Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi
29 Ekim 2019
Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.
Bakteriler çok küçük olduğu için, insanlar genellikle üç boyutlu nesneler olduklarını unuturlar. Protokolümüz hem düz hem de kavisli hücrelerin şekillerinin doğru şekilde yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Bu protokol yalnızca standart bir mikroskopta küçük değişiklikler gerektirir ve MATLAB komut dosyalarında kolayca kullanılabilir.
Denemeye başlamadan önce, tek bir cam mikroskop kaydırağının zıt uçlarına her üç 20'den 20'şer iki deste kapak yerleştirin. Pipet 200 mikrolitre agarose ped çözeltisi slayt üzerine ve hemen ve sıkıca kapak fişleri yığını üzerine agarose düzleştirmek için ikinci bir slayt yerleştirin. Agarose oda sıcaklığında yaklaşık bir dakika katılaşmak için izin sonra dikkatle üst slayt kapalı slayt slayt ve jel bireysel beş milimetre çapında pedleri kesmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu büyük bir ucu kullanın.
Tüm pedler pipet elde edildiğinde, herhangi bir hücre kümelerini bozmak ve her pedüzerine bir mikrolitre altkültür eklemeden önce hücrelerin homojen bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için E.coli hücre kültürü birkaç kez elde edilir. Numunelerin 5 ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyince damlacıkların pedlere bir kapak kayma koymadan önce yastıkların tamamen emildiğini doğrular. Daha sonra kapak fişinin kenarına uygun bir dolgu sıvısını nazikçe fırçalamak için pamuklu bir bez kullanın ve dolgu sıvısını kapak fişinin üst kısmından uzak tutmaya özen çekin.
Kapağı mühürledikten hemen sonra kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve beş dakikalık termal dengeden sonra bir hücrenin ortasını odak haline getirmek için mikroskop odak tekerleklerini kullanın. ND Acquisition altında ilişkili mikroskop yazılımında, Z yığını elde etmek için Z kutusunu işaretleyin ve hücrenin ortasını başlangıç noktası olarak ayarlamak için Ana Ekran düğmesini tıklatın. Adım boyutunu 0,1 mikrometreye, Menzili dört mikrometreye ayarlayın ve Z Aygıtının Piezo aşamasına ayarlandıklarına emin olun.
Hücrenin arka plandan neredeyse ayırt edilemez olması için hücrenin hem üst hem de alt kısmında yeterli bulanıklık olması önemlidir. Lambda penceresinin altındaki floresan kanalları, görüntülenecek floresan moleküllerin ayarlarına ayarlayın ve geçiş yapmadan önce her renk kanalında tam bir Z destesi elde edilebilmesi için deneme sırasının lambda olarak ayarlandığını doğrulayın. Ardından görüntü edinimi başlatmak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın.
Tüm görüntüler elde edildiğinde uygun bir görüntü analizi yazılım programında dosyaları açın. Tek bir hücrenin etrafına bir kutu çizin ve bu hücreyi her kanal için bir kez, Yinelenen hiper yığın kutusunun işaretli olduğundan emin olmak için iki kez çoğaltın ve kanalı bir veya iki hücreye değiştirin. Her iki yığın kullanılabilir hale getirinde, görüntüleri birleştirmek için Görüntüler, Yığınlar, Araçlar ve Concatenate'i seçin.
Protein kanalı ile ilk ve şekil kanal ikinci. TiFF dosyası olarak yeni görüntü kaydolduktan sonra kırpılmış görüntüleri ve cell_shape_settings_tri içeren masaüstünde bir klasör içinde bir klasör yapmak. shae-cellshape-public exampleData_tri txt dosyası.
cell_shape_settings_tri'ı edin. txt dosya ilgi deneme için doğru ayarlara sahip olmak. Ve dize ile Cell_shape_detector3dConvTriFolder işlevini klasör konumuna çalıştırın ve ardından başlatılacak hücre sayısı ve çalıştırılması gereken hücre sayısı.
Hücrelerin düzgün bir şekilde yeniden oluşturulduğunu doğrulamak için ScreenFits çalıştırın. Grafik kullanıcı arabirimi açıldığında Klasörü Seç düğmesini tıklatın ve hücre yeniden yapılandırmalarını görsel olarak görüntülemek için yeniden yapılandırma veri dosyalarının yer alan klasörünü seçin. Şekilsiz görünen veya tam kapsama alanına sahip olmayan herhangi bir hücre için, herhangi bir akış aşağı analizinin dışında tutulabilmesi için FLAG'ı ada eklemek için yeniden yapılanmanın yanındaki kutuyu seçin.
Yüzeydeki Gauss eğriliği fonksiyonu olarak ilgi proteingöreceli konsantrasyonu bir zenginleştirme profili oluşturmak için zenginleştirmeSmothingSpline çalıştırın. Ardından, yalnızca oluşturulmuş TRI ile her klasörü seçin. mat dosyaları ve yeni oluşturulan eğri mat dosyasını seçin.
Bu yöntem, 2B gösterimi olarak kavisli veya anormal şekilli hücreleri doğru bir şekilde yansıtamaz ken özellikle yararlıdır. Bu deneyde bakteriyel aktin proteini MreB'ye yeşil floresan füzyon proteini, hem yabani tipte hem de mutant E.coli hücrelerinde aktin proteininin kesin lokalizasyonunu incelemek için üretildi. Bu ölçümleri 3Boyutlu olarak yapılan görüntülerde hem vahşi tip hem de rodZ mutant hücrelerinin şekilleri yeniden yapılandırılabildi.
MreB'nin lokalizasyonunun, rodZ'ye bağlı olarak sadece 3Boyutlu olarak ölçülebilen geometrik bir özellik olan küçük Gauss eğriliklerinde zenginleştirilmeye karar verildi. Z yığınının, hücrelerin üst ve alt kısımda bulanıklaşacak ve hücrelerin birbirinden iyi aralıklı olduğundan emin olun. Proteinlerin 3Boyutlu geometrik lokalizasyonunun nasıl ölçüleceğini gösteriyoruz ancak etiket protein derlemelerinin büyüklüğü gibi diğer bilgiler bu verilerden hesaplanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteriyel örneklerin nasıl hazırlanacağını ve monte edileceğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden oluşturulacağını açıklamaktadır. Bu yöntem, hem düz hem de kavisli bakteriyel hücrelerin doğru şekilde görselleştirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Bakteriler üç boyutlu nesnelerdir, ancak sıklıkla iki boyutlu olarak incelenirler.
- Doğru şekil rekonstrüksiyonu, bakteriyel morfolojiyi anlamak için esastır.
- Bu protokol, modifikasyonlar uygulanmış standart mikroskopi ekipmanlarını kullanmaktadır.
- Belirli hücresel bileşenleri görselleştirmek için floresan proteinler kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- E. coli'nin 3D şekillerini yeniden yapılandırmak için bir yöntem geliştirmek.
- Bakteriyel hücreler içindeki proteinlerin lokalizasyonunu incelemek.
- Bakteriyel hücre morfolojisine dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bakteriyel numune montajı için agaroz pedlerin hazırlanması.
- Z istif görüntüleri elde etmek için mikroskop kullanımı.
- Elde edilen görüntülerden hücre şekillerini yeniden oluşturmak için görüntü analizi.
- Veri işleme ve analiz için MATLAB betiklerinin uygulanması.
Temel Sonuçlar
- Yabani tip ve mutant E. coli hücrelerinin 3B şekillerinin başarılı bir şekilde yeniden oluşturulması.
- MreB proteininin lokalizasyonunun düşük Gauss eğriliklerinde zenginleştiği tespit edilmiştir.
- Yöntem, kavisli bakteriyel şekillerin karmaşıklığını etkili bir şekilde yakalamaktadır.
- Bakteriyel morfolojinin incelenmesinde 3B görüntülemenin önemini kanıtlamıştır.
Sonuçlar
- Protokol, bakterilerin 3D görüntülemesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Hücre şekli ile ilişkili olarak protein lokalizasyonunun detaylı analizine olanak tanır.
- Bu yaklaşım, bakteriyel morfolojiyi içeren çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Bakteriyel hücre şeklinin ve protein lokalizasyonunun doğru bir şekilde 3B rekonstrüksiyonu, 2B görüntülemenin morfolojik ve mekansal fonksiyonel ilişkileri perdelediği mikrobiyoloji araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu yetenek, protein davranışını 2B'de çözülemeyen Gauss eğriliği gibi geometrik hücre özellikleriyle ilişkilendirerek hedef doğrulamada mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar. Yöntem, yerli benzeri hücresel bağlamlarda protein dağılımı hakkında kantitatif ve mekansal olarak çözümlenmiş veriler sağlayarak erken keşif aşamasında öngörüsel güveni destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Protein lokalizasyonunu, Gauss eğriliği gibi 3D hücre şekli parametreleri ile ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef proteinlerin fizyolojik olarak ilgili hücresel morfolojilerde doğrudan görselleştirilmesi yoluyla biyolojik risk azaltımını destekler.
- Öngörücü Değer: Proteinlerin doğal 3D hücresel ortamlardaki uzamsal düzenlemesini ortaya çıkararak hedef güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek içerikli tarama uygulamaları için uygun, standartlaştırılmış, kantitatif 3B şekil ve protein zenginleşme profilleri oluşturur.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arasında tutarlı şekil rekonstrüksiyonu sağlamak için standartlaştırılmış Z-yığın (Z-stack) görüntüleme ve MATLAB tabanlı işleme kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Yaygın floresan mikroskoplarla uyumludur ve birden fazla bakteri türü ile mutantına uyarlanabilir, böylece platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalıkla ilgili modellerdeki fonksiyonel çalışmalara temel oluşturan, uzaysal olarak çözümlenmiş protein lokalizasyon verileri sağlayarak keşif ile preklinik çalışmalar arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen protein fenotiplerinin şekle bağımlı olup olmadığını netleştirerek, hedef doğrulamadaki yanlış pozitifleri azaltır.
- Biyobelirteç Uyumluluğu: Morfolojik olarak farklı bakteriyel durumlarda translasyonel biyobelirteçler olarak hizmet edebilecek, eğime (curvature) bağlı protein modellerinin tanımlanmasını sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, erken keşif sürecine uygun olup, hedef doğrulamasındaki hipotez testlerini desteklemekte ve mekanistik olarak bilgilendirilmiş protein lokalizasyonu aracılığıyla, veri odaklı bir şekilde öncü bileşik tanımlama ve preklinik değerlendirme aşamalarına geçişi sağlamaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Protein lokalizasyonunu 3D morfolojik özelliklerle ilişkilendirerek hipotez testlerini kolaylaştırır ve hücresel yolaklardaki fonksiyonel ilişkileri netleştirir.
- Tarama: Karşılaştırmalı durum analizleri için Gauss eğrilik haritaları ve protein zenginleşme profilleri dahil olmak üzere analize hazır, kantitatif çıktılar üretir.
- Analizler: Ekiplerin mekansal bağımlılıkları niceliklendirmesine ve genetik veya tedavi koşullarını karşılaştırmasına olanak tanıyan şekil tabanlı protein zenginleşme eğrileri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Morfolojik olarak ilgili bakteriyel modellerde hedef etkileşimini doğrulayabilen mekansal olarak çözümlenmiş veriler sağlayarak preklinik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bakteriyel morfoloji ve protein fonksiyonu üzerine çalışan birden fazla projeye uygulanabilecek, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Proteinlerin 3 boyutlu düzlemde hassas şekilde lokalizasyonuna olanak tanıyarak mekanistik belirsizliği azaltır ve hedef doğrulama doğruluğunu artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış numune hazırlama, Z-yığını (Z-stack) elde etme ve MATLAB tabanlı otomatik yeniden yapılandırma yoluyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Protein lokalizasyonunun şekle bağımlı olup olmadığını ortaya çıkararak devam/durma kararlarına veri sağlar ve geç aşama biyolojik riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Yerli hücresel bağlamlarda mekansal olarak doğrulanmış fonksiyonel verilere dayanarak hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Floresan mikroskopi, görüntü analizi ve MATLAB tabanlı hesaplamalı işleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Piezo sahne kapasitesine sahip bir floresan mikroskoba ve 3D yeniden yapılandırma için yeterli hesaplama kaynaklarına erişim gereklidir.
- Numune hazırlığının, Z-yığını parametrelerinin ve görüntü işleme iş akışlarının ekipler arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Yöntemin farklı bakteri türlerine, şekillerine veya floresan etiketlere uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- 3D yeniden yapılandırmanın hesaplama yoğunluğu ile sınırlıdır, ancak yüksek kapasiteli kaynaklar zorunlu olmasa da önerilir.
