Name: Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, insan primer endometrial organoid üretim protokolünü keşfedin. Epitel ve stromal hücrelerden oluşan bu 3D yapılar, hormonal yanıtları ve hastalık mekanizmalarını in vitro çalışmak için ideal bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIEHS/NIH/NCATS UG3 hibe (ES029073) ve Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge fund (JJK) tarafından finanse edilmiştir. Biz parafin katıştırma için sabit organoidler işleme için Northwestern Patoloji Çekirdek Tesisi kabul etmek istiyorum. Woodruff, Burdette ve Urbanek laboratuvarları da dahil olmak üzere tüm UG3 ekibini anlayışlı tartışmalar ve işbirlikleri için kabul etmek istiyoruz.

Endometrial örnekler Northwestern Üniversitesi Prentice Kadın Hastanesi'nde benign rahim koşulları için rutin histerektomi geçiren premenopozal kadınlardan alındı, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı protokole göre. Çalışmaya dahil olan tüm kadınlardan yazılı izin alındı.
1. Agarose Kalıplarının Hazırlanması
<ol><li>Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri üreticinin talimatlarına göre barındırmak için %1,5 agarose mikro kalıpları(Malzeme Tablosu)atar ve dengeler.</li>
</ol>2. Endometrial Organoidlerin Üretimi
<ol><li>Primer stromal ve epitel hücrelerinin hasat
	<ol>
<li>Aseptik tekniği kullanan bir biyogüvenlik kabininde, enzim solüsyonu (2.5 mg/mL kollajenaz tip I + 0.1 mg/mL DNase I 10 mL dispase [500 ünite]) 37 °C'de hazırlayın ve çözeltiyi 15 mL konik tüpe 0,2 μm şırınga filtresi kullanarak steril filtre uygulayın.</li>
		<li>Aseptik tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabine, rahim biyopsileri ve neşter ile çok küçük parçalar halinde başlık altında kıyma doku endometrium kazımak. NOT: Yeterli sayıda organoid üretmek için en az 20 mm x 10 mm x 1 mm olan endometrial doku gereklidir.</li>
		<li>15 mL konik tüpte enzim çözeltisine taze kıyılmış doku koyun. Kapağı kapatın ve kontaminasyonu önlemek için üst kısmı balmumu filmi(Malzeme Tablosu)ile sarın.</li>
		<li>Bir su banyosu veya 37 °C'de bir kuvöz ile tüp koyun 30 dakika hafif sallayarak (80−100 rpm).</li>
		<li>50 mL konik bir tüp üzerinde 20 μm hücreli süzgeç üstüne 100 μm hücreli süzgeç yığını. Çözeltiyi iki süzgeçten süzün ve 15 mL konik tüpü Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 10 mL'i ile durulayın; Malzeme Tablosu) ve tüm hücrelerin toplanmasını sağlamak için süzgeç aracılığıyla yıkama koymak. NOT: Akış-sıvı stromal hücreleri ve kırmızı kan hücreleri (~ 20 mL toplam) içerir. Epitel hücreleri 20 μm süzgeç üzerinde toplanır. Sindirilmemiş doku parçaları 100 μm süzgeç üstünde kalır. Sindirilmemiş dokuyu biyolojik tehlike selamı kabına atın.</li>
		<li>20 μm hücresüzü adım 2.1.5'ten yeni bir 50 mL konik tüpe ters çevirin ve epitel hücrelerini süzgeçten 20 mL organoid ortam(Malzeme Tablosu)ile yıkayın ve %1 kalem/strep ile tamamlayın.</li>
		<li>5 dk için 500 x g adım 2.1.5 ve 2.1.6 konik tüpler santrifüj.</li>
		<li>Toplanan stromal hücrelerle, supernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon 10 mL ile pelet resuspend.  37 °C'de 10−15 dk. Konik tüpü 5 000 x g 5 dk için santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 200−300 μL organoid ortamla peleti yeniden askıya alın (daha fazla talimat için 2.2.2 numaralı adıma bakın).</li>
		<li>Toplanan epitel hücreleri ile, supernatant çıkarın ve organoid medya 100 μL ile yeniden askıya (daha fazla talimatlar için adım 2.2.2 bakınız).</li>
	</ol></li>
	<li>Tohumlama hücreleri
	<ol>
<li>24 kuyulu bir tablanın kuyularında %1,5 agarose kalıplarını (kuyu başına 1 kalıp) dengeledikten sonra, agarose kalıplarının dışındaki organoid ortamı çıkarın ve doku kültür plakasını yatırın, böylece agarose yemeklerinin hücre tohumlama odasından orta dikkatle kaldırılır.</li>
		<li>Mikroskop altında epitel (adım 2.1.9) ve stromal (adım 2.1.8'den) hücre süspansiyonlarını görüntüleyin.  Epitel veya stromal hücre süspansiyonlarına bir seferde 100 μL daha fazla organoid ortam ekleyin, böylece süspansiyonlar yoğunluğu kabaca eşit olur. NOT: Epitel hücreleri bir araya toplanır ve epitel hücrelerini tek hücresüspansiyonlarına sindirmek/denemek tavsiye edilmez.</li>
		<li>Stromal hücrelerin 1 kısmını epitel hücrelerinin 3 bölümü ile hacmine göre birleştirin.</li>
		<li>Pipet 50 μL (60.000 hücre) agarose kalıp hücre tohumlama odasına kombine hücre süspansiyon.</li>
		<li>Agarose kalıpları hücrelerle doldurulduktan sonra, 24 kuyulu plakanın kuyusuna 400 μL taze organoid ortam ekleyin. NOT: Ortam agarose yemeklerinin yüzeyinin hemen altına ulaşır ve hücrelerin kalıplardan dışarı süzülmesine neden olmaz. 2−3 gün sonra hücreler yerleşir ve organoidler oluşturmaya başlar.</li>
		<li>500 μL organoid ortam ile her iki günde bir orta yıkın.</li>
		<li>2-3 gün sonra, epitel ve stromal hücrelerin örgütlenmesini teşvik etmek için 0.1 nM estradiol (E) ve 0.8 nM testosteron (T) ile takviye edilen bir ortam değiştirin. NOT: Epitel ve stromal hücrelerin organizasyonu hormonlu veya hormonsuz oluşabilir rağmen, daha fazla organoidler hormonların varlığında organize olacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Deneyler için Endometrial Organoidlerin Hasat
NOT: Deney yapıldıktan sonra histoloji veya RNA analizi için endometrial organoidler işlenebilir. Aşağıdaki adımlar organoidlerin nasıl işlenir olduğunu açıklar.
<ol><li>
Histoloji
	<ol>
<li>Fosfat tamponlu salinde (PBS) %1.5 agarose kaynatılarak çözün. Sıvı agarose yaklaşık 50 °C'ye soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka tilt ve dikkatle agarose kalıp dışından orta pipet. Organoidleri bozmamak için agarose kalıbının içinden ortayı dikkatlice çıkar.</li>
		<li>Bir diseksiyon mikroskobu altında, dikkatle pipet 70-75 ° L sıcak (50 °C) 1.5% agarose agarose çanak odasına. Organoidleri rahatsız etmemeye dikkat edin.</li>
		<li>4 °C'de 5 dk soğumaya bırakın.</li>
		<li>24 kuyu plakasının her bir kuyuya %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 4 °C'de organoidiçeren tüm mühürlü agarose kalıbını düzeltin. Daha sonra 4 °C'de %70 etanolde parafin gömme işlemi ne kadar hazır olana kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA yalıtımı
	<ol>
<li>Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka tilt ve dikkatle agarose kalıp odasından orta pipet.</li>
		<li>Zorla pipet 1 mL taze organoid orta doğrudan agarose kalıbına böylece organoidler mikrowells dışarı atılır. Çok fazla kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olun.</li>
		<li>3.2.2 adımdan aynı ortamla pipetlemetekrar tekrarlayın.</li>
		<li>Organoidler içeren tüm orta toplayın. Organoidleri toplamak ve RNA ekstraksiyonuna geçmek için maksimum hızda santrifüj.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ürettik. Birincil endometrial epitel hücrelerininorganoidler6,7oluşturabildiği gösterilmiş olsa da, bu hücreler fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein matrisine gömülmüştür (bkz. Malzemeler Tablosu) spheroid benzeri yapılar oluşturur. Buna ek olarak, endometrial stromal hücreler yoktu. Sistemim...

İnsan endometrium hatları rahim boşluğu ve implantasyon sırasında embriyo için ilk temas olarak hizmet vermektedir. Endometrium luminal ve glandüler epitel hücreleri, destekleyici stromal fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Birlikte, Bu hücre tipleri seks steroid hormonları için en duyarlı dokulardan biri olan endometrial doku makyaj1. Her adet döngüsü sırasında meydana gelen değişiklikler çarpıcı. Embriyo implantasyonunun gerçekleşmesi için uygun büyüme ve endometriumun yeniden şekillendirilmesi gereklidir. Östrojen ve progesteron anormal yanıt gebeliğin başarılı kurulması için izin vermez ve hatta endometrial neoplazi de dahil olmak üzere hastalıklara neden olabilir refrakter bir endometrium neden olabilir.
Endometriumda oluşan hormon yanıtlarını ve temel değişiklikleri incelemek için ameliyat veya endometrial biyopsi sırasında hastalardan alınan endometrial dokulardan alınan hücreler hücre kültüründe yayılımkonusu olmuştur. Endometrial stromal hücreler tercihen çoğalır ve kolayca yayılır, ve progesteron tarafından indüklenen farklılaşma süreci in vitro recapitulated olabilir. Sonuç olarak, desidualizasyon2,3olarak adlandırdığı bu farklılaşma sürecinde çok şey öğrenilmiştir. Endometrium diğer önemli hücre tipi, luminal ve glandüler epitel hücreleri, ancak, polarite kaybetme, yaşlanma, yaşlanmak, ve sınırlı çoğaltıcı potansiyele sahip, geleneksel monolayers olarak iyi büyümek yok. Sonuç olarak, daha az biyoloji ve insan endometrium onların rolü bilinmektedir. Birçok neoplazi epitel hücrelerinden kaynaklandığı gibi, hiperplazi veya kanser hücrelerine dönüşüm ile ilişkili mekanizmalar tam olarak tanımlanmış olmaya devam etmektedir. Ayrıca, çalışmalar hormon yanıtı endometriumepitelve stromal hücreler arasında samimi parakrin eylemleri içerdiğini kurduk4 ,5.
Son zamanlarda, endometrial epitel hücrelerinin üç boyutlu (3D) organoid kültürü iki bağımsız grup tarafından kurulmuştur6,7, endometrial dokudan oluşan organoidlerin ilk raporları. Bu organoidler bir protein matrisi(Malzeme Tablosu)içine gömülü endometrial epitel hücrelerinden oluşuyordu ve endometrial endometriumun hormonal olarak duyarlı önemli bir bölmesi olan stromal fibroblastları içermiş. Matris proteinler çok dan çok değişebilir ve mutlaka dokuda meydana gelmez sinyal yolları tetikleyebilir gibi, endometrium bileşenleri ile matris proteinleri yerine ideal olacaktır. Mevcut çalışmada, insan endometriumunun epitel ve stromal hücrelerinin iskelesiz insan endometrial organoidlerinin oluşturulmasına bir protokol sunulmuştur. Stromal hücrelerin varlığı sadece epitel hücreleri için destek sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda endometriyal hormon yanıtı için önemli olduğu tespit edilen gerekli parakrin eylemleri de sağlar4,8,9 .
Yeni multisellüler endometriyal organoid oluşturmak için basit ve hem epitel hem de stromal hücreleri içeren endometrium bir model sistemi sunuyor. Bu organoidler hormonal dengesizlik veya eksojen hakaretler nedeniyle tümörigenez gibi hastalığın uzun süreli hormonal değişiklikleri ve erken olaylarını incelemek için kullanılabilir. Bu organoidlerin karmaşıklığı sonunda diğer hücre tipleri içerecek şekilde genişletilebilir, endotel ve bağışıklık hücreleri muhtemelen miyomsal hücreleri ile de dahil olmak üzere gerçekten insan doku fizyolojisi taklit etmek.

<table><tbody><tr><td>Agaroz HS, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz kalıpları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td> <td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr> <tr><td>Amonyum klorür (NH < alt > 4 < / alt > Cl)</td> <td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip II, toz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Eozin Lekesi</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Östrojen Reseptörü (SP1), tavşan monoklonal antikoru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI ile Fluoroshield, histoloji montaj ortamı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermez</td></tr><tr><td>Hematoksilen Leke Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Modifiye Harris formülasyonu, cıva içermeyen</td></tr><tr><td>Heparin çözeltisi</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ</td><td>07980</td><td>MammoCult media'ya eklendi</td></tr><tr><td>Hidrokortizon stok çözeltisi</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>MammoCult media'ya eklendi</td></tr><tr><td>Organoid media - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>2 &micro ile desteklenmiş; L / mL heparin ve 5 &mikro; L/mL hidrokortizon</td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %16 çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron Reseptörü, PgR 1294, eşlenik, kültür süpernatantı</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>protein matrisi - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış fare anti-E-kaderin antikoru</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Rekombinant anti-vimentin antikoru [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>RNA lizis ve izolasyon kiti</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Trikrom Leke</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Balmumu filmi - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

multicellular human primer endometrial organoidlerin Üretimi

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

İnsan endometrium vücutta ki en hormonal duyarlı dokulardan biridir ve gebeliğin kurulması için gereklidir. Bu doku da hastalıklı olabilir ve morbidite ve hatta ölüme neden olabilir. İnsan endometrial biyolojisini inceleyen model sistemler, tek hücreli in vitro kültür sistemleri ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, endometriumun en önemli hücre tiplerinden biri olan epitel hücreleri, kültürdeki fizyolojik özelliklerini iyi yaymaz veya korumaz ve böylece endometriyal biyoloji anlayışımız sınırlı kalmaktadır. İlk defa insan endometriumunun hem epitel hem de stromal hücrelerinden oluşan endometrial organoidler oluşturduk. Bu organoidler herhangi bir ekzojen iskele malzemeleri gerektirmez ve özellikle epitel hücreleri küresel benzeri yapıyı kapsayacak şekilde düzenlemek ve üretmek ve kollajen salgılayan merkezinde stromal hücreleri ile polarize olur. Östrojen, progesteron ve androjen reseptörleri epitel ve stromal hücrelerde ifade edilir ve östrojen ve testosteron fizyolojik düzeyleri ile tedavi organoidlerin organizasyonu teşvik. Bu yeni model sistemi, normal endometriyal biyoloji ve hastalıkları daha önce mümkün olmayan şekillerde incelemek için kullanılabilir.

Protokol şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Komindoku patologlar tarafından incelendikten sonra ameliyatla elde edildi. Endometriyal astar kazınarak miyometriumdan ayrılmış ve endometriyal doku enzimatik olarak protokolde belirtildiği gibi hücrelere sindirilmiştir. Epitel ve stromal hücreler agarose kalıplarında mikrowelllere eklendi. Kültürde 7 gün kaldıktan sonra organoidler 7−14 gün daha E ve T ile tedavi edildi.
Histolojik işlemler için, endometriyal organoidler...

Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Endometrium hormonlara yanıt olarak her ay değişen bir dokudur. Hormon dengesizliği embriyo bağlanmasını önleyebilir ve aynı zamanda kanser gibi hastalıklara neden olabilir. Protokolümüz endometrium'u yeniden inşa ediyor, böylece kadının vücudunun dışında fizyolojik bir şekilde incelenebilir.Bu tekniğin en büyük avantajı, hormonal olarak duyarlı iki hücre tipinden oluşan 3Boyutlu bir hücre yapısı sağlamasıdır, epitel ve stroma hücreleri özellikle vücutta yaptıkları gibi organize ve davranışta bulunurlar. Organoidler doku davranışını daha iyi taklit edebildiklerinden, sonunda farklı ilaçları test etmek için kullanılabilirler. Endometrial organoidler kanser için şu anda bilinen risk faktörlerinin doğrudan etkilerini incelemek için kullanılabilir, obezite ve polikistik over sendromu da dahil olmak üzere.Organoidlerimiz iki hücre tipi arasındaki parakrin eylemlerin önemini vurgularlar. Yeterli miktarda dokuyla başlamak önemlidir. Epitel ve stromal hücrelerin doğru yoğunluğu elde etmek zor olabilir.Ayrıca, organoidler oldukça küçük ve IHC boyama ile görselleştirmek zor olabilir. Bu yordamın görselleştirilmesi önemlidir, çünkü gördükten sonra anlaşılması çok daha kolay olan bazı adımlar vardır. Bu rahim doğru doku tabakası alma, birleştirmek için hücrelerin doğru yoğunluğu nu elde ve agarose kalıpları tohumlama içerir.Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri barındırmak için üreticinin talimatlarına göre %1,5 agarose mikro kalıpları atar ve dengeler. Bir biyogüvenlik kabininde, 37 santigrat derecede bir enzim çözeltisi hazırlamak için aseptik teknikler kullanın ve 15 mililitrelik konik tüpe 0,2 mikrometreşon filtre kullanarak çözeltiyi steril filtreleyin. Neşter kullanarak rahim biyopsilerinden endometrium kazıyın ve dokuyu çok küçük parçalara ayırın.Taze kıyılmış dokuyu enzim çözeltisini içeren 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Kapağı kapatın ve kontaminasyonu önlemek için bir balmumu filmi ile tüpün üst sarın. Tüpü 37 derecede su banyosuna veya kuvöze yerleştirin.Bundan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüp üzerinde 20 mikron hücreli süzgeç üstüne 100 mikron hücreli süzgeç yığını. Çözümü iki süzgeç arasından filtreleyin. HBSS ile 15 mililitrelik konik tüp durulayın ve tüm hücrelerin toplanması sağlamak için süzgeç aracılığıyla bu yıkama koymak.Daha sonra, yeni bir 50 mililitrekonik tüp üzerine 20 mikron hücreli süzgeç ters ve organoid medya 20 mililitre ile süzgeç kapalı epitel hücreleri yıkayın 1% penisilin ve streptomisin ile takviye. Konik tüpleri 500 G'de beş dakika santrifüj edin. Toplanan stromal hücreler için, supernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon 10 mililitre pelet resuspend.37 derecede 10-15 dakika kuluçkaya yat. Bu hücreleri 500 G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve organoid medya 200 ila 300 mikrolitre ile pelet resuspend.Toplanan epitel hücreleri için, supernatant kaldırmak ve organoid medya 100 mikrolitre pelet resuspend. %1.5 agarose kalıpları dengeledikten sonra, agarose kalıplarının dışındaki organoid ortamı çıkarın ve doku kültür plakasını yatırın, böylece agarose yemeklerinin hücre tohumlama odasından orta da dikkatlice çıkarılabilir. Epitel ve stromal hücre süspansiyonlarını mikroskop altında görüntüleyin ve süspansiyonlara daha fazla organoid ortam ekleyin, böylece süspansiyonun kabaca yoğunlukta eşit olmasını sağlayarak bir seferde sadece 100 mikrolitre eklemeyi unutmayın.Sonra hacim olarak epitel hücrelerinin üç bölümden stromal hücrelerin bir kısmını birleştirin. Pipet 50 mikrolitre kombine hücre süspansiyonu agarose kalıbının hücre tohumlama odasına. Agarose kalıpları hücrelerle doldurulduktan sonra, 24 kuyulu plakanın kuyularına 400 mikrolitre taze organoid ortam ekleyin.%5 karbondioksit ile 37 derecede kuluçka, organoid medya 500 mikrolitre ile her iki günde bir orta değiştirmek için emin olun. Yedi gün sonra, epitel ve stromal hücrelerin örgütlenmesini teşvik etmek için 0.1 nanomolar estradiol ve 0.8 nanomolar testosteron ile desteklenen bir orta değiştirin. İlk olarak, kaynatılarak PBS%1.5 agarose eritin.Sıcak su bir kabı içine sıvı agarose yerleştirin ve yaklaşık 50 santigrat dereceye soğumasını bekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka yatırın ve dikkatle agarose kalıp dışından orta pipet. Daha sonra organoidleri bozmamak için agarose kalıbının içinden ortayı dikkatlice çıkarın.Dikkatlice 70 ve 75 mikrolitre sıcak, 1.5% agarose çanak odasına agarose ekleyin, organoidler rahatsız etmemeye dikkat. Plaka dört santigrat derecede beş dakika soğumasını bekleyin. Bundan sonra, 24-iyi plaka her kuyuiçine% 4 paraformaldehit ekleyin ve dört santigrat derece bir gecede tüm mühürlü agarose kalıp düzeltmek.Ertesi gün, parafin gömme işlemi için hazır olana kadar plakayı dört santigrat derecede %70 etanolde saklayın. RNA izolasyonuna başlamak için, plakayı bir kesme mikroskobu altında görüntüleyin. Tabağı yatırın ve agarose kalıbının odasından orta yı dikkatlice pipetle dışarı atın.Zorla pipet taze organoid orta doğrudan agarose kalıp içine böylece organoidler mikrowells dışarı atılır, çok fazla kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olmak. Aynı ortamı kullanarak bu güçlü pipetleme işlemini bir kez tekrarlayın. Bundan sonra, organoidler içeren tüm orta toplamak.Organoidleri toplamak için 500 G'de santrifüj edin ve RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bu çalışmada, endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan üretilmiştir. Histolojik işlemler için, endometriyal organoidleri içeren agarose kalıpları agarose ile kapatılır, ardından bir gecede %4 paraformaldehit ile fiksasyon yapılır.Bu kalıplar histoloji, immünoresans veya immünohistokimya için standart parafin gömme ve lekeli olarak işlenir. Eozin boyama hematoksilin hücre dışında ve merkezinde hücreleri astar tek bir tabaka ile küresel benzeri bir yapı ortaya koymaktadır. Endometrial, epitel ve stromal hücreler için hücrespesifik belirteçler merkezde stromal hücreler ile organoid çevreleyen epitel hücreleri ortaya.Endometrial fizyolojinin belirteçleri endometrial organoidlerin doğal dokunun bazı özelliklerini koruduğunu doğrulamaktadır. Kollajen mavisi ve hücreleri kırmızı lekeler üç krom boyama, stromal hücrelerin yaşadığı merkezi içinde kollajen varlığını gösterir, aktif üretim ve stromal hücreler tarafından kollajen salgılanması gösteren yerli doku benzer. Buna ek olarak, immünohistokimyasal boyama östrojen reseptörlerinin varlığını ortaya koymaktadır, androjen reseptörleri, ve progesteron reseptörleri hem epitel hem de stromal hücrelerde.Hücreleri yoğun bir şekilde kaplamak önemlidir, böylece akıntı deneyleri için yeterli organoidimiz olur. Bu biraz pratik alacak. Endometrial organoidler farklı koşullar altında kültürlenebilir ve daha sonra protein ekspresyonunu incelemek için immünohistokimya veya immünofloresan boyama gibi deneyler için hasat edilebilir veya gen ekspresyonunu incelemek için RNA için hasat edilir.Laboratuarımız endometriumun değişmiş hormon düzeylerine nasıl tepki verebileceğini araştırır, bu da endometrial hiperplazi ve kansere yol açabilir. Biz hormonların uzun vadeli tedaviler için bu organoidler kullanabilirsiniz ve polikistik over sendromu bulunan aşırı testosteron gibi patolojik koşullar eklemek, ya da obezite kaynaklı endometrial değişiklikleri incelemek için adipositlerden sinyalleri. İnsan dokuları biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir ve uygun önlemlerin alınması önemlidir.

generation-of-multicellular-human-primary-endometrial-organoids

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

İnsan dişinden başlayarak epitelyal organoid kültürlerin geliştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Organoidler sağlam bir şekilde genişletilebilir ve ameloblast farklılaşma kapasiteleri de dahil olmak üzere dişin epitel kök hücrelerini özetler. Eşsiz organoid model, insan diş (kök hücre) biyolojisini diş rejeneratif yaklaşımlar için perspektiflerle incelemek için umut verici bir araç sağlar.

İnsan Dişinden Organoidlerin Mekanik Araştırma ve Rejeneratif Terapiye Doğru Güçlü Bir Araç Olarak Kurulması

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Bu protokol, birincil insan yumurtalık yüzey epitel (hOSE) hücrelerinden üç boyutlu (3D) doku organoidlerinin oluşturulmasını açıklar. Protokol, yeni toplanan yumurtalıklardan hOSE'nin izolasyonunu, hOSE'nin hücresel genişlemesini, kriyoprezervasyon-çözme prosedürlerini ve organoid türevini içerir. İmmünofloresan, kantitatif analiz ve bir tarama platformu olarak sergileme yardımcı programı dahildir.

Doku Rejenerasyonunu İncelemek İçin Bir Platform Olarak İnsan Yumurtalık Yüzeyi Epitel Organoidleri

Burada, sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerini (reESC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz, bu da sıçan endometriyal organoidleri üretiyor. Bu yöntem, endometriyal hastalıkların in vitro çalışmalarını kolaylaştırarak gen düzenlemesini ve diğer hücresel manipülasyonları mümkün kılar.

Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

İnsan servikal organoidlerini oluşturmak ve genetik olarak manipüle etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan Rahim Organoidlerinin Üretimi ve Genetik Manipulyasyonu

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Öğrenin, insan primer endometrial organoid üretim protokolünü keşfedin. Epitel ve stromal hücrelerden oluşan bu 3D yapılar, hormonal yanıtları ve hastalık mekanizmalarını in vitro çalışmak için ideal bir model sunar.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet