarafından onaylandı.
NOT: Tüm çözelti ve tampon kompozisyonları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.
1. Hücre İzolasyon Günü'ne Hazırlık
<ol><li>Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın ve buz üzerinde soğutun: orta A (50 mL), manyetik aktif hücre sıralama (MCS) tampon (30 mL), FACS tampon (25 mL), fosfat tamponlu salin (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) ve RNase inhibitörü (30 μL). NOT: Burada sağlanan hacimler tek bir fare beyin yarımkürenin 4 beyin bölgesinden (örn. korteks, beyincik, hipokampus ve striatum) mikrogliayı izole etmek için yeterlidir. Daha fazla doku kullanılırsa ölçeklendirin.</li>
	<li>Buz üzerine dört temiz 2 mL Damlahomogenizer yerleştirin ve her Dounce homogenizer içine 80 μL DNase (12.500 birim/mL) ve 5 μL RNase inhibitörü ile orta A'dan 2 mL ekleyin. 15 mL tüplerde pistonları soğutun.</li>
	<li>Doku toplama için beyin bölgeleri ile etiket dört 6 cm Petri yemekleri ve buz üzerinde her çanağı içine soğuk orta A 200 μL ekleyin. Diseksiyon için 6 cm Petri kabına yaklaşık 5 mL orta A ekleyin. NOT: Kullanmadan önce, tüm reaktiflerin steril ve RNA uygulamaları için uygun olduğundan emin olun. Tezgah ve diseksiyon aletlerinin temizlenmesi ve RNase dekontaminasyon çözeltisi(Tablo Malzemeler)ile püskürtülmesi gerekmektedir.</li>
</ol>2. Beyin Bölgesi Diseksiyonu
NOT: Bu adım ~ 30 dk almalıdır.
<ol><li>400−500 μL ketamin/ksilazin (24 mg/mL ketamin ve 2.4 mg/mL xylazine) bir çocuk tan yetişkin evre fareye (>1 aylık) periton enjekte edin. NOT: Bir erkek fare burada illüstrasyon için kullanılır, ancak her iki cinsiyet uygundur.</li>
	<li>5 dakika bekleyin ve geri çekme eksikliği sağlamak için bir arka pençe çimdik.</li>
	<li>Tampon görünür kan olmadan bitene kadar 20−30 mL buz gibi PBS ile transkardiyal perfüzyon yapmak için hemen 26 G x 3/8 iğne kullanın.</li>
	<li>Farenin kafasını bir çift cerrahi makasla ayırın. Kafatasının altında ortaya çıkarmak için deri açık kesmek için küçük makas kullanın, ve sonra sagittal sütür ile kesilmiş, lambdoidal sütür ve koronal sütür. Dokuya zarar vermeden parietal kemik ve interparietal kemiğin her iki tarafını da çıkarmak için forseps kullanın ve beyni orta A ile diseksiyon Petri kabına dikkatlice hareket ettirin.</li>
	<li>Beyni orta hattan iki yarımküreye kesmek için önceden soğutulmuş bir bıçak kullanın. NOT: Burada tek bir yarımküreden tanımlanan dört beyin bölgesi, tek hücreli veya toplu RNA-seq uygulamaları için yeterli sayıda mikroglia verir. Diğer hemisfer immünohistokimya veya RNA in situ doğrulama için kullanılabilir.</li>
	<li>Serebellum kortikal lob ve beyin sapı #55 forceps ile ayırın ve bir koleksiyon Petri çanak içine doku transferi.</li>
	<li>Dikkatle hipokampus ve korteksten striatum incelemek ve bir koleksiyon Petri çanak içine her doku transferi için #55 forceps kullanın.</li>
</ol>3. Mekanik Doku Dissociasyonu
NOT: Boyama adımları dışında hücreleri ve reaktifleri her zaman serin tutun. Bu adım ~ 30 dk almalıdır.
<ol><li>Her beyin dokusunu bir jiletle doğrayın <1 mm3 ince parçalar halinde.</li>
	<li>Doku parçalarını önceden soğutulmuş Dounce homogenizers'e aktarmak için 1 mL pipet (uçları kesilmiş) kullanın, her biri DNase ve RNase inhibitörüile 2 mL orta A içeren.</li>
	<li>Görünür parçalar bulununcaya kadar, pistonu Dounce homogenizer'ine yavaşça 6−10 tam vuruş için bükerek dokuyu homojenize edin. NOT: Douncing nöronlar ve diğer birçok glial hücreleri öldürür ama mikroglial hücreleri oldukça bozulmamış bırakın. Hem yetersiz hem de aşırı douncing hücrelerin düşük verim yol açabilir.</li>
	<li>Ayrık dokuları 70 m süzgeç aracılığıyla 50 mL tüplere aktarın.</li>
	<li>Her bir Homogenizer ve pistontoplam 6 mL soğuk orta A ile durulayın ve ilgili tüp içine aynı süzgeç ile durulama çözeltisi filtre.</li>
	<li>Tek hücreli süspansiyonları (her biri yaklaşık 8 mL) 15 mL konik tüplere ve santrifüjü 400 x g'de 4 °C'de fren = 5 ile aktarın.</li>
</ol>4. Myelin Kaldırma
NOT: Bu adım ~ 60 dk almalıdır.
<ol><li>1 büyük tükenme (LD) sütun (korteks için) ve 3 büyük seçim (LS) sütun (diğer 3 bölge için) bir manyetik ayırıcı(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Her sütunu 3 mL MCS arabelleğiyle durulayın.</li>
	<li>Santrifüj bittikten sonra, pipet dışarı ve pelet rahatsız etmeden supernatant atın. Korteks ve serebellum dokuları için, 850 μL MCS tamponundaki hücreleri 1.8 μL RNase inhibitörü ile yeniden askıya alın. Hipokampus ve striatum dokuları için, 0.9 μL RNase inhibitörü ile 400 μL MCS tampon hücreleri resuspend. NOT: Sütunlar (LD vs LS) ve resuspension için kullanılan hacim dokuda bulunan miyelin miktarına göre optimize edilmiştir. Diğer beyin bölgeleri taranırsa, bu koşulların dokunun büyüklüğüne ve miyelinin ne kadar var olabileceğine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Miyelin giderme etkinliği adım 4.9 olarak tahmin edilebilir.</li>
	<li>Korteks ve beyincik hücrelerine her 100 μL miyelin kaldırma boncukekleyin ve hipokampus ve striatum hücrelere her 50 μL miyelin kaldırma boncuk ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri boncuklarla hafifçe karıştırın ve tüpleri 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>McS tamponu ile kortikal hücrelere sahip tüpün hacmini 2 mL'ye, diğer tüm lerini 1 mL'ye getirin (kortikal hücreler için 1 mL ekleyin; hipokampal ve striatal hücreler için 500 μL; serebel hücrelerine tampon eklemenize gerek yok).</li>
	<li>Sütunlar durulama arabelleği boş aldıktan sonra, her sütunun altına 15 mL'lik bir tüp yerleştirin. Kortikal hücreleri (2 mL) LD sütununa ve diğer tüm hücreleri (her biri 1 mL) LS sütunlarına yükleyin. Orijinal tüpleri yıkamak ve çözümü ilgili kolonlarüzerine yüklemek için hemen 1 mL MCS tampon kullanın.</li>
	<li>LD sütunu 1 mL MCS tamponuyla bir kez yıkayın ve her LS sütunu her yıkamada 1 mL MCS tamponile iki kez yıkayın. Yıkama sırasında akış yoluyla çözelti toplamaya devam edin.</li>
	<li>Hücreleri 35 μm süzgeç kapağı ile yuvarlak alt FACS tüpleri halinde filtreleyin. NOT: Her tüp miyelin tükenmiş tek hücreli süspansiyon yaklaşık 4 mL toplamak gerekir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL %0,4 trypan mavi çözeltisi ile karıştırın. Verim, sağkalım oranı ve kalıntı miyelin düzeyini tahmin etmek için 10x parlak alan mikroskobu altındaki hücreleri inceleyin. NOT: Başarılı bir hazırlık üzerinde% 90 canlı hücreler (yuvarlak şeklinde ve mavi boya hariç) çok az ile hiçbir miyelin enkaz ile üretmelidir.</li>
	<li>FACS tüplerinde 400 x g'de 4 °C'de 5 dk, fren = 5 ile pelet hücreleri. Yavaş yavaş supernatant dökün ve doku kağıt üzerinde tüp kenarına dab. 300 μL FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın. NOT: MCS sıralama tercih edilirse, CD11b boncuk lar miyelin çıkarılmasından sonra mikroglia ve diğer miyeloid hücreleri seçmek için kullanılabilir. Bu hücreler daha sonra plaka tabanlı olmayan scRNA-seq yanı sıra toplu RNA-seq için kullanılabilir. Bu alternatif yaklaşımın uyarı CD11b boncuklar da bu antijen için olumlu diğer ilgili bağışıklık hücrelerinden microglia ayrı değildir.</li>
</ol>5. Floresan aktive Hücre Sıralama için Boyama
NOT: Bu adım ~ 40 dk almalıdır.
<ol><li>Her tüpe 5 μL fare Fc reseptörleri blok reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika kuluçka.</li>
	<li>Her tüpe 1 μL CD45-PE-Cy7 ve 1 μL CD11b-BV421 ekleyin. NOT: Diğer konjuge floropores ile antikorlar kullanılabilir. TMEM119 karşı antikorlar, homeostatik mikroglia için özel bir belirteç9, ayrıca dahil edilebilir, ancak CD45 ve CD11b ile birlikte kullanılması tavsiye edilir, Bazı mikroglia alt popülasyonları TMEM119 yüzey ekspresyonu kaybedebilir çünkü.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika çalkalayıcı üzerine tüplerle inkübedin.</li>
	<li>Yıkamak için 2 mL FACS arabelleği ekleyin.</li>
	<li>4 °C' de pelet hücreleri, 5 dk. 5 dk. 1 μL RNase inhibitörü ve 0.5 μL propidium iyodür (PI, 1:1.000 seyreltme) ile 400 μL FACS tamponu kullanarak her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.</li>
</ol>6. Dizin FACS Sıralama
NOT: Bu adım ~ 1 saat almalıdır.
<ol><li>Standart FACS prosedüründen sonra, dağılıma (enkaz hariç), tek hücrelere, canlı hücrelere (PI negatif), mikroglia ve miyeloid hücrelere (CD45+, CD11b+ )dayalı kapılar çizin. NOT: Tipik mikroglial hücreler, perivasküler ve meningeal makrofajlar gibi diğer sınırilişkili makrofajlar ile karşılaştırıldığında düşük seviyelerde CD45 ifade, ve bu nedenle CD45 düşük CD11b gating+ araştırmanın odak bu klasik mikroglia gen ekspresyon profilleri ise yeterli olmalıdır1,2. Ancak, mikroglia bazı alt kümeleri yüksek CD45 ekspresyonu olabilir ve bu özellikle geliştirme sırasında veya hastalık koşullarında doğrudur. Mikroglial gen ekspresyonunun tarafsız analizini sağlamak için, CD45 yüksek ve CD45 düşük immünfenotipleri indeks sıralama ayarı ve sıralama ve aşağı akım analizi için toplanan her iki popülasyon ile kaydedilebilir. Buna ek olarak, TMEM119 yüzey ekspresyonu homeostatik mikroglial popülasyonu hedeflemek için kullanılabilir (bkz. adım 5.2) ve CD45 düzeyleri ve sıralama sonuçları ile birlikte analiz edilir.</li>
	<li>Tek mikrogliayı (100 μm nozullu) 96 kuyulu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakalarına sıralayın, her kuyuda 4 μL lysis tamponu içeren (ayrıntılar için yayınlanan protokol14'e bakın). NOT: Harici RNA Kontrol Konsorsiyumu (ERCC) RNA çivili karışım(Malzeme Tablosu)kalite kontrol ve normalizasyon amacıyla lysis tamponuna 1:2.4 x 107 olarak eklenebilir2.</li>
	<li>Kısaca plakaları girdap ve bir tezgah üstü santrifüj kullanarak aşağı spin.</li>
	<li>Örnekleri hemen kuru buz üzerinde dondurun. Plakaları kütüphane hazırlığına kadar -80 °C'de saklayın. NOT: Alternatif olarak, daha fazla hücre toplu RNA-seq için RNA ekstraksiyon tampon ile 1,5 mL tüpler içine toplanabilir. Yazarların deneyimlerine göre, 3.000 hücreleri yayınlanan protokol2,14aşağıdaki kaliteli kütüphaneler oluşturmak için yeterlidir.</li>
</ol>7. Tek hücreli RNA-sıralama Kütüphane Hazırlama
NOT: Burada, yayınlanan protokol14 sıvı işleme robotik ve birkaç değişiklik yardımı ile scRNA-seq kütüphaneleri oluşturmak için takip edilir. Bu makalede, yordam yalnızca kısa bir süre açıklanmıştır ve farklar vurgulanır. 4 plakanın aynı anda işlenmesi yaklaşık 2,5 gün sürer.
<ol><li>Buz üzerinde plakaları eritin ve Oligo-dT30VN astar (lysis tampon) ile ters transkripsiyon gerçekleştirmek termal döngücüler ile cDNA oluşturmak için (Tablo 1): 42 °C 90 dk; 70 °C 5 dk; 4 °C tutun. Daha sonra pcr ana karışımını ve yerinde PCR (ISPCR) astarlarınıkullanarakcDNA'yı başında ek bir ekoneksikle sindirimi adımı(Tablo 2) ve aşağıdaki PCR durumu ile yükseltin: 37 °C 30 dk; 95 °C 3 dk; 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 dk 23 devir; 72 °C 5 dk.</li>
	<li>CDNA'yı kuyu başına 18 μL manyetik boncuk kullanarak arındırın (0.7:1 oranı). Plakayı manyetik bir standüzerinde 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve numuneleri her seferinde %80 etanol, 80°L'lik taze olarak yapılan iki kez yıkayın. Plaka15-20 dk kuruduktan sonra, kuyu başına 20 μL elüsyon tamponu ile cDNA'yı elüsi ile elüt. NOT: Kalite kontrol için, boyut dağılımlarını ve cDNA konsantrasyonlarını kontrol etmek için bir parça çözümleyici (yüksek duyarlılık yeni nesil [NGS] parça analizi, 1−6.000 bp) kullanın ve sadece 500−5.000 bp arasında ve 0.05 ng/μL'den daha yüksek yayma içeren daha ileri proses örnekleri kullanın.</li>
	<li>Kütüphaneoluşturmak için, her cDNA numunesinin 0,4 μL'sini kütüphane hazırlama kitinden(Malzeme Tablosu)1,2 μL Tn5 tagmentation reaktifleriyle 55 °C 10 dk.'lık bir nanolitre borulama makinesi yardımıyla 384 kuyuluk bir plakaya karıştırın. NOT: Burada, maliyeti azaltmak ve bu arada üretim hacmini artırmak için önerilen reaksiyon hacminin 1/12.5'i (5 μL numune ve 15 μL tagmentasyon reaktifleri) eklenir. Bir nanoliter pipetleme makinesi(Tablo Malzemeler)reaktifleri transfer etmek için kullanılır (bu ve aşağıdaki adımlar) ve 384-iyi plakalar.</li>
	<li>5 dakika boyunca RT'deki etiketleme reaksiyonunu durdurmak için 0,4 μL nötralizasyon tamponu ekleyin.</li>
	<li>384 indeks(Malzeme Tablosu, 0,4 l ileri ve 0,4 μL ters), 1,2 μL PCR karışımını numunelere ekleyin (her biri 2 μL) ve kütüphaneleri aşağıdaki koşulla yükseltin: 72 °C 3 dk; 95 °C 30 s; 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 dk 10 devir; 72 °C 5 dk.</li>
	<li>Havuz tüm bireysel kütüphaneler (1 μL her almak) aynı 384-iyi plaka birlikte, ve manyetik boncuklar kullanın(Tablo Malzemeler, 0.7:1 oranı) son havuzlu kütüphaneleri arındırmak için.</li>
	<li>Sıralamadan önce havuzlu kütüphanelerin boyut dağılımlarını incelemek için konsantrasyonları ve bir biyoanalizör(Malzeme Tablosu)ölçmek için bir florometre(Malzeme Tablosu)kullanın. Hücre başına 1 milyon ham okuma da sıralama derinliği hedefleyin.</li>
	<li>Sıralama okumalarını filtrelemek ve süslemek için standart biyoinformatik prosedürleri izleyin ve hizalama2'yigerçekleştirin. Seurat paketi15ile kümeleme analizi yapmak için giriş olarak sayım tablosu nu ve meta verileri kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Heterogeneity+of+Microglia+and+Brain+Myeloid+Cells+Revealed+by+Deep+Single-Cell+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing.</a> Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).</li>
<li>Keren-Shaul, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Microglia+Type+Associated+with+Restricting+Development+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Guerreiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+variants+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">TREM2 variants in Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).</li>
<li>Jonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+TREM2+associated+with+the+risk+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease.</a> New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA+Sequencing+of+Microglia+throughout+the+Mouse+Lifespan+and+in+the+Injured+Brain+Reveals+Complex+Cell-State+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).</li>
<li>Van Hove, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+mouse+brain+macrophages+reveals+unique+transcriptional+identities+shaped+by+ontogeny+and+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment.</a> Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).</li>
<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Technologies+and+Related+Computational+Data+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).</li>
<li>Svensson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+analysis+of+single-cell+RNA-sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments.</a> Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Single-Cell+RNA+Sequencing+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2018).</li>
<li>Haimon, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+microglia+expression+profiles+using+RiboTag+and+cell+isolation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies.</a> Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).</li>
<li>Collins, H. Y., Bohlen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Rodent+Microglia+to+Promote+a+Dynamic+Ramified+Morphology+in+Serum-free+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57122(2018).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Swartzlander, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+cell+type-specific+isolation+and+profiling+of+mouse+brains+in+inflammation+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109(2018).</li>
<li>Hennig, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Low-Cost+NGS+Library+Preparation+Using+a+Robust+Tn5+Purification+and+Tagmentation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol.</a> G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mikroglia aktif CNS diğer hücre tipleri ile etkileşim, ve çevresel uyaranlara çok duyarlıdır. İzolasyon işlemi sırasında gen ekspresyonundaki inflamatuar yanıtları ve anormal değişiklikleri en aza indirmek için, bu protokol daha önce yayınlanmış bir yöntem9'dandüzene sokulmuştur ve artık mikroglia'yı tek bir fare beyninin birçok bölgesinden paralel olarak izole etmek uygundur. Dokular ve reaktifler soğuk sıcaklıkta tutulur ve sınırlı doku boyutlarına göre daha az yıkama ve daha az reaktif ile zama...

Tüm sinir hücrelerinin %5−%10'unu temsil eden mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS)1'edağılmış yerleşik makrofajlardır. Kan-beyin bariyerinin arkasında korunan, sağlıklı bir yetişkin beyin tipik mikroglia hızla genişletmek ve parankim nöronlar ve diğer glial hücreleri ile etkileşime geri birçok ince süreçler içerir. Mikroglia da belirli gelişimaşamalarında veya yaralanma ve hastalık1bağışıklık sorunları üzerine artan fagositik fonksiyon ile ilişkili amipoid morfolojisi benimseyebilir 1,2,3,4. Son heyecan verici keşifler açıkça mikroglia beyin kaynaklı veya patolojik sinyaller için pasif seyirci olduğunu göstermiştir, ama beyin gelişimi ve homeostaz kontrolünde önemli roller oynamak, örneğin, nöronal sağkalım destekleyerek, budama olgunlaşmamış sinapslar, oligodendrocyte soy hücrelerinin farklılaşması teşvik yanı sıra anjiyogenez1. Mikroglia daha fonksiyonları açıklığa kavuştururken, heyecan daha fazla insan genetik çalışmaları ile körüklenir, hangi birçok nörodejeneratif hastalık risk genleri gösterdi, TREM2 gibi, ağırlıklı olarak veya sadece microglia tarafından ifade5,6,7. Geliştirme ve makul hastalık sürüş rolleri onların önemi göz önüne alındığında, muazzam çaba son zamanlarda nörodejeneratif hastalıklar için yeni terapötik hedefler bulma umuduyla mikroglial gen regülasyonu ve fonksiyonu anlayışımıza doğru konulmuştur1,8.
RNA dizilemesi (RNA-seq) hücre tipine özgü gen ekspresyonunun tarafsız karakterizasyonuna izin verir, bu da bilim adamlarına yoğun hücresel ağlardaki gen fonksiyonlarını araştırmaya rehberlik eder7. RNA-seq çoğunlukla toplu örnekler üzerinde yapılmış, diğer nöral ve bağışıklık hücrelerinden ayıran bir homeostatik mikroglial gen imzası keşfiyol açan9. Ancak, böyle bir yaklaşım mikroglia arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları göz ardı edebilir, özellikle de geçici olarak geliştirme mevcut, ya da yaşlanma ve hastalık ile ilişkili. Nitekim, tek hücreli RNA-seq (scRNA-seq) çeşitli bağlamlarda mikroglia daha önce az takdir heterojenlik ortaya çıkararak alanında devrim var duyarlılık ve çözünürlük sunuyor2,3,10. Buna ek olarak, CNS-dolaşım arayüzüdiğer benzer bağışıklık hücrelerinin varlığı nedeniyle, scRNA-seq çok az ön bilgi ile bu ilgili hücreleri ayırmak ve işlevsel olarak bu ilgili hücrelerin diseksiyon yeni araçların tasarımına yardımcı bilgi sağlar2,11.
ScRNA-seq platformları çeşitli bir dizi icat edilmiştir, her belirli uygulamalar için uygun12. Genel olarak, 10x Genomik gibi damlacık tabanlı yöntemler, her çalıştırmada dizili (on) binlerce hücre ile elde etme açısından daha yüksektir ve geniş kategorizasyon gerektiren karışık hücre popülasyonları içerebilecek girdi için daha az seçicidir. Plaka tabanlı yöntemler daha yüksek duyarlılık sağlamak ve derinliği13okumak,14, genellikle ince farklılıklar veya nadir transkript ortaya çıkarmak için hücre sıralama belirli popülasyonları hedefleme. Mikroglial hücrelerin küçük yüzdesi göz önüne alındığında, özellikle bu gelişme- veya hastalık la ilişkili alt popülasyonlar, tüm CNS hücre tipleri arasında, genellikle ilgi belirli bir bölgeden mikroglia izole etmek ve onların heterojenlik anlamak için derin ve tam uzunlukta transkripsiyonik bilgi elde etmek için arzu edilir.
Burada, yarı otomatik plaka tabanlı kütüphane hazırlama prosedürü nden sonra tek hücreli (veya toplu) RNA-seq için kullanılan tek bir yarımküreden parçalanmış farklı fare beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek için nasıl ayrıntıları sağlar. Diğer yarımküre daha sonra histolojik doğrulama için kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir yöntem9aerodinamik, Bu izolasyon protokolü başlangıç malzemelerin in verimi maksimize etmeyi amaçlamaktadır, ve bu arada endojen mikroglial gen ekspresyonu profilleri korumak. Mikrogliayı (veya diğer ilgili bağışıklık hücrelerini) 96 kuyuplakaya dönüştürmek ve üretim hacmini artırmak için kitaplık hazırlama için reaktif lerin hacimlerini minyatürleştirmek için floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Diğer plaka tabanlı stratejiler uygulansa da bu hassas scRNA-seq platformuna vurgu yapıyoruz. Bu yöntem, mikroglia'yı yaralanma veya hastalık odakları gibi diğer diseksiyon lu dokulardan izole etmek için kolayca uyarlanabilir ve farenin yaşı hemen hemen her doğum sonrası evreye kadar değişebilir. Tek hücreli transkripsiyon çalışmaları için bölgesel mikrogliaverimli izolasyon sağlık ve hastalık fonksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

<table><tbody><tr><td>5 M Betain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedisi# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP karışımı</td><td>Thermo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks' Dengeli Tuz</td><td>Çözeltisi Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat # 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Kedi # 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüp, Hücre Süzgeç Kapaklı</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI, Yüksek Hassasiyetli NGS Parça Analiz Kiti (1 bp &ndash; 6.000 bp)</td><td>Gelişmiş Analitik Kedi</td><td># DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Kedi # A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>Kedi # LS002007</td><td>Çalışma çözümü: 12500 birim / ml</td></tr><tr><td>DTT, Moleküler Sınıf</td><td>Promega</td><td>Kedi # P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Karışımı</td><td>Termo Fisher Bilimsel</td><td>Kedi # 4456740</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat # 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Dizin Kiti v2 Set A (96 indeks)</td><td>Illumina</td><td>Cat # FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Dizin Kiti v2 Set B (96 indeks)</td><td>Illumina</td><td>Cat # FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Dizin Kiti v2 Set C (96 indeks)</td> <td>Illumina</td><td>Cat # FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Dizin Kiti v2 Set D (96 indeks)</td><td>Illumina</td><td>Kedi # FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Eksonükleaz (5 U/&mu; l)</td> <td>New England BioLabs</td><td>Cat # M0262S</td><td></td></tr><tr><td>Fare Fc bloğu</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat # 553142</td><td></td></tr><tr><td>Miyelin çıkarma boncukları</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat # 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Örnek Hazırlama Kiti</td><td>Illumina</td><td>Cat # FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 Yüksek Çıkış Kiti v2.5 (150 Döngü)</td> <td>Illumina</td><td>Cat # 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># 70011044</td><td></td></tr><tr><td>PCRClean DX boncuklar</td><td>Aline Biosciences</td><td>Kedi # C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum İyodür</td><td>Termo Fisher Bilimsel Kedi</td><td># P3566</td><td>Boyama: 1:1000</td></tr><tr><td>Kübit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Termal Fisher Bilimsel Kedi</td><td># Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal anti fare / insan CD11b, Parlak Menekşe 421 (klon M1 / 70)</td><td>BioLegend</td><td>Kedi# 101236; RRID: AB_11203704</td><td>Boyama: 1:300</td></tr><tr><td>Sıçan monoklonal anti fare CD45, PE/Cy7 (klon 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat # 25-0451-82; RRID: AB_469625</td><td>Boyama: 1:300</td></tr><tr><td>Rekombinant RNaz İnhibitörü</td><td>Takara Bio</td><td>Cat # 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Ters Transkriptaz (100 U/&mu; l)</td> <td>Clontech</td><td>Cat # 639538</td><td>5x İlk iplikçik tamponu</td></tr> <tr><td>içeren <güçlü>Oligonükleotidler< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &mu; M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli ve diğerleri, 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN astar: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli ve diğerleri, 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" forribobazlar ve "+" bir LNA bazı içindir)</td><td></td><td></td> <td>(Picelli ve diğerleri, 2014)</td></tr><tr><td><güçlü > Çözeltiler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FACS tamponu</td><td></td><td></td><td>Tarif: steril filtreli %1 FBS, 2 mM EDTA, 1X PBS MCS tamponunda</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 25 mM HEPES <td>Tarif: steril filtreli %0,5 BSA, 1X PBS Medium'da</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 2 mM EDTA <td>A Tarifi: 15 mM HEPES, fenol içermeyen 1X HBSS'de %0.5 glikoz</td></tr><tr><td><kırmızıgüçlü > Plakalar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384 kuyulu Rigi-Plate PCR Mikroplakaları, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>Sert kabuklu 96 kuyulu PCR plakaları</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Others</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör, 2 ml</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td>357422</tr><tr><td>Büyük tükenme sütunu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Büyük seçim sütunu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Süzgeç (70 &mu; m)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Biyoanalizör</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Analyzer</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Sivrisinek HTS nanolitre pipetleme robotu</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

derin tek hücreli rna sıralamaiçin bir yetişkin fare beyin yarımküre'den bölgeye Özgü mikroglianın İzolasyon

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Merkezi sinir sisteminde yerleşik makrofajlar olarak, mikroglia aktif beyin gelişimi ve homeostaz kontrol, ve onların işlev bozuklukları insan hastalıkları sürücü olabilir. Homeostatik mikroglianın moleküler imzalarının yanı sıra çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda yapılan değişiklikleri ortaya çıkarmak için önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Tek hücreli genomik metodolojilerin gelişi ve olgunlaşmasıyla, heterojen mikroglianın farklı gelişimsel ve patolojik koşullarda oynadıkları çeşitli rollerin altında yattığı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bu tür heterojenliğin daha fazla diseksiyonu, mikroglianın belirli bir ilgi bölgesinden etkin bir şekilde izole edilmesi ve ardından tek tek hücrelerin hassas profilinin alınması yla elde edilebilir. Burada, tek bir yetişkin fare beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Ayrıca bu sıralanmış mikroglianın plaka bazlı derin tek hücreli RNA dizilimi için nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz. Bu yöntemin diğer senaryolara uyarlanabilirliğini tartışır ve büyük ölçekli çalışmalara uyum sağlayacak şekilde sistemin iyileştirilmesi için yönergeler sağlarız.

Bu protokol, bir yetişkin perfüzyon beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek ve sıralamak için bir yöntem açıklar, scRNA-seq takip. Biz tek hücreli süspansiyon oluşturmak için douncing kullanın ve aynı zamanda mikroglia zenginleştirmek için ilk adım olarak. Yetersiz veya aşırı douncing verimi azaltır. Buna ek olarak, yetişkin fare beyinleri miyelin yüksek düzeyde içerir, aynı zamanda düzgün kaldırılmazsa sıralama verimliliği ve verimazaltabilir. Bu nedenle, antikor boyama yapmadan önce miyelin ç...

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Bu yöntem, mikroglia gen ekspresyonunun tek hücreli düzeyde tarafsız bir şekilde yakalanmasını sağlar, bu da sağlıklı ve hastalıklı bir beyinde mikroglianın moleküler heterojenliğini açıklığa kavuşturmada yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir prosedür sağlar ve nasıl verimli derin sıralama için tek hücreli RA6 kütüphaneleri oyun tabanı oluşturmak için gösterir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli tüm arabellekleri ve çözümleri hazırlayın ve buz üzerinde soğutun.Ötenazi ve fare nin kafasını kestikten sonra, altındaki kafatası ortaya çıkarmak için baş deri açık kesmek için küçük makas kullanın. Sonra, sagittal sütür, lambdoidal sütür ve koronal sütür ile kesti. Dokuya zarar vermeden parietal kemik ve interparietal kemiğin her iki tarafını koparmak için forseps kullanın ve beyni dikkatlice orta A içeren bir diseksiyonu petri kabına taşıyın.Serebellum kortikal lob ve beyin sapı ayırmak için 55 numara forceps kullanın. Daha sonra, hipokampus ve korteksten striatum dikkatle incelemek ve ayrı bir koleksiyon Petri çanak içine her doku transferi için 55 numara forceps kullanın. İlk olarak, bir milimetreden daha az ince parçalar halinde her beyin bölgesi doğrayın için bir jilet kullanın.Ucu kesilmiş bir mililitrelik pipet kullanarak, önceden soğutulmuş Dounce homogenizers içine doku parçaları aktarın. Görünür bir parça bulunana kadar altı ila 10 tam vuruş için piston'u Dounce homogenizer'ine yavaşça bükerek dokuyu homojenize edin. Daha sonra, 70 mikrometre süzgeçler aracılığıyla 50 mililitre tüpler içine ayrıştırılmış dokular aktarın.Her dounce homogenizer ve piston soğuk orta A altı mililitre toplam durulayın sonra santrifüj için 15 mililitrelik bir tüp için durulama aktarın. Santrifüj tek hücreli süspansiyon 400 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için beş bir mola ile. Bir büyük tükenme sütunu ve üç büyük seçim sütununu üç mililitre MCS ile manyetik ayırıcıda durulayın.Doku örnekleri için santrifüj tamamlandığında, pipet dışarı ve pelet rahatsız etmeden supernatant atın. RNase inhibitörü içeren MCS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Korteks ve serebellum dan yeniden askıya alınan hücreleri içeren her tüp için miyelin kaldırma boncuk 100 mikrolitre ekleyin ve hipokampus ve striatum yeniden askıya hücreleri içeren tüplerin her birine miyelin kaldırma boncuk 50 mikrolitre ekleyin.Tüpleri 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, iki mililitre kadar hacmini getirmek için kortikal hücreleri içeren tüp mcs ekleyin ve kalan tüplere bir mililitre kadar kendi hacimleri her getirmek için. Sütunlar durulama arabelleği boş aldıktan sonra, iki mililitre kortikal hücreyi büyük tükenme sütununa ve bir mililitresini ayrı büyük seçim sütunlarına yükleyin.Ardından, büyük tükenme sütunundakileri bir mililitre MCS arabelleğiyle yıkayın ve her büyük seçim sütununu her yıkama için bir mililitre MCS tamponu kullanarak iki kez yıkayın. Hücreleri 35 mikrolitre süzgeç kapağından yuvarlak alt FACS tüplere süzün. Bu tüpleri 400 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca hücreyi peletlemek için santrifüj edin.Sonra, yavaş yavaş supernatant dökün ve kağıt mendil üzerinde tüp kenarına dab. 300 mikrolitre FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın. İlk olarak, her tüpe fare FC reseptörlerinin bloke reaktif beş mikrolitre ekleyin.Beş dakika buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, her tüpe bir mikrolitre CD45 PE boyutu yedi ve bir mikrolitre CD11B BV421 ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayıcıya yerleştirin.Bundan sonra, yıkamak için FACS tampon iki mililitre ekleyin. 400 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca hücreleri pelet santrifüj. Bir mikrolitre RNase inhibitörü ve 0,5 mikrolitre propidium iyodür içeren 400 mikrolitre FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.Standart FACS prosedürünü takiben, 100 mikrometre nozüllü tek canlı mikrogliayı, her kuyuda dört mikrolitre lysis tamponu içeren 96 kuyulu PCR plakalara sıralayın. Kısaca plakaları girdap ve bir tezgah üst santrifüj kullanarak aşağı spin. Plakaları kütüphane hazırlığına kadar eksi 80 derecede saklayın.Devam etmeye hazır olduğunuzda, buz üzerinde plaka eritin. CDNA oluşturmak ve metin protokolünde belirtildiği gibi ek bir ekeksikleazazsa sindirim adımı ile cDNA yükseltmek için ilk transkripsiyon gerçekleştirmek için bir termal döngückullanın. Bundan sonra, her kuyuya 18 mikrolitre manyetik boncuk ekleyerek cDNA'yı arındırın.Plakayı manyetik bir standda beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, supernatant çıkarın ve her yıkama için iyi başına etanol 80 mikrolitre kullanarak taze yapılmış% 80 etanol ile iki kez örnekleri yıkayın. Etiketleme gerçekleştirmek için, her cDNA numunesinin 0,4 mikrolitresini kütüphane hazırlama kitinden 1,2 mikrolitre Tn5 etiketleme reaktifiyle 10 dakika boyunca 55 derece lik bir plakaiçinde 384 kuyuluk bir plakayla karıştırmak için nanolitre lik bir pipetleme makinesi kullanın.Etiketleme reaksiyonunu durdurmak için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0,4 mikrolitre nötralizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, 384 indeks ve 1.2 mikrolitre PCR örneklere karıştırılır ve metin protokolünde belirtildiği gibi kitaplıkları yükseltin. Aynı 384 kuyulu plakadan tüm kütüphaneleri bir araya getirin ve son havuzlu kütüphaneleri arındırmak için manyetik boncuklar kullanın.Bu çalışmada, mikroglia korteks izole edilir, serebellum, hipokampus, ve yetişkin bir farebeyin hemisfer striatum. Hazırlanan hücre süspansiyonu antikor boyama yapmadan önce miyelin çıkarma verimi, hücre canlılığı ve etkinliğini tahmin etmek için trypan mavisi ve hemositometre kullanılarak mikroskop altında incelenir. Bu noktada toplam hücre sayısı korteks için 30,000 ve diğer dokular için 5.000'den fazla olmalıdır.Hücrelerin %90'Dan fazlası az miyelin enkazıyla birlikte yaşayabilir. Bir FACS makine genellikle CD45 düşük ve CD11B pozitif olan mikroglia sıralamak için kullanılır. Başarılı izolasyon tüm canlı tek hücrelerden en azından kortikal doku için% 80'den fazla mikroglia üretmelidir.Bireysel mikroglia lysis tamponuna yakalandıktan sonra, RNA serbest bırakılır ve daha sonra cDNA'ya aktarılır ve daha sonra 23 döngü boyunca yükseltilir. Bir kılcal elektroforez platformu olarak, parça analizörü ve yüksek duyarlı NGS parça kitleri boyut dağılımı hakkında hızlı ve doğru bilgi sağlar, yanı sıra 96-kuyu plaka her kuyuda bulunan cDNA moleküllerinin miktarı. 500 ile 5,000 baz çifti arasında bir yayma gösteren ve belirli bir konsantrasyon eşiğinin üzerinde olan örnekler kütüphaneler yapmak için kullanılabilir.Örnekler, tek hücreli RNA sıralama metodolojisinin algılama gücünü doygunlaştıran hücre başına bir milyondan fazla ham okuma derinliğine sıralanır. 2 üzerinden yaklaşık% 60 bir haritalama oranı ile, mikroglial hücre başına 000 genler tespit edilebilir. Bu izolasyon yönteminden elde edilen daha önce yayınlanmış veriler bağımsız deneylerden üretilir ve sıralı popülasyonda mikroglia spesifik genlerin saptanma hassasiyetini gösterir.Tek mikroglia transkripsiyonları bilgi ile, araştırmacılar kendi ilgi bağlamında benzersiz hücre popülasyonları keşfedebilir, ve daha fazla bu yeni tanımlanan popülasyonların işlevsel alaka çalışma.

isolation-region-specific-microglia-from-one-adult-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Video, yetişkin bir fare beyninin korteksinden mikroglia'yı izole etmek için bir tekniği göstermektedir. İlk olarak, korteks, mikroglia'yı koruyarak nöronları ve diğer glial hücreleri uzaklaştırmak için segmentasyon ve homojenizasyona uğrar. Bunu takiben, hücre süspansiyonu, anti-miyelin manyetik mikro boncuklara ve bir manyetik alana maruz bırakılır, bu da mikroglia ve miyeloid hücreleri miyelin kalıntılarından ve miyelin içeren hücrelerden etkili bir şekilde ayırır.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, fare üstün servikal ve yıldız gangliyonunun diseksiyonu, hücre ayrışması, kriyoprezervasyon, çekirdek izolasyonu ve hashtag barkodlaması dahil olmak üzere tek çekirdekli dizileme için ayrıntılı, düşük girişli numune hazırlığını açıklar.

Düşük Girişli Çekirdek İzolasyonu ve Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Fare Sempatik Ganglia'nın Barkodlu Antikorları ile Çoklama

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Fare Primer Mikroglia'sının Hayvan Demiyelinasyon Modellerinde Manyetik-Aktif Hücre Sıralama ile İzolasyonu

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.

Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu  

Mevcut protokol, yetişkin farelerden primer hipokampal mikroglianın nasıl izole edileceğini ve saflaştırılacağını, ardından bu akut olarak izole edilmiş hücreler üzerinde tam hücre yama kelepçesi kayıtlarının yürütülmesi için talimatları açıklar.

Yetişkin Farelerden Hipokampal Mikroglia'nın İzolasyonu ve Tam Hücre Yama-Kelepçe Kaydı

Bu protokol, erken doğum sonrası fare beyinlerinin beyinciklerindeki mikroglial hücre durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilimini birleştirir. Mikroglia heterojenliğini ortaya çıkarmak ve serebellar gelişim ve hastalıktaki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için enzimatik ayrışma, Percoll santrifüjleme ve immün boyama kullanır.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyin Gelişiminde Mikroglia Aktivasyonunu Karakterize Etmek için Akış Sitometrisi ve Tek Hücre Analizi

Öğrenin, yetişkin fare beyninden bölgeye özgü mikroglia izolasyonunu ve derin tek hücreli RNA sıralama için kütüphane hazırlama yöntemini. Bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı beyinde mikroglial heterojenliği incelemeye olanak tanır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Daha fazla video keşfet