Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi
29 Ekim 2019
Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.
Bakteriler çok küçük olduğu için, insanlar genellikle üç boyutlu nesneler olduklarını unuturlar. Protokolümüz hem düz hem de kavisli hücrelerin şekillerinin doğru şekilde yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Bu protokol yalnızca standart bir mikroskopta küçük değişiklikler gerektirir ve MATLAB komut dosyalarında kolayca kullanılabilir.
Denemeye başlamadan önce, tek bir cam mikroskop kaydırağının zıt uçlarına her üç 20'den 20'şer iki deste kapak yerleştirin. Pipet 200 mikrolitre agarose ped çözeltisi slayt üzerine ve hemen ve sıkıca kapak fişleri yığını üzerine agarose düzleştirmek için ikinci bir slayt yerleştirin. Agarose oda sıcaklığında yaklaşık bir dakika katılaşmak için izin sonra dikkatle üst slayt kapalı slayt slayt ve jel bireysel beş milimetre çapında pedleri kesmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu büyük bir ucu kullanın.
Tüm pedler pipet elde edildiğinde, herhangi bir hücre kümelerini bozmak ve her pedüzerine bir mikrolitre altkültür eklemeden önce hücrelerin homojen bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için E.coli hücre kültürü birkaç kez elde edilir. Numunelerin 5 ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyince damlacıkların pedlere bir kapak kayma koymadan önce yastıkların tamamen emildiğini doğrular. Daha sonra kapak fişinin kenarına uygun bir dolgu sıvısını nazikçe fırçalamak için pamuklu bir bez kullanın ve dolgu sıvısını kapak fişinin üst kısmından uzak tutmaya özen çekin.
Kapağı mühürledikten hemen sonra kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve beş dakikalık termal dengeden sonra bir hücrenin ortasını odak haline getirmek için mikroskop odak tekerleklerini kullanın. ND Acquisition altında ilişkili mikroskop yazılımında, Z yığını elde etmek için Z kutusunu işaretleyin ve hücrenin ortasını başlangıç noktası olarak ayarlamak için Ana Ekran düğmesini tıklatın. Adım boyutunu 0,1 mikrometreye, Menzili dört mikrometreye ayarlayın ve Z Aygıtının Piezo aşamasına ayarlandıklarına emin olun.
Hücrenin arka plandan neredeyse ayırt edilemez olması için hücrenin hem üst hem de alt kısmında yeterli bulanıklık olması önemlidir. Lambda penceresinin altındaki floresan kanalları, görüntülenecek floresan moleküllerin ayarlarına ayarlayın ve geçiş yapmadan önce her renk kanalında tam bir Z destesi elde edilebilmesi için deneme sırasının lambda olarak ayarlandığını doğrulayın. Ardından görüntü edinimi başlatmak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın.
Tüm görüntüler elde edildiğinde uygun bir görüntü analizi yazılım programında dosyaları açın. Tek bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve bu hücreyi her kanal için bir kez, Yinelenen hiper yığın kutusunun işaretli olduğundan emin olmak için iki kez çoğaltın ve kanalı bir veya iki hücreye değiştirin. Her iki yığın kullanılabilir hale getirinde, görüntüleri birleştirmek için Görüntüler, Yığınlar, Araçlar ve Concatenate'i seçin.
Protein kanalı ile ilk ve şekil kanal ikinci. TiFF dosyası olarak yeni görüntü kaydolduktan sonra kırpılmış görüntüleri ve cell_shape_settings_tri içeren masaüstünde bir klasör içinde bir klasör yapmak. shae-cellshape-public exampleData_tri txt dosyası.
cell_shape_settings_tri'ı edin. txt dosya ilgi deneme için doğru ayarlara sahip olmak. Ve dize ile Cell_shape_detector3dConvTriFolder işlevini klasör konumuna çalıştırın ve ardından başlatılacak hücre sayısı ve çalıştırılması gereken hücre sayısı.
Hücrelerin düzgün bir şekilde yeniden oluşturulduğunu doğrulamak için ScreenFits çalıştırın. Grafik kullanıcı arabirimi açıldığında Klasörü Seç düğmesini tıklatın ve hücre yeniden yapılandırmalarını görsel olarak görüntülemek için yeniden yapılandırma veri dosyalarının yer alan klasörünü seçin. Şekilsiz görünen veya tam kapsama alanına sahip olmayan herhangi bir hücre için, herhangi bir akış aşağı analizinin dışında tutulabilmesi için FLAG'ı ada eklemek için yeniden yapılanmanın yanındaki kutuyu seçin.
Yüzeydeki Gauss eğriliği fonksiyonu olarak ilgi proteingöreceli konsantrasyonu bir zenginleştirme profili oluşturmak için zenginleştirmeSmothingSpline çalıştırın. Ardından, yalnızca oluşturulmuş TRI ile her klasörü seçin. mat dosyaları ve yeni oluşturulan eğri mat dosyasını seçin.
Bu yöntem, 2B gösterimi olarak kavisli veya anormal şekilli hücreleri doğru bir şekilde yansıtamaz ken özellikle yararlıdır. Bu deneyde bakteriyel aktin proteini MreB'ye yeşil floresan füzyon proteini, hem yabani tipte hem de mutant E.coli hücrelerinde aktin proteininin kesin lokalizasyonunu incelemek için üretildi. Bu ölçümleri 3Boyutlu olarak yapılan görüntülerde hem vahşi tip hem de rodZ mutant hücrelerinin şekilleri yeniden yapılandırılabildi.
MreB'nin lokalizasyonunun, rodZ'ye bağlı olarak sadece 3Boyutlu olarak ölçülebilen geometrik bir özellik olan küçük Gauss eğriliklerinde zenginleştirilmeye karar verildi. Z yığınının, hücrelerin üst ve alt kısımda bulanıklaşacak ve hücrelerin birbirinden iyi aralıklı olduğundan emin olun. Proteinlerin 3Boyutlu geometrik lokalizasyonunun nasıl ölçüleceğini gösteriyoruz ancak etiket protein derlemelerinin büyüklüğü gibi diğer bilgiler bu verilerden hesaplanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanıp monte edileceğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar. Bu yöntem, hem düz hem de kavisli bakteri hücrelerinin doğru görselleştirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Bakteri üç boyutlu nesnelerdir, ancak genellikle iki boyutta incelenirler.
- Doğru şekil yeniden yapılandırması, bakteri morfolojisini anlamak için esastır.
- Bu protokol, değişikliklerle standart mikroskopi ekipmanlarını kullanır.
- Floresan proteinler, belirli hücresel bileşenleri görselleştirmek için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- E. coli'nin 3D şekillerini yeniden yapılandırmak için bir yöntem geliştirmek.
- Bakteryal hücreler içinde proteinlerin lokalizasyonunu incelemek.
- Bakteryal hücre morfolojisi hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteryal örnek montajı için agaroz pedlerinin hazırlanması.
- Z yığınlarını elde etmek için mikroskop kullanımı.
- Elde edilen görüntülerden hücre şekillerinin yeniden yapılandırılması için görüntü analizi.
- Veri işleme ve analiz için MATLAB betiklerinin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Yabani tip ve mutant E. coli hücrelerinin 3D şekillerinin başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması.
- MreB proteininin lokalizasyonunun küçük Gauss eğriliklerinde zenginleştiği tespit edildi.
- Yöntem, kavisli bakteri şekillerinin karmaşıklığını etkili bir şekilde yakalar.
- Bakteryal morfoloji çalışmalarında 3D görüntülemenin önemi gösterildi.
Sonuçlar
- Protokol, bakterilerin 3D görüntülemesinde güvenilir bir yöntem sunar.
- Hücre şekli ile ilgili protein lokalizasyonunun detaylı analizini sağlar.
- Bu yaklaşım, bakteriyel morfoloji ile ilgili çeşitli çalışmalarda uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate 3D reconstruction of bacterial cell shape and protein localization addresses a critical gap in microbiology research where 2D imaging obscures morphological and spatial functional relationships. This capability enables mechanistic de-risking in target validation by linking protein behavior to geometric cell features such as Gaussian curvature, which cannot be resolved in 2D. The method supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, spatially resolved data on protein distribution in native-like cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating protein localization with 3D cell shape parameters like Gaussian curvature.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target proteins in physiologically relevant cellular morphologies.
- Predictive Value: Improves target confidence by revealing spatial regulation of proteins in native 3D cellular environments.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D shape and protein enrichment profiles suitable for high-content screening applications.
- Reproducibility: Uses standardized Z-stack acquisition and MATLAB-based processing to ensure consistent shape reconstruction across experiments.
- Scalability: Compatible with common fluorescent microscopes and adaptable to multiple bacterial species and mutants, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing spatially resolved protein localization data that informs functional studies in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein phenotypes are shape-dependent, reducing false positives in target validation.
- Biomarker Alignment: Enables identification of curvature-associated protein patterns that may serve as translational biomarkers in morphologically distinct bacterial states.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling data-driven progression to lead identification and preclinical evaluation through mechanistically informed protein localization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by linking protein localization to 3D morphological features, clarifying functional relationships in cellular pathways.
- Screening: Produces assay-ready, quantitative outputs including Gaussian curvature maps and protein enrichment profiles for comparative condition analysis.
- Analytics: Delivers shape-based protein enrichment curves that allow teams to quantify spatial dependencies and compare genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by providing spatially resolved data that can validate target engagement in morphologically relevant bacterial models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability applicable across multiple projects studying bacterial morphology and protein function.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling precise protein localization in 3D, improving target validation accuracy.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized sample preparation, Z-stack acquisition, and automated MATLAB-based reconstruction.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether protein localization is shape-dependent, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on spatially validated functional data in native cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and MATLAB-based computational processing.
- Needs access to a fluorescent microscope with piezo stage capability and sufficient computational resources for 3D reconstruction.
- Demands standardization of sample preparation, Z-stack parameters, and image processing workflows across teams.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different bacterial species, shapes, or fluorescent labels.
- Limited by the computational intensity of 3D reconstruction, though high-throughput resources are recommended rather than required.
