Name: Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Keşfedin organotipik serebellar dilim kültürleri kullanarak farede Purkinje hücre ölümünü modelleme yöntemini. Bu teknik sinir koruyucu ilaç taraması için in vivo benzeri koşullar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Northwestern Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi'nde NCI CCSG P30 CA060553 tarafından cömertçe desteklenen ve Robert H Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi'ne verilen görüntüleme çalışmaları gerçekleştirildi. Biz sean McDermott onun teknik yardım ve destek için teşekkür ederim, ve Maya Epstein şekil 1gösterilen elle çizilmiş çizimler için .

Hayvanlarla ilgili tüm deneyler Northwestern Üniversitesi Hayvan Araştırmaları komitesine uygun olarak yapılmıştır.
1. Organotipik serebellar dilim kültürleri öncesinde hazırlık
<ol><li>Önceden %70 etanol püskürtülen bir hücre kültüründe, steril şişe alıcısına bağlı 250 mL şişe üstü vakum filtresinde 200 mL kültür ortamı hazırlayın. 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), 50 mL Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 50 mL ısı yalıtımlı at serumu, 1 mL 200 mM L-Glutamin (son konsantrasyon 1 mM) ve 5 mL 200 g/L glukoz (son konsantrasyon 5 mg/mL) ekleyin. Kültür ortamını vakumla filtreleyin ve bir aya kadar +4 °C'de tutun.</li>
	<li>Sterilize edilmiş biyogüvenlik kabininde, paketinden 6 kuyulu bir kültür plakası alın. Her kuyuya 1 mL kültür ortamı doldurun. Bir tedavi test edilirse, tedavi kuyuya farmakolojik ajan ekleyin, ve iyi kontrol için araç çözeltisi aynı hacimde. Bu çalışmada, tedavi edilen kuyuya 1 μL steril 3 M KCl çözeltisi (30 mM final) ve kontrol kuyularına 1 μL steril su ekledik.</li>
	<li>Hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) membran (gözenek boyutu = 0,4 μm) ile ayrı ayrı sarılmış hücre kültürü eklerin gerekli sayıda hücre kültürü başlık içine getirin. Dikkatlice onları açmak ve steril forceps ile hücre kültürü ekler çıkarmak. Ekleme zarı ve hücre kültürü ortamı arasındaki arabirimde kabarcıklardan kaçınarak, 6 kuyulu bir plakanın içine teker teker bırakın. Ekler in37 °C, 5% CO2 kuluçka içinde en az 2 saat kültür önce orta dengesağlar. NOT: Doku helikopteri hücre kültüründe kalıcı olarak bulunur.</li>
	<li>Biri 150 mL steril su ile dolu, diğeri 150 mL %70 etanol le doldurulmuş iki adet 200 mL beafer hazırlayın. Cerrahi aletleri kullanmadan önce %70 etanol banyosuna ve daha sonra suya batırın. NOT: Etanol ile temastan hemen sonra cerrahi aletler kullanmayın.</li>
	<li>%70 etanol kabında çift kenarlı bıçağı dezenfekte edin. Steril forceps kullanarak bıçak tutucuüzerine yerleştirin ve bıçak kelepçe anahtarı kullanarak yerine tutun. Kullanıma kadar kurutun.</li>
	<li>% 70 etanol beaker doku helikopter ile sağlanan plastik disk dezenfekte. Diski üzerine yerleştirmeden önce kesme masasını %70 etanolle püskürtün. Kullanıma kadar kurualım.</li>
</ol>2. Diseksiyon ve Serebellar Organotypic Dilim Kültürleri
<ol><li>Diseksiyonu gerçekleştirmek için fare yavrusunu hücre kültürü başlığının içine getirin.</li>
	<li>Düz çalışma makası kullanarak yavrunun kafasını hızlı bir şekilde decapitate(Şekil 1A).</li>
	<li>Düz pansuman forceps ile burun tarafından yavrubaşını tutarken, arka ucundan başlayarak, düz göz makas kullanarak kafa derisi açık kesilmiş ve orta hatta yanal gidiyor.</li>
	<li>Kafatası için aynı şekilde ilerleyin. NOT: Diseksiyon sırasında beyincik zarar önlemek için dışa makas uçları işaret emin olun.</li>
	<li>Beyni çıkar ve soğuk HBSS + 5 mg/mL glikoz ile dolu 60 mm'lik bir tabağa aktarın.</li>
	<li>Steril düz ince forceps kullanarak beyincik dikkatlice dışarı incelemek (Şekil 1B). Steril kavisli ince çalgılar kullanarak doku helikopterinin kesme masasına yerleştirilen plastik diske aktarın.</li>
	<li>Parasagittal kesitler gerçekleştirmek için kesme tablosunu döndürerek dokuyu yönlendirin.</li>
	<li>Bıçak dokunun kenarına yerleştirilmiş, böylece masa serbest düğüm sağa çekerek kesme tablosu taşıyın.</li>
	<li>Dilim kalınlığını 350 μm'ye, bıçak hızını orta hıza ayarlayın.</li>
	<li>Helikopteri çalıştırın. Tüm beyincik dilimlendikten sonra(Şekil 1C),helikopteri kapatın.</li>
	<li>Steril forceps ile plastik disk çıkarın.</li>
	<li>Plastik diski HBSS + 5 mg/mL glikoz içeren 60 mm'lik bir tabağa dikkatlice yakınlaştırın. Pipet soğuk HBSS + 5 mg / mL glukoz tampon dolu çanak serebellar dilimleri hasat sağlamak için steril bir transfer pipet kullanarak doku üzerine.</li>
	<li>Serebellar dilimlerini bir mikroprob kullanarak birbirinden ayırın. Transfer pipeti ile kaliteli bölümleri alın (vermise yakın doku bölümleri kullanılması tavsiye edilir) ve önceden dengelenmiş hücre kültürü eklemesine bırakın (Şekil 1D).</li>
	<li>Serebellar dilimleri mikroprobu kullanarak hücre kültürü ekine yerleştirin, sonra transfer pipeti ile fazla HBSS + 5 mg/mL glukoz çözeltisini dikkatlice çıkarın. NOT: Bu aşamada doku son derece hassas ve fiziksel hasareğilimli. Hücre kültürü eklemek başına serebellar dilimlerin maksimum sayısı donör hayvanın yaşına bağlıdır. P0-P4 yaşındaki bir hayvan için 6-8 dilim, P5'ten büyük hayvanlar için 4-6 dilim kültürlenebilir.</li>
	<li>Kültür çanamasını kuvöze yerleştirin, ortayı 2-3 günde bir tamamen değiştirin.</li>
	<li>Purkinje hücre sağkalım değerlendirmek için, dilimler kadar erken toplanabilir 5 gün in vitro. Diğer amaçlar için, birkaç hafta boyunca kültür de tutulabilir(Şekil 1F). NOT: Purkinje hücre sağkalım deneylerinde, hücre kültürü ortamını değiştirirken farmakolojik tedaviyi yenilemeye gerek yoktur (Şekil 1F).</li>
</ol>3. İmmünofluoresans
<ol><li>Kuvözden 6 kuyulu plakayı çıkar. Hücre kültürü ortamını kaldırın, hücre kültürünü 1x PBS ile yıkayın ve dilimleri 1 saat boyunca soğuk %4 paraformaldehit çözeltisi ile düzeltin, hücre kültürü kesici ucunun altında 1 mL ve hücre kültürü kesici ucunun üzerine 500 μL ile düzeltin.</li>
	<li>Uçları 4x 10 dk'yı 1x PBS ile, 1 mL altında ve 500°L'lik uçları bir orbital shaker üzerinde yıkayın.</li>
	<li>Bir fırça ile, 1 hücre kültüründen serebellar dilimleri 1 x PBS, 0.25% Triton X-100 ve% 3 BSA (PBS-TB), 500 μL / iyi ile önceden doldurulmuş 24 iyi bir kuyu ya da 1.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS-TB'de kuluçka ya da kesitleri permeabilize edin ve engelleyin.</li>
	<li>PBS-TB çözeltisinde seyreltilmiş primer antikorlarla, bir gecede + 4 °C'de, bir orbital shaker üzerinde, 200 μL/well ile inkübül.</li>
	<li>Ertesi gün, 1x PBS ile 10 dakika dört yıkar, bir orbital shaker, 500 μL / iyi.</li>
	<li>PBS-TB çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla, oda sıcaklığında iki saat, bir orbital shaker üzerinde inkübatve ışıktan korunur, 200 μL/iyi.</li>
	<li>1x PBS ile 10 dk'lık dört yıkAma, orbital shaker, 500 μL/iyi yapın.</li>
	<li>1x PBS (2 μg/mL) olarak seyreltilmiş, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıktan korunan, 500 μL/iyi olan Hoechst 33342 kullanarak dilimleri ters boylayın.</li>
	<li>Serebellar dilimleri transfer pipetile mikroskopi slayt üzerine monte edin. Tamamen kurusunlar, ışıktan korunsunlar. 1x PBS ile yeniden nemleştirin ve birkaç damla montaj ortamı (~80 μL) ile kaplanmış bir kapak kayması uygulayın. Herhangi bir kabarcıklar yapmaktan kaçının.</li>
	<li>Montaj ortamı iyileştikten sonra serebellar kesitler görüntülenmeye hazırdır.</li>
</ol>4. Hücre Sağkalımının Görüntülenmesi ve Ölçülmesi
<ol><li>Mikroskobu ve lazerleri üreticinin ve/veya görüntüleme çekirdeği tesisinin talimatlarına göre açın.</li>
	<li>Satın alma yazılımını başlatın.</li>
	<li>10X hedefi kullanarak, 9-10 lobules (genellikle vermise yakın serebellar kesitler) mevcut değişmemiş serebellar dilimleri bulmak.</li>
	<li>z yığını edinimi etkinleştirin. Serebellar dilimmevcut tüm Purkinje hücreleri içerecek şekilde z-yığınının aralığını tanımlayın. 2 μm adım boyutu ayarlayın ve satın alma başlatın. İlişkili meta verileri korumak için edinilen resmi edinme yazılımı üreticisi biçiminde kaydedin.</li>
	<li>Bio-formatlar eklentisi18kullanarak ImageJ edinilen dosyayı açın.</li>
	<li>Resim > Yığınlar > Z-projesine git... (Şekil 2A).</li>
	<li>Projeksiyon türü açılır menüde Maksimum Yoğunluk'u seçin ve Tamam 'ı tıklatın (Şekil 2B).</li>
	<li>Düzleştirilmiş bir 2-B görüntü oluşturulur. Point Tool penceresinin görünmesi için Çok noktalı araca çift tıklayın. Sayılan hücre görselleştirmesini kolaylaştırmak için Etiket noktaları seçeneğini kaldırın. Daha sonra, saymaya başlamak için bir Purkinje hücresinin soma üzerine doğrudan tıklayın (Şekil 1E). Sayılan hücrelerin toplam sayısı Nokta Aracı penceresinin alt kısmında gösterilir (Şekil 3). NOT: Genellikle hücre kültürü kesici uç başına 9-10 lobül içeren en az 3 hasarsız bölüm ölçülebilir. Farmakolojik bir ajanın nöroprotektif etkisini değerlendirmek için en az 3 bağımsız deney yapılmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Confocal+Imaging+of+Migrating+Neurons+in+Organotypic+Slice+Culture+of+Embryonic+Mouse+Brain+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55886(2017).</li>
<li>Daviaud, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+nigrostriatal+degeneration+in+organotypic+cultures%2C+a+new+ex+vivo+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease.</a> Neuroscience. 256, 10-22 (2014).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone+%28RU486%29+protects+Purkinje+cells+from+cell+death+in+organotypic+slice+cultures+of+postnatal+rat+and+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).</li>
<li>Labombarda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+by+steroids+after+neurotrauma+in+organotypic+spinal+cord+cultures%3A+a+key+role+for+progesterone+receptors+and+steroidal+modulators+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors.</a> Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor-sensitivity+of+astrocytes+and+neurons+in+the+substantia+gelatinosa+of+organotypic+spinal+cord+slices+of+the+mouse+depends+on+the+length+of+the+culture+period%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period.</a> Neuroscience. , 195-207 (2017).</li>
<li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li>
<li>Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+purkinje+cell+death+is+spatiotemporally+organized+in+the+developing+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Bcl-2+and+Caspase-3+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%3A+an+in+vitro+model+to+study+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis.</a> European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+kinase+C+prevents+Purkinje+cell+death+but+does+not+affect+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).</li>
<li>Ghoumari, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+mifepristone+involves+neuron+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization.</a> FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).</li>
<li>Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+%28JNK%29+and+p38+play+different+roles+in+age-related+Purkinje+cell+death+in+murine+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture.</a> Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).</li>
<li>Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Is+Required+for+the+Neuroprotective+Effect+of+Mifepristone+on+Immature+Purkinje+Cells+in+Cerebellar+Slice+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Uesaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+coculture+preparation+for+the+study+of+developmental+synapse+elimination+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain.</a> Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).</li>
<li>Falsig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+pathogenesis+is+faithfully+reproduced+in+cerebellar+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985(2012).</li>
<li>Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+loss+of+the+ability+of+Purkinje+cells+to+regenerate+their+axons+occurs+in+the+absence+of+myelin%3A+an+in+vitro+model+to+prevent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination.</a> Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).</li>
<li>Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+waves+in+granule+cells+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).</li>
<li>Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+excitatory+amino+acids+of+Purkinje+cells%27+and+neurones+of+the+deep+nuclei+in+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells' and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures.</a> Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Serebellar dilim kültürü, doğum sonrası gelişim sırasında programlanmış Purkinje hücre ölümünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Ana avantajı kurulum basit ve çok uygun maliyetli olmasıdır, ve sadece ekipman mütevazı bir yatırım gerektirir (bir vibratom kadar mal olabilir 3 kat daha fazla bir doku helikopteri). Ayrıca, 10 ila 15 sağlıklı dilimler bir fare yavrusu ndan oluşturulabilir, böylece tek bir hayvan kullanılarak par...

In vitro modelleme biyomedikal araştırmalarda önemli bir araçtır. Araştırmacıların kısıtlı hücre tiplerinde veya izole sistemlerde/organlarda belirli mekanizmaları incelemesine ve sıkı bir şekilde kontrol etmesine olanak tanır. Organotipik dilim kültürü özellikle nöroloji alanında in vitro tekniğinde yaygın olarak kullanılan bir kültürdür1. Yöntem ilk Gähwiler tarafından kuruldu, kim roller tüptekniği2 kullanarak beyin dilimleri kültürlü , ve daha sonra Yamamoto ve ark tarafından modifiye, kortikal dilim kültürleri gerçekleştirmek için mikrogözenekli membran kullanımı tanıttı3. Birincil hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim kültürleri doku sitomimarisinin yanı sıra doku bölümünün düzleminde yerli hücre-hücre bağlantılarını koruma avantajını sunar.
Organotipik dilimler merkezi sinir sisteminin birçok yerinden kültürlü olmuştur, hipokampus gibi4, korteks5, striatum6, beyincik4,7, ve omurilik8,9, diğerleri arasında. Onlar ilaç keşif çalışmalarında güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır10. Nöroaktif moleküllerin etkileri birçok şekilde değerlendirilebilir: immünboyama ve biyokimya testleri kullanılarak sağkalım ve nörodejenerasyon, nöronal devre oluşumu, ya da elektrofizyoloji ve canlı görüntüleme kullanarak bozulma.
Bu çalışmanın amacı, in vitro serebellar gelişimi taklit etmek için ilgili bir model olduğu bilinen organotipik serebellar dilim kültürü gerçekleştirmek için basit bir yöntem tanımlamaktır. Özellikle Purkinje hücre gelişimsel ölümü üzerine yoğunlaştık. In vivo, Purkinje hücreleri ilk doğum sonrası hafta boyunca apoptoz geçmesi, postnatal gün 3 pik (P3)11. Aynı desen serebellar dilim kültüründe gözlenir, Cerebella P1 ve P8 arasında hayvanlardan alındığında Purkinje nöronlar apoptosis tarafından ölüyor, P3 bir tepe ile4,12. Organotipik serebellar dilim kültürlerin kullanımı çeşitli nöroprotektifmolekülleritanımlamak için izin verdi 7,13, yanı sıra bu programlanmış hücre ölümü dahil mekanizmaların bir kısmını anlamak14,15,16. Burada, Hipokampus Stoppini ve ark.17 çalışmasına dayalı bir protokol tarif ve Dusart ve ark.4 Tarafından beyincik adapte bu hızlı diseksiyon ve postnatal serebella doğrama içerir; nöroprotektif tedavi li veya olmadan, mikrogözenekli membran içeren bir hücre kültürü eklemek üzerine dilimleme kültürü; ve nöronal sağkalımı değerlendirmek için immünoresans boyama.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Eşek anti-Fare IgG ikincil antikoru</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>A21203</td><td></td></tr><tr><td>Bazal Orta Kartal (BME)</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>21010046</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik kabini Sınıf II, Tip A2</td><td>NuAire</td><td>NU-540-400</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fırça</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Calbindin D-28K antikoru (CB-955)</td><td>Abcam</td><td>ab82812</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü</td><td>NuAire</td><td>NU-5700</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Düz Tabanlı 6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Lamel, 22 x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Pansuman forsepsleri, düz</td><td>Harvard Aparatı</td><td>72-8949</td><td></td></tr><tr><td>Çift kenarlı bıçaklar</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949411</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon Labs, Inc</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Göz Makası, düz</td><td>Harvard Aparatı</td><td>72-8428</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-127</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 100X</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>25030149</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz çözeltisi</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>H21492</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu, ısı ile etkisiz hale getirilmiş, Yeni Zelanda menşeili</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Doku Doğrayıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9914528</td><td></td></tr><tr><td>Mikroproblar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-850</td><td></td></tr><tr><td>Milicell Hücre Kültürü Uçları</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Hızlı Akışlı PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri, 250 mL</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R konfokal lazer mikroskop sistemi</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Görüntüleme Yazılımı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Acros Organics</td><td>41678-0010</td><td></td></tr><tr><td>Pastör pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Altın Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Çalıştırma Makası, düz</td><td>Harvard Aparatı</td><td>72-8403</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı Dansöz</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRLS0003</td><td></td></tr><tr><td>Prizma 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı, 60 mm kavrama halkalı</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012921</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü plakası, 24 kuyulu</td><td>Falcon / Corning</td><td></td><td></td>353047</tr><tr><td>Transfer pipetleri, steril</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>13-711-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

organotipik serebellar dilim kültürlerde purkinje hücre sağkalım

Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Organotipik dilim kültürü, vivo koşullarda ayrışmış birincil hücre kültürlerinden daha yakından taklit eden güçlü bir in vitro modeldir. Erken doğum sonrası gelişiminde, serebellar Purkinje hücrelerinin programlanmış hücre ölümü sırasında savunmasız bir dönemden geçtiği bilinmektedir. Burada, bu kritik dönemde fare organotipik serebellar dilim kültürünü gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Dilimler purkinje hücre sağkalım ve nöroprotektif tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için daha fazla etiketlenir. Bu yöntem yeni nöroaktif molekülleriçin ekran için son derece değerli olabilir.

Şekil 4'tegösterildiği gibi, bu protokol, purkinje hücre sağkalımının immünfloresans ve görüntü edinim adımlarından sonra değerlendirilebileceği organotipik serebellar dilim kültürleri üretmektedir. Purkinje hücreleri anti-Calbindin D-28K (seyreltme 1/200) ve Alexa594 anti-fare (seyreltme 1/300) antikorları kombinasyonu ile etiketlenmiştir. Görüntü dikiş otomatik olarak mikroskop satın alma yazılımı (NIS-Elements) tarafından tüm serebellar dilim bir resim elde etmek için yapıldı. Purkinje di...

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Organotypic slice culture is a powerful in vitro model that mimicks in vivo conditions more closely than dissociated primary cell cultures. In early ...

Organotipik dilim kültürü nörogelişimsel ve dejeneratif veya rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Doku seti mimarisi ve doğal hücre-hücre bağlantıları bölümlerin düzlemleri içinde korunduğundan, bu yöntem, ayrışmış birincil hücre kültürlerine kıyasla invivo koşullarda yakından taklit eder.Burada gelişmekte olan beyincik Purkinje hücre ölümü çalışma göstermektedir. Ama organotipik dilim kültürü eşit hemen hemen her merkezi sinir sistemi bölgesinde nörodejeneratif hastalıkların modellemek için uygundur. Jennifer Rakotomamonjy ile prosedürü gösteren Sean McDermott, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.Serebellar dilimhasat önce, sterilleştirilmiş bir biyogüvenlik kabininde, vakum filtreli kültür ortamı bir mililitre ile altı kuyukültür plaka her kuyu doldurun ve tedavi kuyuları ilgi farmakolojik ajan ekleyin, ve kontrol kuyuları araç eşit hacimli. Steril forsepskullanarak, her kuyuya 0,4 mikrometre lik gözenek boyutunda PTFE membran filtre yerleştirin, her bir membran ın ve ortamın arabirimindeki kabarcıkları önlemeye özen gösterir ve ortayı 37 derece santigrat ve

purkinje-cell-survival-in-organotypic-cerebellar-slice-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Bu video, bir fare yavrusunun beyninden serebellar organotipik dilimler elde etmek ve bu dilimleri in vitro  serebellar gelişimi taklit etmek için besinler ve büyüme faktörleriyle desteklenmiş ortamda kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.Ek olarak, spesifik serebellar dilimler bir test bileşiği ile muamele edilir ve bileşiğin nöroprotektif yeteneği bir immünofloresan boyama tekniği kullanılarak analiz edilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerinde Purkinje Hücre Sağkalımının Analizi

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

Bu yazıda, hücresel replasman tedavilerini test etmek için ex vivo bir model olarak nöral kök hücrelerle nakledilen uzun süreli omurilik organotipik dilimleri oluşturmak ve sürdürmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz.

Omurilik Yaralanmasında Hücre Transplantasyonunu Doğrulamak için Bir Platform Olarak Uzun Süreli Fare Omurilik Organotipik Dilim Kültürü

Serebellar Purkinje hücreleri (PC'ler), DNA hasar yanıtındaki eksikliklere karşı özellikle hassastır. SEREBELLAR organotipik kültürler içinde proteine bağlı poli (ADP-riboz) zincirlerinin boyanmasını içeren, DNA hasarına PC yanıtının dinamiklerinin görsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi

Keşfedin organotipik serebellar dilim kültürleri kullanarak farede Purkinje hücre ölümünü modelleme yöntemini. Bu teknik sinir koruyucu ilaç taraması için in vivo benzeri koşullar sağlar.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Daha fazla video keşfet