Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması
October 6th, 2019
Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.
Çekiş kuvveti mikroskobu hücre tarafından oluşturulan kuvvetleri ölçmek için kullanılır. Bu protokol, deneyimsiz kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirmek için çekiş gücü verilerinin toplama analizini kolaylaştırır. Mevcut referanssız çekiş kuvveti mikroskobik platformlar azerindebu tekniğin en büyük avantajı, multifoton litografinin bireysel deneysel ihtiyaçlara göre hızlı ve kolay desenleme ayarı yeniden tasarlamasına olanak sağlamasıdır.
Bu yeni referanssız çekiş platformunun oluşturulması nda ve uygulanmasında, yalnızca metin yerine görsel gösterim yoluyla anlaşılması daha kolay birçok önemli adım vardır. Baz hidrojel fotopolimerizasyonu için, ilk perfloroalkoxy alkanlar ince, düz levha üzerine pre-polimer solüsyon üç mikrolitre ekleyin ve düz yerleştirin 150 mikrometre kalınlığında PDMS şeritler çevreleyen, ancak temas değil, ön polimer çözelti damla. PDMS'nin üzerine, ön polimer damlacık kapağının altına ortalanmış ön polimer damlacıkile PDMS boşluklarının kalınlığına kadar polimer öncesi damlacık düzleştirin.
Sandviç öncesi polimer çözeltisini UV ışığına yaklaşık bir dakika maruz bırakın. Bir hidrojel tam olarak oluştuğunda, kapak kaymasını PDMS boşluklarından dikkatlice ayırın. Kapak kayma açık bir alt Petri çanak takmak için yüksek performanslı çift taraflı akrilik yapıştırıcı kullanın.
Hidrojel yüklü kapak kaymasını Petri kabına yapıştırırken özel dikkat edin. Uygulama sırasında ıslak bir çanak veya çok az basınç sızıntıları oluşturmak için izin verir, örnek berbat. Kapağı, yapıştırıcı ve Petri kabı arasında tam bir mühür oluşturmak için yapışkan temas yüzeyine basınç uygulayın ve camı kırmamaya özen tinleyin.
Hidrojeli durulamak için steril filtrelenmiş PBS kullanın. Daha sonra hidrojel sentezi için hazırlanan laboratuvar çözeltisinin 800 mikrolitresine sekiz mikrolitre NVP ekleyin. İkili görüntüyü dijital maskeye dönüştürmek için MATLAB'ı açın ve runscript'i açıp çalıştırın.
m MATLAB komut dosyası. Dönüştürme için ikili TIF dosyasını seçin ve bölgenin dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Seçilen görüntünün mikronlarına istenilen son boyutu girdi.
Giriş görüntüsü bu parametrelere uyacak şekilde ölçeklendirilir ve boyutlandırılır. Tek bir piksel dizisi oluşturmak için, İlgi Alanı Jeneratör Seçenekleri Bölgesinde, Küçük Bölgeler/Tek Pikseller altında Kaldır tik kutusunun işaretlerini kaldırın, Kareler tik kutusunu işaretleyin ve Yatay Kesme Çizgileri altında Kullanımı işaretleyin. Ardından Tamam'ı tıklatın. OVL dosyası önceden belirtilen klasörde bulunur.
Mikroskop yazılımında dosyayı açın ve iki foton lazer tarama litografisi sırasında lazer panjur kontrol istenen bölgeleri yükleyin. Aşağıdaki adımlar en az ışık koşullarında yapılmalıdır. Düşük ışık koşullarında fiducial marker dizilerinin imalatı için, önceden hazırlanmış NVP laboratuvar çözeltisinin 200 mikrolitresini 20 miligram Alexa Fluor 633 ile iyice karıştırın ve hidrojel içeren çanaktan tüm PBS'yi çıkarın.
Peg-633 karışımını hidrojele, taban hidrojelini tamamen kapsayan bir damlacık olarak ekleyin ve Petri kabını mikroskop aşamasının numune tutucuya yükleyin. Daha sonra çanak kapağı ve desen çözeltisi en az 30 dakika boyunca hidrojel içine emmek için izin, ışıktan korunan. Görüntüleme için mikroskobu yapılandırmak için, Alexa Fluor 488'i görselleştirmek için uygun lazerleri ve filtreleri seçin.
PEG-488 sinyalini kullanarak hidrojeli bulun ve dedektörden daha uzun emisyon dalga boylarının toplanmasını engelleyin. XY düzleminde hidrojel in merkezini bulmak için dikey ve yatay karo taramaları kullanın ve bu pozisyonda ki aşamayı sıfır. Hidrojelin yüzeyini bulmak için Z-stack işlevindeki çizgi taramalarını kullanın ve bu konumdaki odağı sıfırla.
Yüzey konumunu belirlemek için xy merkezinden uzak çizgi taramaları tekrarlayarak hidrojel seviye, mikroskop aşaması için set vidaları ayarlayarak, gerektiği gibi. Mikroskop yazılımı çalışma alanı içinde, fotodesen için ayrı bir deneme dosyası oluşturun ve çoklu foton gücünü %1,8'e ve tarama hızını altıya ayarlayın. Piksel başına 0,1 mikrometre piksel boyutu ve 100'e bir en boy oranı elde etmek için görüntü çerçevesi nin ve piksellerin boyutunu ayarlayın ve bölgeler dosyasını bölgenin sekmesine yükleyin.
Z-stack işlevini elde etmek ve açmak için tüm bölgeleri ayarlamak için bir makro kullanın. Toplam derinliği 28 mikrometre ve toplam dokuz Z dilimi sayısı için aralığı 3,5 mikrometreye ayarlayın. Ardından, fiducial marker dizilerinin fotodesenli olacağı hidrojel üzerinde belirli konumları ayarlamak için Pozisyonlar işlevini kullanın.
Bekletme süresi 30 dakikalık hedefe yaklaştıkça, sıfırlanmış odak pozisyonuna göre yüzeyin konumundaki değişikliklere bağlı olarak şişme olup olmadığını kontrol etmek için her beş dakikada bir hidrojel yüzeyinin ardışık Z-stack çizgi taramalarını elde edin. Beş dakikalık aralıkta yüzey konumunda herhangi bir değişiklik meydana gelmemişse, desenayarlarını çalıştırın ve hidrojel yüzeyinin desenleme sırasında hareket etmediğini doğrulamak için 488 nanometre lazeri kullanın. Daha sonra hidrojeli mikroskoptan çıkarın, PEG-633 çözeltisini Petri kabından aspire edin ve kabı steril filtrelenmiş PBS ile durulayın.
Bir hücre ve fiducial marker görüntüleri elde etmek için, desenli alanları bulmak için Petri kabını örnek tutucuya döndürün. İlgi çekici bir hücre bulun ve hücrenin iletilen veya floresan görüntüsünü elde edin. Daha sonra gösterildiği gibi hücrenin altındaki desenli diziden bir Z-yığını edinin ve hücrenin ikinci bir iletilen veya floresan görüntüsünü elde edin.
Bir görüntü yığını toplarken, ortaya çıkan görüntüler, görüntü yığını içindeki Z konumunun bir fonksiyonu olarak yoğunlukta salınım yapan düzenli bir desenli özellik dizisi göstermelidir. İzleme. m komut dosyası, ön işleme kalitesini değerlendirmek için floresan fiducial işaretleyicilerin Z-projeksiyonu, algılanan santrioitlerin bir çizimi, nesne algılama kalitesini değerlendirmek için Z konumunun bir fonksiyonu olarak kodlanmış renk ve nesne izleme kalitesini değerlendirmek için Z yönünde sütunlara bağlanan tespit edilen işaretçi santriomlarını temsil eden parçaların çizimi de dahil olmak üzere çeşitli tanısal görüntüler sağlar.
DISP 3D.m komut dosyası, güvenilir işaretçi yoğunluğu profillerinin kalitesini değerlendirmek için belirli bir görüntü yığınında algılanan özelliklerin her sütunu için Z konumunun bir fonksiyonu olarak bir yoğunluk çizimi sağlar. Her ikisi de DISP 3D.
m ve DISP makası. m birlikte kartezyen koordinat boyutlarının her birinde ölçülen yer değiştirme gürültüsünün histogramlarını ve yer değiştirmenin enterpolasyonlu ısı haritalarını sağlar. Buna ek olarak, interp final3D_2.
m, dış kaynaklı kod kullanılarak hesaplanan yüzey çekişlerinin ısı haritalarını sağlar. Bu işlem sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, LAP içeren çözeltilerin ışığa duyarlı olduğu ve ortam ışığı kaynaklarından mümkün olduğunca korunması gerektiğidir. NVP'nin uçucu bir organik bileşik olduğunu ve her zaman kimyasal akış kaputunda ele alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, poli(etilen glikol) bazlı hidrojellerde gömülü floresan fidüksiyall markaların üç boyutlu dizilerinin üretilmesi için çok fotonlu litografi uygulama talimatları sağlar ve bu dizilerin referanssız, çekim kuvveti mikroskopi platformları olarak kullanılması içindir. Yöntem, 3B malzeme gerilimi ölçümünü ve hücresel çekimlerin hesaplamayı basitleştirir ve yüksek verimli çekim kuvveti ölçümlerini teşvik eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Çekim kuvveti mikroskopi, hücreler tarafından üretilen kuvvetleri ölçer.
- Bu protokol, veri toplama ve analizini basitleştirmek için tecrübesiz kullanıcılar için tasarlanmıştır.
- Çok fotonlu litografi, deneysel ihtiyaçlara göre hızlı ve kolay desen ayarlamalarına olanak tanır.
- Görsel temsiller, anahtar üretim adımlarının anlaşılmasını artırır.
Çalışmanın Amacı
- Referanssız bir çekim kuvveti mikroskopi platformu sağlamak.
- Hücresel çekimlerin yüksek verimli ölçümlerini kolaylaştırmak.
- Deneyim düzeyleri farklı araştırmacılar için erişilebilirliği artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çok fotonlu litografi kullanılarak floresan fidüksiyall markaların üretimi.
- Markaların poli(etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülmesi.
- Taban hidrojelin fotopolimerizasyonu.
- Damla düzlemlendirmesi için PDMS şeritleri ve kapak camları kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Referanssız bir çekim kuvveti mikroskopi platformunun başarılı uygulanması.
- 3B malzeme gerilimi ölçümü için yöntemlendirilmiş süreç.
- Hücresel çekimlerin hesaplanmasında iyileştirilmiş yetenek.
- Tecrübeli olmayan araştırmacılar için geliştirilmiş erişilebilirlik.
Sonuçlar
- Protokol, çekim kuvveti mikroskopisini daha geniş kullanım için basitleştirir.
- Çok fotonlu litografi, deneysel tasarımda esneklik sunar.
- Görsel yardımcılar, karmaşık üretim adımlarının anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This reference-free traction force microscopy platform enables precise quantification of cellular forces in 3D microenvironments, supporting mechanistic de-risking in target validation by linking phenotypic responses to biophysical cues. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, sub-micron resolution data on cell-material interactions, which informs pathway clarification and functional target assessment. Its accessibility and adaptability via multiphoton lithography allow rapid iteration in assay development for mechanobiology-focused screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of cell-generated forces in response to tunable substrate mechanics.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying how cells sense and respond to physical microenvironmental properties.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative traction profiles that correlate with mechanotransduction pathway activation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible hydrogel substrates with embedded fiducial markers for reliable force measurement across experimental conditions.
- Scalability: Allows rapid redesign of patterning parameters via multiphoton lithography to accommodate diverse cell types and substrate stiffnesses.
- Quantitative Output: Produces 3D displacement maps and traction heat maps enabling objective comparison of cellular responses.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of pathophysiological mechanisms in fibrosis, cancer, and stem cell differentiation where altered mechanosignaling drives disease progression.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanobiology insights to preclinical models by maintaining consistent quantification of cellular traction forces.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying compounds that modulate pathological force generation in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing biophysical readouts that complement biochemical assays in mechanosensitive pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying how cellular traction forces change in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible fabrication of tunable substrates with embedded markers for high-content force imaging.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (displacement, traction vectors) via scripts that generate centroid tracking, Z-projection plots, and interpolated heat maps for objective condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing consistent force measurement across model systems to validate target engagement in disease-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Positions the platform as a reusable capability where substrate patterning can be rapidly adapted via lithography to support multiple projects without revalidation of core imaging and analysis workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in how cells transduce mechanical signals into biochemical responses.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through reference-free design and scripted analysis pipelines that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ineffective mechanomodulators, reducing late-stage failure risk due to unanticipated biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target modulation efficacy in physiologically relevant mechanical microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton lithography, hydrogel fabrication, and fluorescence microscopy for successful substrate patterning and imaging.
- Depends on access to two-photon laser scanning microscopes and compatible software for region-based photopatterning and Z-stack acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of fiducial marker detection and tracking parameters to ensure data comparability across users and experiments.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different hydrogel formulations or cell types, particularly regarding swelling control and marker penetration.
- Involves practical limitations including light sensitivity of LAP-containing solutions and the need for chemical fume hood handling of NVP due to its volatility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:40
Base Hydrogel Photopolymerization
2:04
Binary Image to Digital Mask Conversion
3:02
Base Hydrogel Soak
3:44
Microscope Configuration
5:15
Fiducial Marker Array Photopatterning
6:01
Fiducial Marker and Cell Imaging
6:31
Results: Representative Reference-Free Traction Force Microscopy
7:43
Conclusion
