Name: Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Öğrenin, demir sınırlı koşullarda Mycobacterium tuberculosis kültürü ve ekstrasellüler vezikül izolasyonu yöntemini. Bu protokol, biyokimyasal analizler için yüksek saflıkta membran vezikülleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rafael Prados-Rosales'e nanopartikül izleme analizi ni gerçekleştiren anti-MEV antisera ve Navneet Dogra'yı paylaştığı için minnettarız.

1. Demir Tükenmiş Tanımlı Ortamın Hazırlanması
<ol><li>5 g KH2PO4,5 g L-asparagin, 20 mL gliserol ve plastik bir kapta 900 mL deiyonize su da dekstroz 2 g dekstroz eriterek minimal orta (MM) 1 L hazırlayın. Demir kontaminasyonunu önlemek için camdan kaçının. PH'ı 5 N NaOH ile 6,8'e, hacmi ni suyla 1 L'ye ayarlayın.</li>
	<li>50 g metal şelin reşaden (MCR) ekleyin ve 4 °C'de 24 saat boyunca manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak hafifçe çalkalayın. Plastik alıcılı 0,22 μm filtre ünitesi nden sızma yoluyla MCR'yi sterilize edin ve çıkarın. Filtrasyonu hızlandırmak ve filtre tıkanmasını önlemek için, rezorbsün filtrasyondan önce yaklaşık 30 dakika boyunca tortulanmasına izin verin. NOT: Bu ortam, atomik absorpsiyon spektroskopisi ile belirlenen 2°M'den az demir içerir.</li>
	<li>ZnCl 0.5 mg/L ile ek MM2,MgSO4 4 4 mg/L, mnSO40.1 mg/L . Ayrıca, deiyonize suda metal takviyeleri her konsantre stokları (1.000x) hazırlamak ve MM takviyesi önce filtrasyon ile sterilize. Demir-tükenmiş, metal takviyeli MM burada düşük demir MM (LIMM) olarak anılacaktır.</li>
	<li>10 mM HCl'de çözünmüş 50 mM'lik FeCl3 stoğundan, yüksek demir MM (HIMM) hazırlamak için 1 mL ila 1 L LIMM (50 μM son konsantrasyon) ekleyin.</li>
</ol>2. Demir Sınırlı Koşullarda Büyüyen Mikobakteriler
<ol><li>Mtb dondurulmuş% 15 gliserol stok 50 μL ve çizgi bir agar plaka% 10 ADN zenginleştirme ile desteklenmektedir (5 g / L albumin, 2 g / L dekstroz, ve 0.85 g / L sodyum klorür, 0.2% gliserol ve 0.05% Tween-80)10. Koloniler görünene kadar plakayı 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>ADN zenginleştirme ile desteklenen mikobakteriyel et suyu ortamının(Malzeme Tablosu)2 mL'lik Mtb10 kolonisini aşılayınız. 37 °C'de ajitasyon ile kuluçka.</li>
	<li>Mtb kültürü geç logaritmik faz (OD540 ~ 0,8) büyümeye izin verin. Bunu kontrol etmek için, bir spektrofotometre kullanarak OD540 ölçün.</li>
	<li>Geç logaritmik kültürün 200 μL'lik kısmını mikobakteriyel agar plakalarına(Malzeme Tablosu)%0.2 gliserol, %0.05 Tween-80 ve ADN ile desteklendi. En az 5 tabak aşılamak. Bakteri üremesi enfluent bir tabaka olarak görülene kadar plakaları 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bu Mtb için ~ 1 hafta sürer.</li>
	<li>LIMM'de steril pamuklu bir bez isledin. Agar plakalarından bakteri toplamak ve 100 mL LIKM aşılamak için bu bezi kullanarak ~1.0'lık Bir OD540 ile konsantre bakteriyel süspansiyon hazırlayın.</li>
	<li>Bu süspansiyonu LIMM ile 10 ila 1 L arasında seyreltin ve her biri 500 mL kültür içeren iki, 2 L steril plastik şişeye bölün.</li>
	<li>2 mL kültür alın ve 5 mL kültür tüpüne aktarın. %10 vol/vol tyloxapol 10 μL ekleyin.</li>
	<li>Kültürleri 37 °C'de 14 gün bekletin.</li>
</ol>3. MEVs koleksiyonu
<ol><li>Toplama sırasında 2 mL kültürün OD540'ı ölçün. ADN ve%0.05 Tween-80 ile agar plakalar üzerinde kültür ve plaka 100 μL her seyreltme 1:10 seri seyreltme olun.</li>
	<li>Kültürü 20 °C'de 7 dk için 2.850 x g'da beş 225 mL konik santrifüj tüpve santrifüje aktarın.</li>
	<li>50 mL'lik pipetle kültür supernatant'ını toplayın ve filtre yi 0,22 μm'lik bir filtre ünitesi nden sterilize edin.</li>
</ol>4. MEV'lerin İzolasyon
<ol><li>Kültür filtrasyonunu 4 °C'de yerleştirilen bir pil ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve 100 kDa kesme membranından <50 psi'deki konsantreyi ~50 mL'ye filtreleyin.</li>
	<li>Konsantre kültürü 15.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin ve süpernatant toplayın.</li>
	<li>Polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinde 4 °C'de 2 saat için 100.000 x g'de kültür filtrasyonunu santrifüj edin.</li>
	<li>Membranöz peletleri toplam 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) şeklinde hassas pipetleme ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Adım 4.4'te elde edilen pelet süspansiyonunun 0,5 mL'sini %60 iodixanol çözeltisi ile karıştırın ve %45 wt/vol son iyodixanol konsantrasyonu elde edin.</li>
	<li>MEV-iodixanol%45 süspansiyonu 1 mL %40, %35, %30, %25 ve %20 (PBS'de vol/vol) iodixanol çözeltileri ve 1 mL PBS ile üstte yer akıtın.</li>
	<li>4 °C'de 18 saat için 100.000 x g santrifüj.</li>
	<li>1 mL Hamilton şırıngası kullanarak üstten başlayarak 1 mL yoğunluk gradyan fraksiyonları toplayın.</li>
	<li>Toplanan her bir fraksiyonu 20 mL'ye, PBS ile 20 mL'ye seyreltin ve 4 °C'de 2 saat için 100.000 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Supernatant çıkarın ve PBS 0,5 mL pelet askıya. Bu peleti 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. MEV'lerin Nicelleştirilmesi
<ol><li>Üreticinin yönergelerini izleyerek, her fraksiyondaki protein konsantrasyonunu bir Bradford tonu(Malzeme Tablosu)ile ölçün.</li>
	<li>
Membran lipid analizi yapın.
	<ol>
<li>Floresan membran probu 1-(4-Trimethylamonniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Heksatriene p-Toluenesulfonat (TMA-DPH) ile her degrade fraksiyonun 10 μL inkübat 10 μL pBS son 50 μL hacmi nde 96 iyi siyah Plaka.</li>
		<li>Plakaları 33 °C'de 20 dk kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Floresan'ı 360 nm uyarma ve 430 nm emisyonda ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. MEV'lerin nitel analizi
<ol><li>
Protein elektroforezi gerçekleştirin.
	<ol>
<li>16°L'de yaklaşık 1 μL'lik MEV numunelerini 4 μL 5x numune yükleme tamponu (%10 w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, %20 v/v gliserol 0,2 M Tris-HCl, pH 6.8 0.05% w/v bromophenol mavi) ile karıştırın ve numune tamponunda numune tamponunda 85 °C'de 85 °C'de ısıtın.</li>
		<li>%10 Tris/Glisin SDS-poliakrilamid jel11 yükve çalışan tampon (25 mM Tris baz, 190 mM glisin, 0.1% SDS) çalıştırın mavi boya ön jel in altına ulaşana kadar.</li>
		<li>Jeli ultrahassas bir protein boyama solüsyonu(Malzeme Tablosu)ile lekele.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nokta lekesini gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Yaklaşık 0,5 g/μL konsantrasyonu olan bir MEV süspansiyonunun 2 μL'sini ve bir nitroselüloz membranüzerinde iki kat seri seyreltme ler yükleyin ve üreticinin talimatlarına göre nokta lekesi için proses yapın.</li>
		<li>Birincil antikor ve bir keçi anti-fare horseradish peroksidaz (HRP) birleştiğinde 1:10.000 ikincil antikor olarak bir seyreltme olarak 1:5.000 bir seyreltme mevs bir hazırlık karşı farelerde yükseltilmiş bir antiserum kullanın. Uygun bir HRP substrat Blotting Algılama Reaktifi ve görüntüleme sistemi ile antijen-antikor komplekslerini sapta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Negatif boyama ve elektron mikroskobu gerçekleştirin.
	<ol>
<li>250 μL'lik MEV'leri %2 glutaraldehit ile 0,1 M oda sıcaklığında 2 saat kacodylate ve gece boyunca %4 formaldehit, %1 glutaraldehit ve %0,1 PBS'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>90 dk için% 2 osmiyum tetroksit ile sabit örnekleri leke.</li>
		<li>Seri etanol örnek dehydrate ve Spurr epoksi reçine gömmek.</li>
		<li>Bir iletim elektron mikroskobu altında MEVs gözlemleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li>
<li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li>
<li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li>
<li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Pst%2FSenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778(2018).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731(2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li>
<li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064(2012).</li>
<li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+E+%22Antibodies.+A+laboratory+manual%22">Antibodies. A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1988).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yok.

Ökaryotik hücre kaynaklı ekzozomları arındırmak için birden fazla yöntem geliştirilmiştir12. Buna karşılık, bakteri kaynaklı EVs7arındırmak için etkili yöntemler hakkında sınırlı bilgi vardır. Mtb kaynaklı EV'lerin verimli bir şekilde izole edilmesi, bu patojenik mikobacterium'un yetiştirimindeki içsel zorlukları göz önünde bulundurmak gerekir. Mtb uzun bir bölünme süresine sahiptir (~24 saat) ve biyogüvenlik seviyesi üç (BSL-3) koşullarda kullanılmalıdır. Bu nedenle, MEV i...

Mikobakteriyel ekstrasellüler (MEV) membrana bağlı nano taneciklerdir, 60−300 nm boyutundadır, doğal olarak hızlı ve yavaş büyüyen mikobakteriler tarafından serbest bırakılır1. Patojenik mikobakteriler tarafından salınan MEV'ler, immünolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve konsantre ve korunan bir şekilde salgılanan glikolipidler aracılığıyla konakla etkileşimedebilen bir mekanizma oluşturur2,3,4. MEVs karakterize etmek ve biyogenez ve işlevlerini anlamak için, vezikül arınma ve doğrulama sıkı ve verimli yöntemler çok önemlidir. Şimdiye kadar, MEVs bir demir açısından zengin orta1,5,6,7,8yetiştirilen mikobakterilerin kültür filtrates izole edilmiştir.
Ancak, önceki çalışma demir sınırlama büyük ölçüde Mtb vezikül salınımını uyarır gösterdi, muhtemelen mycobactin üzerinden demir yakalamak için, MEVs salgılanan bir siderophore9. Yüksek demir ortamda yetiştirilen Mtb'lerden MEV izolasyonu prosedürleri tanımlanmış olsa da, düşük demir kültürlerinden MEV elde etmek için etkili bir metodoloji bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, biyokimyasal ve fonksiyonel tahliller ve mikobakterilerde vezikül üretiminin genetik belirleyicilerinin analizi için kullanılabilmesi için düşük demir kültürlerinden elde edilen MEV'leri izole etmek, arındırmak ve ölçmektir.

<table><tbody><tr><td>Amicon karıştırılmış hücre Model 108</td><td>EMD Milipore</td><td>UFSC40001</td><td>Hücresi Ultrafiltrasyon sistemi</td></tr><tr><td>BD Polipropilen 225 mL konik tüpler</td><td>Fisher</td><td>05-538-61</td><td>Konik santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>Biomax 100 kDa kesme ultrafiltrasyon membranı</td><td>EMD Milipore PBHK07610</td><td></td><td>Ultrafiltrasyon membranı</td></tr><tr><td>Chelex-100 reçine</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2842</td><td>Metal şelatlama reçinesi</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD Difco</td><td>262710</td><td>Mikobakteriyel Agar plakaları</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Et suyu</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Mikobakteriyel et suyu ortamı</td></tr><tr><td>Nitro selüloz lekeleme membranı</td><td>GE Healthcare</td><td>10600001</td><td>Kurutma Membranı</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>İodiksanol</td></tr><tr><td>Polikarbonat ultra santrifüjleme tüpler 25 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>355618 Polikarbonat ultra santrifüj tüpleri 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>Polipropilen ince cidarlı santrifüj tüpü 13 mm x 15 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>Polipropilen ince cidarlı santrifüj tüpü 13 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Protein Tahlil boyası</td><td>BioRad</td><td>5000006</td><td>Bradford Protein Boyama</td></tr><tr><td>SYPRO Yakut</td><td>Moleküler Problar</td><td>S12000</td><td>Ultra hassas protein lekesi</td></tr><tr><td>TMA-DPH</td><td>Moleküler Problar</td><td>T204</td><td>1- (4-Trimetilamonyumfenil) -6-Fenil-1,3,5-Hekzatrien p-Toluensülfonat</td></tr><tr><td>Vakum filtrasyon şişeleri</td><td>CellPro</td><td>V50022</td><td>Filtre Ünitesi</td></tr></tbody></table>

demir sınırlı mycobacteria tarafından üretilen ekstrasellüler veziküllerin İzolasyon ve karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mikobakteriler, Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere (Mtb), insan tüberkülozunun nedensel ajan, doğal olarak immünolojik olarak aktif moleküller içeren ekstrasellüler veziküller (EVs) serbest. Vezikül biyogenezinin moleküler mekanizmaları, veziküllerin içeriği ve patojen-konak arabirimindeki fonksiyonları hakkında bilgi çok sınırlıdır. Bu soruların ele alınması, eVs'lerin yalıtımı, saflaştırılması ve doğrulanması için sıkı prosedürler gerektirir. Daha önce, M. tüberküloz demir kısıtlamasına maruz kaldığında vezikül üretiminin artırılmış olduğu bulunmuştur, ev sahibi ortamda Mtb'nin karşılaştığı bir durum. Burada sunulan demir eksikliği mikobakterilerden EVs izole etmek ve arındırmak için tam ve ayrıntılı bir protokoldür. Arındırılmış EVs doğrulamak için nicel ve nitel yöntemler uygulanır.

MEV'ler bir yoğunluk gradyanda diferansiyel sedimantasyon ile saflaştırılmıştı (Şekil 1, Şekil 2). Açıklanan koşullar altında, MEVs çoğunlukla degrade kesir 3 (F3), hangi% 25 iodixanol karşılık ayrılmıştır. Bu sonuç protein, membran lipid, bozulmamış MEV'lerin mikroskobik görüntülemesi, nanopartikül boyut dağılımı ve antivezile antiserum ile pozitif reaktivitenin saptanması üzerine kuruludur(Şekil 2,...

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Bu yöntem, düşük demir koşullarında Mycobacterium tuberculosis'in kültürlendirilmesine ve membran veziküllerinin düşük demir kültürü filtratından arındırılmasına izin verir. Demir sınırlama membran vezikül üretimini teşvik etmek için bilinen olduğundan, bu protokol daha fazla biyokimyasal veya fonksiyonel tahliller için kullanılabilir saf membran veziküller yüksek bolluk verir. Biz Mycobacterium smegmatis kullanarak protokolü göstermek, nonvirulent suşu, Bu protokol Mycobacterium tuberculosis kullanarak BSL-2 tesislerinde takip edilebilir, öldürücü suşu.Başlamak için, monopotasyum fosfat beş gram eriterek minimal orta bir litre hazırlamak, L-asparagine beş gram, gliserol 20 mililitre, ve dextrose iki gram plastik bir kapta deiyonize su 900 mililitre. Beş normal sodyum hidroksit ile pH'ı 6,8'e ayarlayın ve hacmi deiyonize suyla bir litreye ayarlayın. Sonra metal şelat rekarne 50 gram ekleyin ve yavaşça dört derece santigrat 24 saat boyunca bir manyetik karıştırma çubuğu kullanarak çalkalayın.Ertesi gün, karıştırma durdurmak ve yaklaşık 30 dakika resinyon tortu sağlar. Plastik alıcılı 22 mikron filtre ünitesi nden filtrasyon yaparak kalan reçiyiyi sterilize edin ve çözeltiden çıkarın. Şimdi, çinko klorür litre başına 0.5 miligram ile ek minimal orta, magnezyum sülfat litre başına 40 miligram, ve manganez sülfat litre başına 0.1 miligram.ADN zenginleştirme ile desteklenen mikobakteriyel et suyu orta iki mililitre MTB tek bir koloni aşılamak. 37 santigrat derecede ajitasyon la kuluçkaya yat. Görünür büyüme olduğunda, kültürün iki mililitresini ayıklayın ve OD 540'ı spektrofotometrede ölçün.OD 540 0.8'e ulaştığında geç logaritmik fazı gösteren kuluçkayı durdurun. 0.2 gliserol, %0.5 Tween 80 ve ADN ile desteklenen mikobakteriyel agar plakaları üzerine geç logaritmik kültürün 200 mikrolitre yayılır. En az beş tabak aşılamak.Plakaları 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ve bir hafta sonra, bakteri üremesi bir konfluent tabaka olarak görülebilir. Sonra düşük demir minimal ortamda steril bir pamuklu bez ıslak.Agar plakaları bakteri toplamak için bu bezi kullanın. Bakterileri 100 mililitre düşük demir minimal media ile bir tüpe aşılamak. Bir OD 540 bir süspansiyon hazırlamak için yeterli bakteri toplamak.Düşük demir minimal orta ile bir litre süspansiyon 10 kez seyreltin ve iki steril plastik şişe içine bölün. Sonra, kültürün iki mililitresini beş mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın. Hacim tyloxapol tarafından% 10 hacim10 mikrolitre ekleyin.Kültürleri 14 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kültürü 20 santigrat derecede yedi dakika boyunca 2, 850 kez g'de beş adet 225 mililitrelik konik santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. 50 mililitrelik pipet ile kültür supernatant toplamak ve filtre 0,22 mikron filtre ile sterilize.MEV'leri izole etmek için, kültür filtrasyonunu dört santigrat derecede yerleştirilen karıştırılmış bir hücre ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve konsantreyi 100 kilodalton kesme membranından 50 PSI'den daha düşük bir basınçta filtreleyin. Sonra 15, 000 kez g dört santigrat derece 15 dakika ve polikarbonat ultrasantrifüj tüplerde supernatant toplamak konsantre kültür filtrasyon santrifüj. Supernatant'ı 100,000 kez g'de dört santigrat derecede iki saat için santrifüj edin.Bundan sonra, supernatant çıkarın ve nazik pipetleme ile steril PBS toplam bir mililitre membranöz pelet resuspend. Bir polipropilen ince duvarlı ultracentrifuge tüp altında% 60 iodixanol çözeltisi 1.5 mililitre ile pelet süspansiyon 0.5 mililitre karıştırın. Bindirme bu MVE iodixanol 45%süspansiyon bir mililitre ile 40%35%30%25 ve 20% iodixanol çözeltileri ve üst PBS bir mililitre.Santrifüj 100, 000 kez g 18 saat boyunca 4 santigrat derece. Sonra, üstten başlayarak bir mililitre yoğunluk gradyan kesirleri toplamak için bir mililitre Hamilton şırınga kullanın. PBS ve santrifüj ile 20 mililitre ye kadar toplanan fraksiyonu 100, 000 kez g iki saat boyunca dört santigrat derecede seyreltin.Supernatant çıkarın ve PBS 0,5 mililitre resuspend. Tüpleri dört santigrat derecede saklayın. Membran lipid analizi yapmak için, 96-iyi siyah plaka her kuyuda PBS 50 mikrolitre mililitre başına bir mikrogram son konsantrasyonda floresan membran probu TMA-DPH ile her degrade fraksiyonu 10 mikrolitre birleştirir.Plakaları 33 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Floresan'ı uyarma için 360 nanometre ve emisyon için 430 nanometre olarak ölçün. Bu protokolde, MEV'ler yoğunluk gradyandisinde diferansiyel sedimantasyon ile saflaştırılmıştı.Açıklanan koşullar altında, MEV'ler çoğunlukla %25 iyodixanol'e karşılık gelen üç. Vezikül ilişkili proteinler nokta lekesi analizi ile gösterilen kesir üç oranında yoğunlaşmıştır. Negatif boyama da üçüncü kesirde MEV'lerin varlığını doğruladı ve nanopartikül analizi MEV boyutunun 100 nanometre civarında olduğunu gösterdi.Koloni oluşturan birimlere normalleştirilen protein ve lipid konsantrasyonu, yüksek demir koşullarına göre düşük demirde MEV veriminde yaklaşık sekiz kat artış gösterdi. Nokta blot analizi, demir sınırlı MTB kültüründen yoğunluk gradyan fraksiyonlarında MEV ile ilişkili belirteçlerden gelen daha yoğun bir sinyalin demir yeterli MTB kültürlerinden daha fazla olduğunu göstermiştir. Demir sınırlı koşulları sağlamak ve membran veziküllerinin lipoprotein agregaları ile kirlenmesini önlemek için minimal ortamın hazırlanması için talimatları uygulayın.Bu şekilde saflaştırılan mikobakteriyel membran veziküller biyokimyasal karakterizasyon ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-produced-iron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Gupta, S., ve diğerleri. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, demir stresini indüklemek ve bakterilerin hayatta kalmasını destekleyen sideroforların salgılanmasını teşvik etmek için Mycobacterium tuberculosis'in demir sınırlı koşullar altında kültürlenmesi prosedürünü göstermektedir.

Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

Kaynak: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Demir Sınırlı Mikobakteriler Tarafından Üretilen Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, konakçı ortamı taklit eden demir sınırlayıcı koşullar altında kültürlenen Mycobacterium tuberculosis'ten hücre dışı veziküllerin (EV'ler) aşamalı izolasyonunu göstermektedir. EV içeren fraksiyonları zenginleştirmek ve tanımlamak için ultrafiltrasyon, diferansiyel santrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ayırmanın kullanımını...

Mycobacterium tuberculosis'ten Siderofor İçeren Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Bu videoda, beyin bağışıklık hücrelerinden (mikroglia) türetilen hücre dışı vezikülleri veya EV'leri izole etmek için boyut dışlama kromatografisine (SEC) dayalı bir yöntem açıklanmaktadır. EV'ler, bir bağışıklık tepkisini düzenleyen aracıları iletmek için moleküler kargo görevi görür. Bu nedenle, izole edilmiş EV'ler, bir nöronal bağışıklık tepkisi sırasında mikroglia-nöron karışmasını incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir.

Mikroglia Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin SEC Tabanlı İzolasyonu: Mikroglia Şartlandırılmış Kültür Ortamından Hücre Dışı Vezikülleri İzole Etme Tekniği

Bu video, Mycobacterium tuberculosis'in (Mtb) kültür süzüntüsünden bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) saflaştırmak için boyut dışlama kromatografisi (SEC) tekniğini göstermektedir. Teknik, EV'lerin saflaştırılmış fraksiyonlarını elde etmek için gözenekli reçine dolgulu bir kolon kullanır. Gözenekli parçacıklar seçici olarak daha küçük proteinlerin gözeneklere girmesine izin vererek daha yavaş elüsyona neden olur. Aynı zamanda, EV'lerin daha büyük boyutları nedeniyle gözeneklere girmesi...

Mikobakteriyel hücre dışı vezikülleri saflaştırmak için bir boyut dışlama kromatografisi tekniği

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu protokol, Mycobacterium tuberculosis hücre dışı veziküllerini kültür süpernatantlarından zenginleştirmek için kolay ve tekrarlanabilir bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini tanımlar.

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Öğrenin, demir sınırlı koşullarda Mycobacterium tuberculosis kültürü ve ekstrasellüler vezikül izolasyonu yöntemini. Bu protokol, biyokimyasal analizler için yüksek saflıkta membran vezikülleri sağlar.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet