Name: Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Keşfedin, sıçanlarda çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için doku mühendisliği greft yöntemini. İki katmanlı hibrit iskele ve mikrovasküler anastomoz tekniğiyle tükürük sızıntısını minimize ederek özofagus dokusunun rejenerasyonunu destekleyen bu protokol, cerrahi sonuçları iyileştirmeye yönelik umut vadeden bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi tarafından desteklenmiştir, Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen, Kore Cumhuriyeti (hibe numarası: HI16C0362) ve Temel Bilim Araştırma Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) programı (2017R1C1B2011132). Bu çalışmada kullanılan biyoörnekler ve veriler Kore Biobank Network üyesi Olan Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi Biyobankası tarafından sağlanmıştır.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC No. 17-0164-S1A0) tarafından onaylanmıştır.
1. İskele İmalatı
NOT: İki katmanlı özofagus iskeleleri elektrospinning ve 3D baskı birleştirilerek üretilmektedir. Boru iskelesinin iç zarı elektrospinning poliüretan (PU) ile üretilen ve dönen paslanmaz çelik mandreller ile9.
<ol><li>Tübüler PU nanofiberlerin hazırlanması için, oda sıcaklığında 8 saat boyunca N,N-dimethylformamide (DMF) karıştırılarak PU polimerin %20 (w/v) çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Pu çözeltisini künt metal iğne (22 G) ile şırınganın üzerine yerleştirin ve dönen paslanmaz çelik mandrellere (çap = 2 mm) iğne ucu ile dönen kolektör arasında 30 cm mesafede elektrospin yerleştirin. NOT: Güç kaynağı 15 kV potansiyelyüksek voltajlı doğru akıma ayarlanır. Çözeltinin besleme hızı şırınga pompası kullanılarak 0,5 mL/h olarak sabitlenir.</li>
	<li>Mandrel'in yüzeyinde 3,14 m/s'de dönen boruhalinde bir nanofiber tabaka yapın.</li>
	<li>Artık çözücünün tamamen temizlenmesi için PU nanofiber'i bir gecede 40 °C'de bir vakum fırınında kurutun. NOT: Özofagus iskelesinin 3Boyutlu baskılı dış duvarı hızlı bir prototipleme sistemi kullanılarak hazırlanır. 3D baskı ekipmanı bir dağıtıcı, meme, sıkıştırma/ısı denetleyicisi, 3 eksenli dönüştürme aşaması ve yazılım sisteminden oluşur.</li>
	<li>PCL peletler 100 °C'de ısıtma silindirinde çözülür ve biyoplotting sisteminin kontrolü altında yüksek basınçta (7 bar) nanofiberlerin yüzeyine basılır. Nozul boyutu 300 μm ve iplikçik mesafesi 700 μm'dir.</li>
	<li>Mandrel iki katmanlı iskele çıkardıktan sonra, ultraviyole ışık altında% 70 etanol ıslatarak sterilize. NOT: Daha önceki çalışmalarda iskelenin daha ayrıntılı özellikleri bildirilmiştir10.</li>
</ol>2. Greftlerde Hücre Tohumlama ve Biyoreaktör Yetiştiriciliği
NOT: Bir şirketten satın alınan insan yağtürtül mezenkimal kök hücreleri (hMSCs) değişiklik yapılmadan kullanılmıştır.
<ol><li>Hücre naklinden önce, 3D baskılı yemek borusunu ultraviyole ışık altında 1 saat sterilize edin, 10 dakika etanolile ıslayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kat yıkayın.</li>
	<li>Kültür ve büyüme orta (bazal orta / büyüme takviyesi) hMSCs genişletmek. İki katmanlı borulu iskeleler nonadherent 24 kuyu doku kültür plakaları transfer edildi.</li>
	<li>Hücreleri iskelenin iç yüzeyine takmak için hMSC süspansiyonu büyüme ortamını içeren bazal membran matrisinde 1 x 106 hücre/mL yoğunlukta hafifçe ekleyin.</li>
	<li>İki katmanlı borulu iskelenin iç yüzeyine aynı şekilde bodrum membran matris süspansiyonuna birikintisi yatırın.</li>
	<li>HMSC tohumlu boru iskelesini, pulsatil akış biyoreaktör sistemi kullanarak biyoreaktörün kültür odasındaki akrilik tutucuya sıkıca sabitle. NOT: Özel olarak tasarlanmış biyoreaktör sistemi bir pompa, kabarcık kapanı, akış odası, basınç göstergesi, kontrol edilebilir vana ve orta rezervuaroluşur. Kültür odasında kesme stresi uygularken, 1-2 dk11dinlenme süresi sağlar.</li>
	<li>Kültür odasına büyüme ortamı ekleyin ve %5 CO210içeren nemli bir atmosfer altında 0,1 dyne/cm2 akışa bağlı kesme gerilimi uygulayın. NOT: Akışa bağlı kesme stresinin değeri, insan vücudundan elde edilen özofagus dokusunun peristalsisinin simüle edilerek hesaplanmıştır10.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre live/DEAD Canlılık Teşp kiti kullanarak 5 gün sonra biyoreaktör ekimi yapılmadan iki katmanlı borulu iskelelerin iç yüzeylerinde hücre yanıtlarını belirleyin. Z-stack aracını kullanarak konfokal mikroskopi ile görüntü alın.</li>
	<li>Üçüncü gün, taramalı elektron mikroskobu (SEM) aracılığıyla hMSC tohumlu boru iskelesinin yüzey morfolojisini gözlemleyin.<ol>
<li>24 saat için %2,5 glutaraldehit ve OsO4 ile hMSC ile kuluçkaya yatan iskeleyi düzeltin ve etanol ile susuz kalın.</li>
		<li>Argon atmosferik koşullarda bir sputter coater kullanarak platin ile sabit hMSCs kat ve 25 kV hızlanan voltajda SEM görüntüleri elde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Hayvan Cerrahisi için Cerrahi Hazırlık
NOT: Hem gastrostomi hem de özofagus transplantasyonu ndan önce cerrahi preparatlar uygulanır.
<ol><li>Steril cerrahi aletleri kurun: Neşter bıçak, Weitlaner retraktör, mikroiğne tutucu, mikrosutür forceps, mikrodoku forceps, mikrosisör, Mayo-Hegar iğne tutucu, çalışma makas, iris makas, pansuman, doku forceps, kıymık forceps, iris forceps, 5 mL şırınga (21 G iğne), 10 mL şırınga (22 G iğne), 9-0 poliamid sütür, 4-0 poliglactin sütür.</li>
	<li>Kiremit/zolazepam (50 mg/g doz) ve %2 ksilazin hidroklorür (2 mg/kg doz) intramüsküler enjeksiyonu ile hayvanı anestezi edin. NOT: Özofagus naklinde 398-420 g ağırlığında erişkin Sprague-Dawley (SD) sıçanlar kullanıldı.</li>
	<li>Cerrahi örtüye geçmeden önce, kuyruk larını çengelle çimdikleyerek hayvanın uygun anestezik durumunu kontrol edin.</li>
	<li>Hayvanı steril örtüye bir supine pozisyonda yerleştirin ve kılları boyundan (özofagus ekimi için) veya karından (gastrostomi için) çıkarmak için makas kullanın. Sonra betadine ve% 70 etanol ile cerrahi site ovmak.</li>
	<li>Kesiden önce, ağrı kesici için buprenorfin (0.05-0.1 mg/kg) gibi bir analjezik deri altı enjekte edin.</li>
</ol>4. Gastrostomi Cerrahisi Sıçanlarda T-tüp kullanma
NOT: Tüm deneysel hayvanlarda geçici bypass nonoral tüp beslemesi için modifiye gastrostomi yapıldı (n = 5).
<ol><li>Ameliyattan bir gün önce fareleri oruçlun. Bölüm 3'te olduğu gibi ameliyat hazırlayın.</li>
	<li>Anestezi li sıçanların deri ve karın kaslarının orta hat kesisi ile mide maruz.</li>
	<li>Bir neşter bıçak ile ön mide duvarında 3 mm delik oluşturun.</li>
	<li>Silikon T-tüpünün ucunu defekt bölgesine takın ve mide duvarına sabitle.</li>
	<li>T-tüpün mide duvarından ayrılmasın diye düzgün bir şekilde dikiş atın.</li>
	<li>İmplante edilen T-tüpün distal ucunu subkutan tünelden boynun arkasına doğru götürün.</li>
	<li>Mide içeriğinin geriye doğru akmasını önlemek için heparin kapağını T-tüpün ucuna takın. NOT: T-tüpün ucunu heparin kapağına bağlamak için anjiyokateter kullanın.</li>
	<li>4-0 poliglactin sütür kullanarak karın duvarı ve cilt tüm katmanları dikiş.</li>
	<li>Gastrostomi tamamlandıktan sonra tüm deneysel sıçanları metabolik bir kafeste ayrı tutun.</li>
</ol>5. Özofagus Transplantasyonu
NOT: İki katmanlı boru lu iskelenin özofagus nakli gastrostomiden 1 hafta sonra yapılır (n = 5). Transplantasyondan önce, hMSC'leri (hücre yoğunluğu: bazal membran matrisinde 1 x 106 hücre/mL) her iskelenin iç duvarına aşılayın ve biyoreaktör sisteminde 3 gün kuluçkaya yatırın. Cerrahi işlem aşağıdaki gibidir.
<ol><li>Model hayvanların boyun kıllarını çıkarın ve aseptik cerrahi için cerrahi alanın standart draping yapmak. NOT: Hayvan üzerinde şüpheci cerrahi korumak için büyük bir tıraş alanı oluşturmak önerilir.</li>
	<li>Boynun anterior median insizyonu sonra, kayış kasları ayırmak ve trakeoözofageal yapısını ortaya çıkarmak.</li>
	<li>Segmenti kesmeden önce ağız dan vagus sinirini kesip, aksi takdirde hayvanın solunumtehlikeye.</li>
	<li>Büyütme altında, trakea yemek borusunun sol tarafı izole ve dikkatle tiroid bezinden üst kısmını ayırın.</li>
	<li>Cerrahi makas kullanarak yemek borusunun tüm katmanlarını içeren 5 mm uzunluğunda tam çevresel defekt oluşturun. NOT: Özofagus naklinden önce, hazırlanan iskeleleri, nakil bölgesinin uzunluğuna uyacak şekilde cerrahi makas kullanarak kesin.</li>
	<li>Mikroskop altında, 9-0 dikiş ipliği kullanarak distal özofagus defektinin her iki ucunda mikroanastomoz yapın. Üst özofagus kalıntısı ve iskelesağ inferoposterior marjı arasında ilk sütür yerleştirin. Üst özofagus kalıntısı ile iskele arasında sağdan sola doğru dikiş atmaya devam edin. Alt yemek borusu kalıntısının üst kenar boşluğu yla aynı şekilde iskeleyi anastomozlayın. NOT: Özofagus transplantasyonu için klinik cerrahide kullanılan mikrovasküler anastomoz u yapın. İmplant bölgesinin hassas ve su geçirmez dikişleri için bir mikroskopla çalışın.</li>
	<li>Daha sonra, greftler için istikrarlı bakım ve vasküler kaynağı sağlamak için nakledilen site üzerinde çevreleyen tiroid bezi flebi yatıyordu.</li>
	<li>Transplantasyondan sonra deri altı kas ve deri dokusunu 4-0 vicryl sütür ile dikin.</li>
	<li>Tüm deneysel sıçanları tek tek metabolik kafeslerde tutun.</li>
</ol>6. Ameliyat sonrası prosedürler
NOT: Postoperatif işlemler hem gastrostomi hem de özofagus transplantasyonu sonrası yapılır.
<ol><li>Karın yarası kapatıldıktan sonra, bireysel metabolik kafesler içine sıçan koymak ve hipotermi önlemek için kızılötesi ısınma cihazları üzerine kafesler yerleştirin.</li>
	<li>Onlar elde edene kadar hayvanları izlemek ve sternal recumbency korumak (yani, göğüs üzerinde dik yatarken).</li>
	<li>Cerrahi bölgede iltihabı en aza indirmek için, antibiyotik gentamisin (20 mg / kg) sıçanlara günlük uygulayın.</li>
	<li>Çalışmanın bitiş noktasına kadar üçüncü postoperatif günde oral sıvı beslemeye başlayın. Tüm beslenme formülünü (20.6 g/100 ml [g%] karbonhidrat, %3.8 protein, %0.2 gr yağ) ameliyattan sonra güne başlayan heparin kapağı ile günde 3kat tedarik edin.</li>
	<li>Hayvanların görünümünü ve vücut ağırlığını her gün kontrol edin. Kendine zarar veren kesi bölgesi veya tüp alımına karşı direnç gibi davranışların yanı sıra çeşitli cerrahi komplikasyonları yönetin. Sıçan modellerinin vücut ağırlığı hızla azaldığında 20% veya daha fazla, CO2 inhalasyon ile ötenazi gerçekleştirin.</li>
</ol>7. Histoloji ve immünohistokimya
NOT: Histolojik analiz için ötanazi yapılan hayvanların özofagus dokusunun tamamı cerrahi makas kullanılarak elde edilir. Hematoksilin ve eozin boyama ve Masson'un trikrom boyama sı standart histolojik teknikler kullanılarak yapıldı. İmmünohistokimya aşağıdaki protokole göre yapıldı.
<ol><li>Nakledilen bölgeleri içeren tüm yemek borusunu %4 paraformaldehitle düzeltin. Bir parafin bloğu oluşturun ve 4 μm kalınlığında kesin.</li>
	<li>Doku bölümlerini deparafinize ve bir etanol serisi onları dehydrate. Sitrat tampon ve mikrodalga 10 dakika boyunca ısı doku slaytlar batırın. Hücreleri 20 dk soğuk PBS ile soğutun. 6 dk için %3 hidrojen peroksit batırın ve 10 dk PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Doku bölümlerinin nonspesifik reaksiyonlarını engellemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca %3 büyükbaş serum albumin (BSA) inkübül.</li>
	<li>5 dk. Desmin (1:200'e seyreltilmiş), keratin 13 (1:100'e seyreltilmiş) ve von Willebrand Factor (vWF; 1:100'e seyreltilmiş) 4 °C'de bir gecede primer antikorlarla 3 kat Yıkayın.</li>
	<li>15 dakika PBS ile 3x yıkayın. Oda sıcaklığında Desmin ve Keratin 13 için 1:500 konsantrasyonda uygun ikincil antikor ile incubate. Daha sonra slaytları PBS ile iki kez 10 dakika yıkayın. NOT: vWF için doku bölümleri horseradish peroksidaz konjuge kit kullanılarak inkübe edildi (Malzeme Tablosunabakınız) ve daha sonra 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kullanılarak görselleştirildi.</li>
	<li>Montaj ortamı içeren bir cam kapak ve 4',6-diamidino-2-fenolindole (DAPI) kullanarak monte.</li>
</ol>

<ol><li>Irino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+outcomes+after+replacement+of+the+esophagus+with+gastric%2C+colonic%2C+or+jejunal+conduits%3A+a+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+the+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review.</a> Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).</li>
<li>Flanagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagectomy+and+Gastric+Pull-through+Procedures%3A+Surgical+Techniques%2C+Imaging+Features%2C+and+Potential+Complications%5BTitle%5D)+AND+%22Radiographics%22%5BJournal%5D)">Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications.</a> Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).</li>
<li>Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+outcomes+of+different+approaches+to+esophageal+replacement+in+long-gap+esophageal+atresia%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine.+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review.</a> Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942(2017).</li>
<li>Luc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+and+matured+esophageal+scaffold+for+circumferential+esophagus+replacement%3A+Proof+of+concept+in+a+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model.</a> Biomaterials. 175, 1-18 (2018).</li>
<li>Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+oesophageal+muscle+layer+from+oesophagus+acellular+matrix+scaffold+using+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).</li>
<li>La Francesca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+regeneration+and+remodeling+of+the+pig+esophagus+after+circumferential+resection+using+a+retrievable+synthetic+scaffold+carrying+autologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4123(2018).</li>
<li>Ponten, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+severe+mediastinal+bleeding+after+esophagectomy%3A+a+potentially+lethal+complication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).</li>
<li>Catry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+Esophageal+Replacement+by+a+Tissue-engineered+Substitute+Using+Mesenchymal+Stem+Cells%3A+An+Experimental+Study+in+Mini+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs.</a> Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).</li>
<li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+preparation+of+bio-tubular+scaffolds+for+fabricating+artificial+vascular+grafts+by+combining+electrospinning+and+a+3D+printing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).</li>
<li>Kim, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Esophagus+via+Bioreactor+Cultivation+for+Circumferential+Esophageal+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinational+effects+of+mechanical+forces+and+substrate+surface+characteristics+on+esophageal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+A%22%5BJournal%5D)">Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyurethane+scaffolds+seeded+with+autologous+cells+can+regenerate+long+esophageal+gaps%3A+An+esophageal+atresia+treatment+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).</li>
<li>Nakase, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathoracic+esophageal+replacement+by+in+situ+tissue-engineered+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).</li>
<li>Kwiatek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+esophagus+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis.</a> Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).</li>
<li>Anjum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocomposite+nanofiber+matrices+to+support+ECM+remodeling+by+human+dermal+progenitors+and+enhanced+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10291(2017).</li>
<li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCL+and+PCL-gelatin+nanofibers+as+esophageal+tissue+scaffolds%3A+optimization%2C+characterization+and+cell-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).</li>
</ol>

Bu çalışma için tasarlanan biyoreaktör sistemi ticarileştirilmiştir (model numarası: ACBF-100).

Yapay özofaji üzerinde mevcut hayvan çalışmaları hala çeşitli kritik faktörler ile sınırlıdır. İdeal yapay özofagus iskelesi biyouyumlu olmalı ve mükemmel fiziksel özelliklere sahip olmalıdır. Anastomoz sızıntısını önlemek için erken postoperatif dönemde mukozal epiteli yenileyebilmeli. İç dairesel ve dış boylamsal kas tabakalarının yenilenmesi de fonksiyonel peristalsis için önemlidir12,13.
Yemek borusunun mekanik özellikleri önemlidi...

Konjenital malformasyonlar ve özofagus karsinomları gibi özofagus bozukluklarının tedavisi özofagusun yapısal segment kaybına yol açabilir. Çoğu durumda, gastrik pull-up kanalları veya kolon interpozisyonları gibi otolog replasman greftleri1,2yapılmıştır. Ancak bu özofagus replasmanlarının çeşitli cerrahi komplikasyonları ve reoperasyon risklerivardır 3. Böylece, doku mühendislik özofagus iskeleleri yerli özofagus taklit kullanımı sonuçta kayıp dokuların yenilenmesi için umut verici bir alternatif strateji olabilir4,5,6.
Doku ile tasarlanmış bir özofagus, özofagus defektlerinin mevcut tedavilerine potansiyel olarak bir alternatif sunsa da, in vivo uygulaması için önemli engeller vardır. Postoperatif anastomoz kaçağı ve implante özofagus iskelesi nekroz kaçınılmaz mediasten 7 gibi çevreleyen aseptik alan, ölümcül bir enfeksiyona yol . Bu nedenle yara ve nazogastrik tüpte gıda veya tükürük kontaminasyonunu önlemek son derece önemlidir. Primer yara iyileşmesi tamamlanana kadar gastrostomi veya intravenöz beslenme düşünülmelidir. Büyük hayvanlar iskele8implantasyonundan sonra 2-4 hafta boyunca sadece intravenöz hiperalimentasyon ile beslenebilir, çünkü bugüne kadar, özofagus doku mühendisliği büyük hayvan modellerinde yapılmıştır . Ancak küçük hayvanlarda özofagus nakli sonrası erken sağkalım için böyle bir oral olmayan beslenme modeli oluşturulmamıştır. Bunun nedeni hayvanların son derece aktif ve kontrol edilemeyen olmalarıdır, bu yüzden beslenme tüpünü uzun süre midelerinde tutamamışlardır. Bu nedenle küçük hayvanlarda az sayıda özofagus nakli vakası olmuştur.
Özofagus doku mühendisliği koşulları göz önüne alındığında, elektrospun nanofibers (iç tabaka; Şekil 1A) ve 3B baskılı iplikçik (dış tabaka; Şekil 1B) modifiye gastrostomi tekniği ni de içeren. Dahili nanofiber PU yapılır, bir un-gradable polimer, ve gıda ve tükürük sızıntısı nı önler. Dış 3D baskılı iplikçikler biyobozunur polikaprolakondan yapılmıştır (PCL), mekanik esneklik sağlayabilir ve peristaltik harekete uyum. İnsan yağtüretilmiş mezenkimal kök hücreler (hAD-MSCs) yeniden epitelizasyonu teşvik etmek için iskelenin iç tabakasında tohumlandı. Nanofiber yapısı hücre göçü için yapısal bir hücre dışı matriks (ECM) ortamı sağlayarak ilk mukozal rejenerasyonu kolaylaştırabilir.
Ayrıca biyoreaktör ekimi yoluyla aşılanmış hücrelerin sağkalım oranını ve biyoaktivitesini artırdık. İmplante edilen iskele, özofagus mukozası ve kas tabakasının daha istikrarlı bir şekilde yenilenmesini sağlamak için tiroid bezi flebi ile kaplandı. Bu raporda, iskele imalatı, mezenkimal kök hücre bazlı biyoreaktör ekimi, modifiye gastrostomi ile baypas besleme tekniği ve modifiye cerrahi dahil olmak üzere özofagus doku mühendisliği teknikleri için protokoller açıklanmaktadır. bir sıçan modelinde çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için anastomoz tekniği.

<table><tbody><tr><td>Metabolik kafes</td><td>TEUNGDO BIO & BİTKİ</td><td>JD-C-66</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil (50 mg / g doz)</td> <td>Virbac</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>% 0.25 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Şırınga</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>% 2 ksilazin hidroklorür (Rumpun)</td> <td>Byely</td><td>Q-0615-035</td><td></td></tr><tr><td>% 4 paraformaldehit</td><td>BİYOÇÖZÜM</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>ETHICON</td><td>W9443</td><td></td></tr><tr><td>9-0 Vicryl</td><td>ETHICON</td><td>W2813</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik gentamisin (Septopal).</td><td>Septopal</td><td>0409-1207-03</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat Tamponu, ph6.0, 10X</td><td>Sigma</td><td>C9999</td><td></td></tr><tr><td>DAB PEROKSIDAZ SUBSTRAT KITI</td><td>VEKTÖR</td><td>SK4100</td><td></td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-23879</td><td></td></tr><tr><td>Elastik leke kiti</td><td>ScyTeK</td><td>ETS-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serun (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>Keçi Anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin kapağı</td><td>Hyupsung Medical</td><td>HS-T-05</td><td></td></tr><tr><td>hMSC (STEMPRO) / büyüme ortamı (MesenPRO RSTM)</td><td>Invitrogen</td><td>R7788-110</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz konjuge kiti (Vectastain)</td><td>VECTOR</td><td>PK7800</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>JUNSEI</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Keratin13</td><td>Novus</td><td>NBP1-97797</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Canlılık Test Kiti</td><td>Moleküler Problar</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354262</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamid (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Yapışmayan 24 oyuklu doku kültürü plakaları.</td><td>Corning</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Sigma</td><td>O5500</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Eppendorf</td><td>3072115</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS), 10X</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td></td></tr><tr><td>Polikaprolakton (PCL) polimer</td><td>Sigma 440744</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliüretan (PU + A2: A24) polimer</td><td>Lubrizol</td><td>2363-80AE</td><td></td></tr><tr><td>Güç Kaynağı</td><td>NanoNC</td><td>HV100</td><td></td></tr><tr>ProLong DAPI <td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td><td>ile Altın antifade reaktifi</td></tr><tr><td>Rumpun</td><td>Bayer</td><td>Q-0615-035</td><td></td></tr><tr><td>Silikon T-tüp</td><td>Sewoon Medical</td><td>2206-005</td><td></td></tr><tr><td>Terramisin Göz Merhemi</td><td>Pfizer İlaç Kore</td><td>W01890011</td><td></td></tr><tr><td>Tiletamin / Zolazepam (Zoletil)</td> <td>Virbac Laboratories</td><td>Q-0042-058</td><td></td></tr><tr><td>Trikrom leke kiti</td><td>ScyTeK</td><td>TRM-1</td><td></td></tr><tr><td>von Willebrand Faktörü (vWF)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc 14014</td><td></td></tr></tbody></table>

sıçanlarda Çevresel Özofagus rekonstrüksiyonu için doku-mühendislik greft

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

Çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için biyouyumlu malzemelerin kullanılması sıçanlarda teknik olarak zorlu bir görevdir ve beslenme desteği ile optimal bir implant tekniği gerektirir. Son zamanlarda, özofagus doku mühendisliği birçok girişimleri olmuştur, ancak peristalsis özel ortamda erken epitelizasyon zorluk nedeniyle başarı oranı sınırlı olmuştur. Burada, iki katmanlı tübüler iskele, mezenkimal kök hücre tabanlı biyoreaktör sistemi ve modifiye edilmiş baypas besleme tekniği ile özofagus mukozası ve kas tabakalarının yenilenmesini iyileştirebilen yapay bir özofagus geliştirdik. gastrostomi. İskele poliüretan yapılır (PU) üç boyutlu (3D) baskılı polikaprolakon iplikçik dış duvara sarılmış silindirik bir şekil nanofibers. Transplantasyondan önce, insan kaynaklı mezenkimal kök hücreler iskelenin lümenine tohumlanmış ve hücresel reaktiviteyi artırmak için biyoreaktör ekimi yapılmıştır. Cerrahi anastomoz uygulayarak ve implante edilen protezi tiroid bezi flebi ile kaplayarak greft sağkalım oranını artırdık ve ardından geçici oral olmayan gastrostomi beslenmesi yaptık. Bu greftler histolojik analizde gösterildiği gibi implante edilen bölgelerin çevresinde ilk epitelizasyon ve kas rejenerasyonu bulgularını tekrar ortaya çıkarabildiler. Buna ek olarak, greft çevresinde artmış elastin lifleri ve nevasaskülarizasyon gözlendi. Bu nedenle, bu model çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için potansiyel yeni bir teknik sunar.

Şekil 1, PU-PCL iki katmanlı borulu iskelenin üretim sürecinin şematik diyagramını göstermektedir. PU çözeltisi 18 G iğneden 200 μm kalınlığında silindirik bir iç yapı yapmak için elektrospun edildi. Daha sonra, erimiş PCL düzenli aralıklarla PU nanofiber dış duvarına basıldı. Tamamlanmış boru iskelesinin iç ve dış duvarlarının yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskopi görüntülerinde görülebilir.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

Özofagus rekonstrüksiyonu zorlu bir işlemdir ve özofagus mukozası ve kasının yenilenmesini sağlayan ve yapay greft olarak implante edilebilen doku mühendisliğiöz bir özofagusun geliştirilmesi gereklidir. Burada, iskele imalatı, biyoreaktör ekimi ve çeşitli cerrahi teknikler de dahil olmak üzere yapay bir özofagus oluşturmak için protokolümüzü saklı yız.

Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Özofagus anastomoz sızıntısı olmadan özofagus mukozası ve kas rejenerasyonsağlayan doku mühendisliği özofagus gelişimini gerektiren, bir sıçan modelinde çevresel özofagus onarımı teknik olarak zordur. Transplantasyon sonrası tükürük sızıntısını en aza indirmek için mikrovasküler anastomoz ile birlikte iç nanofiber ve dış 3D baskı iplikçiklerinden oluşan pilot model olarak iki katmanlı borulu bir iskele uyguladık. Konvansiyonel standart özofagus rekonstrüksiyonu çok çeşitli komplikasyonlar ve morbidite ile ilişkilidir.Bu nedenle, özofagus doku mühendisliği yerli hasta özofagus modelleri geliştirmek için umut verici bir alternatif stratejiler olabilir. Melez iskele kombinasyonu, biyoreaktör ekimi, ve bir oral beslenme sistemi sürekli mekanik basınç ile benzer bir kontamine ortama sahip herhangi bir sisteme uygulanabilir. 3D baskılı yemek borusu iskelesini ultraviyole ışığa bir saatlik maruzkalma, 10 dakikalık etanol emmeve PBS ile üç yıkıntı ile sterilize ederek başlayın.Son yıkamadan sonra, yapışmaz 24-iyi doku kültür plaka içine iki katmanlı boru lu iskele yerleştirin ve hafifçe ama düzgün bir kat 10 altı yağ türetilmiş insan mezenal kök hücreleri altı yağ türetilmiş insan mezenal kök hücreleri iskelenin iç yüzeyine büyüme orta ile takviye edilmiştir. Biyoreaktörün kültür odasındaki akrilik tutucuya hücre tohumlu boru lu iskeleyi sıkıca sabitlemek ve odaya 500 mililitre büyüme ortamı eklemek için pulsatil akış biyoreaktör sistemi kullanın. Daha sonra, %5 karbondioksit içeren nemli bir atmosfer altında akışa bağlı kesme geriliminin santimetre karesi 1 dyne uygulayın.Beş gün sonra, standart protokollere göre iskelenin iç yüzeyindeki hücre yanıtlarını belirlemek ve hücreleri konfokal mikroskopi ile görüntülemek için live/DEAD Canlılık Test Kiti kullanın. Cerrahi işlem başlamadan önce, anestezi sıçanda pedal refleksyanıt eksikliği onaylamak, ve steril bir perde üzerinde supine pozisyonda hayvan yerleştirin. Cerrahi siteden saç kaldırmak için makası kullanın ve ardışık BETADINE ve% 70 etanol scrubs ile maruz kalan cilt dezenfekte.T-tüp yerleştirme için, sıçanın karın bir orta hat deri ve kas kesi yapmak, ve ön mide duvarında üç milimetrelik bir delik oluşturmak için bir neşter bıçak kullanın. Mide duvarına düzeltmek için defekt siteye silikon t-tüp ucu yerleştirin ve dikkatle mide kas dokusuna tüp dikiş. 4-0 VICRYL sütür ile karın duvarı dikiş.İmplante edilen T-tüpün distal ucunu subkutan tünelden boynun arkasına dikkatlice yerleştirin ve mide içeriğinin geriye doğru akmasını önlemek için bir heparin kapağını T-tüpün ucuna bağlamak için bir anjiyokateter kullanın. Kapak yerinde olduğunda, karın derisinin tüm tabakalarını kapatmak için 4-0 poliglactin sütür kullanın ve tam recumbency kadar izleme ile bir metabolik kafes içine sıçan yerleştirin. T-tüpü nismekten bir hafta sonra, fareyi ameliyata hazırlayın.Mikroskop altında sıçan yerleştirin ve maruz dezenfekte cilt bir ön median boyun kesi yapmak. Trakeoözofageal yapısını ortaya çıkarmak için kayış kaslarını ayırın. Yemek borusunun sol tarafını nefes borusundan ayırın.Yemek borusunun üst kısmını tiroid bezinden dikkatlice ayırın ve yemek borusunun tüm katmanlarını içeren beş milimetre uzunluğunda tam bir çevre defekti oluşturmak için cerrahi makas kullanın. Daha sonra, üst özofagus kalıntısı ve iskelesağ inferoposterior marjı arasında 9-0 dikiş eklemek ve distal özofagus defekti üst ucunda bir mikroanastomoz oluşturmak için üst özofagus kalıntısı ve iskele arasında sağdan sola dikiş devam. Daha sonra, alt özofagus kalıntısının üst kenar boşluğu ile aynı şekilde iskeleyi anastomozlayın.Anastomozlar tamamlandığında, greftin vasküler kaynağını ve istikrarlı bakımını sağlamak için ekteki tiroid bezi flebi nakli nin üzerine serin. Daha sonra, 4-0 VICRYL sütür ile deri altı kas ve deri dokusu dikiş ve tam recumbency kadar izleme ile bir kızılötesi ısınma cihazı üzerinde bir metabolik kafes içine sıçan yerleştirin. Enjeksiyon yoluyla iskelenin iç duvarına eşit bir uygulamadan sonra, insan mezenkimal kök hücre gömülü bazal membran matris elektron mikroskobu tarama ile değerlendirilen beklenen mezenkimal kök hücre morfolojisi gösterir.Tam çevresel özofagus defekti olan sıçanlara özofagus naklinden sonra, greft implante edilen bölgeye stabil fiksasyon ve vasküler besleme için tiroid bezi flebi ile kapatılır. Özofagus nakli yapılan sıçanlar işlemden yaklaşık dokuz gün sonrasına kadar 340 gramda kalırlar ve bu noktada hayvanların çeşitli nedenlerle hızla kiloları azalır ve 15. Sıçanların çoğunda saç toplarının neden olduğu özofagus dışı obstrüksiyon gelişse de, herhangi bir deneysel hayvanda perforasyon, fistül ile anastomoz sızıntısı, seroma birikimi, apse oluşumu veya çevresindeki yumuşak doku nekrozu gibi brüt bir bulgu yoktur.Transplantasyon bölgesinin yeniden epitelizasyonu keratin için immünororesans boyama ile doğrulanabilir, ve rejenere kollajen tabakası ve elastin lifleri Masson'un trikrom boyama ile açıkça görülebilir. Özofagus kas tabakasının rejenerasyonu de desmin immünohistokimyasal analiz ile değerlendirildiği gibi bol bir neovaskülerizasyon ile kanıtlanır. Bu işlemin başarısı, özofagus rekonstrüksiyonu sırasında beslenme sağlamak için boyun arkasında fiksasyon yoluyla T-tüp istikrarlı bakım dayanır.Bu prosedüre özgü erken mortalitenin üstesinden gelmek için, fonksiyonel özofagus rekonstrüksiyonuna yardımcı olmak için özofagus implantasyonu ndan sonra organoid veya erken vaskülarizasyon teknolojisi uygulanabilir.

tissue-engineered-graft-for-circumferential-esophageal-reconstruction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada, atriyoventriküler (AV) bir yetişkin Lewis sıçan oluk mühendislik doku implant kardiyak cerrahi işlem açıklar.

Sıçan Kalp Engineered Doku implantasyonu

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Bu videoda, doku mühendisliği uygulamaları için biyokimyasal mimarisi ve bileşimi korunmuş, hücresinden arındırılmış bir domuz özofagusu iskelesinin hazırlanışını gösteriyoruz.

Hücreden Arındırılmış Domuz Özofagus İskelesi Hazırlığı: Domuz Yemek Borusundan Aselüler İskele Oluşturma Tekniği

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Bugüne kadar, kalın doku defektleri tipik olarak otolog doku flepleri veya mühendislik dokuları uygulanarak yeniden yapılandırılır. Bu protokolde, otolog fleplerin yerine geçecek şekilde otolog pediküllü vaskülarize doku flebi mühendisliği için yeni bir yöntem sunuyoruz.

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

Burada, PCL vasküler Greftler kalın elyaf ve iri gözenekli ile imal ve abdominal aort değiştirme bir sıçan modelinde vivo içinde performansını değerlendirmek için bir iletişim kuralı tanımlamak için modifiye electrospinning yöntemi mevcut.

Bir sıçan modelinde en iyi duruma getirilmiş yapısı ile Electrospun vasküler greft implantasyonu

Greft stenoz mühendislik doku hava yolu değiştirme kritik bir engel teşkil etmektedir. Stenoz temel hücresel mekanizmaları araştırmak için bir fare modeli doku Mühendisliği trakeal değiştirme numaralı seribaşı kemik iliği mononükleer hücreler (BM-MNC) kullanmaktadır. Burada, iskele imalatı, BM-MNC yalıtım, greft tohum ve implantasyon dahil olmak üzere bizim Protokolü ayrıntılı.

Tohum ve bir biyosentetik doku Mühendisliği trakeal greft bir fare modeli implantasyonu

Bu protokolde, Wistar sıçanlarında üretra darlığı indüksiyonu geliştirildi ve bunu takiben bukkal mukoza grefti ile üretral rekonstrüksiyon yapıldı. Retrograd üretrogram ve lazer Doppler değerlendirmesi yapılarak üretral rekonstrüksiyon (striktür oluşumundan sonra) ve greft yerleşimi doğrulandı.

Üretra darlığı indüksiyonunu takiben sıçan modelinde bukkal mukoza greft üretroplastisi

Bu çalışma, kritik aort darlığı veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi konjenital kardiyak defektlerde görüldüğü gibi, endotelyal-mezenkimal geçişe bağlı fibrozun bir hayvan modelini sunar, bu da ayrıntılı histolojik doku değerlendirmesine, düzenleyici sinyal yollarının tanımlanmasına ve tedavi seçeneklerinin test edilmesine olanak tanır.

Endotelyal-mezenkimal geçiş çalışması için yenidoğan heterotopik sıçan kalp nakli modeli

Bu protokol, greft reddine ilaç müdahalesinin zaman seyri değerlendirmesi için ileostomi ile sıçan tabanlı bir bağırsak transplantasyon modelini tanımlar.

Longitudinal Prognoz Değerlendirmesi için Eksteriorize İleostomi ile İntestiorize İleostomi ile İntestinal Transplantasyonun Sıçan Greft Rejeksiyon Modeli

Keşfedin, sıçanlarda çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için doku mühendisliği greft yöntemini. İki katmanlı hibrit iskele ve mikrovasküler anastomoz tekniğiyle tükürük sızıntısını minimize ederek özofagus dokusunun rejenerasyonunu destekleyen bu protokol, cerrahi sonuçları iyileştirmeye yönelik umut vadeden bir alternatif sunar.

Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft

Daha fazla video keşfet