Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Bu teknik, sferoidlerin hızlı üretimi için öncü bir sistem olan bir laboratuvar-on-a-CD platformu kullanarak bireysel ve birden fazla hücre tiplerinden hücre sferoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Bu teknik, hücreleri belirlenmiş mikrowelllere yatırmak için santrifüj kuvvet kullanır ve farklı küresel lerin üretimi için birden fazla hücre türünün sıralı olarak izaat inmesine olanak sağlar. CMS kültür yongası imalatı için, ilk bilgisayar sayısal kontrol işleme tarafından kültür çipinin üst ve alt katmanları için polikarbonat kalıplar yapmak.

Sonraki karışımı PDMS baz ve PDMS kür ajan hava kabarcıkları kaldırmak için bir saat boyunca bir kurutucu karışımı yerleştirmeden önce beş dakika boyunca 10-bir oranında. CMS kültür yonga kalıpları içine gazdan arındırılmış PDMS karışımı dökün ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir saat daha kurutucu içine kalıpları yerleştirin. İkinci gaz giderme sonunda, yüzeylere bakacak şekilde vakumlanmış plazma temizleyicisine talaş koymadan önce karışımı 80 santigrat derecede iki saat boyunca Bir ısı odasında tedavi edin.

Kültür yongalarını 30 saniye boyunca 18 watt'lık bir güçle hava destekli plazmaya maruz bırakın ve yapışma gücünü artırmak için çipin iki katmanını 80 santigrat derecede 80 derecede bağlayın. Sonra CMS kültür çipini 121 derecede 15 dakika otoklavda sterilize edin. Hücreleri küresel formasyona hazırlamak için, 36,5 santigrat derecelik su banyosunda 5 ila 10 kat 10 arasında içeren bir mililitrelik şişeyi iki dakika boyunca hafif karıştırma ile hücrelere bir mililitre DMEM eklemeden önce eritin.

Daha sonra hücreleri 150 milimetre çapındaki Petri kabına ekleyin ve 15 mililitre 36,5 derecelik orta dereceyi içeren petri kabına ekleyin ve kabı 24 saat boyunca hücre kültürü kuvöze yerleştirin. Ertesi gün, supernatant taze DMEM 15 mililitre ile değiştirin ve kuvöz hücreleri geri dönün. Hücreleri ayırmak için, 36,5 santigrat derece ve% 5 karbondioksit dört dakika boyunca tripsin dört mililitre ile kültür oluşturmak, hücreler çanak altından kaldırdı zaman taze orta ile reaksiyon durdurma.

Hücreleri etiketlemek için, bir milimolar çözelti elde etmek için şişeye 20 mikrolitre susuz dimetil sülfoksit eklemeden önce uygun bir hücre floresan boyasını oda sıcaklığına ısıtın. Floresan'ı DMEM'deki bir mikromolar'ın son çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve boyayı nazik karıştırma ile ilgi hücresi süspansiyonuna ekleyin. Sonra hücreleri 20 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka yerleştirin.

Monokültür küresel formasyonu için, çipi dakikada 500 ila 1,000 dönüşte döndürürken CMS kültür çipinin giriş deliğine ilk olarak %4 Pluronic F-127 çözeltisi 2,5 mililitre ekleyin. Tüm çözüm eklendiğinde, CMS sistemini kullanarak çipi dakikada 4.000 dönüşte üç dakika boyunca döndürün. Rotasyonun sonunda, kültür çipini bir gecede %5 karbondioksitle 36.5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Ertesi sabah, Pluronic çözeltisi çıkarın ve DMEM ile kültür çipi yıkayın. Talaşı temiz bir bankta 12 saat kuruttuktan sonra, giriş portuna 2,5 mililitre orta ekleyin ve talaşı dakikada 4,000 dönüşte üç dakika döndürün. Döndürme sonunda, giriş portundaki ortamın 100 mikrolitresini, fiş dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken, hazırlanan hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresi ile değiştirin.

Daha sonra çipi üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine koymadan önce her mikrokuyudaki hücreleri santrifüj kuvvetle tuzağa düşürmek için dakikada 3,000 dönüşte üç dakikada döndürün ve her gün gösterildiği gibi ortamı yenileyin. Eşmerkezli küresel eşkültür üretimi için, çip dakikada 500-1, 000 rotasyon ve dakikada 3, 000 rotasyon üç dakika döner dönerken çipin giriş noktasına orta 100 mikrolitre hücre ilk popülasyon ekleyin. Döndürmenin sonunda, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken ikinci hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve çipi üç dakika daha dakikada 3,000 dönüşte döndürün.

Her iki hücre hacmi de enjekte edildiğinde, çipi 24 saat boyunca dakikada 1,000 ila 2,000 dönüşle hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Janus küresel formasyonu için, çip dakikada 500-1, 000 dönüşte dönerken ilk hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve ardından dakikada 3,000 dönüşte üç dakika. Döndürmenin sonunda, çipi hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve üç saat boyunca dakikada 1,000 ila 2, 000 dönüşte rotasyon alabilen.

Kuluçka sonunda, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken ikinci hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve talaş 3,000 dönüşte dakikada üç dakika boyunca döndürün. Daha sonra hücre kültürü kuluçka merkezindeki hücreleri 1,000 ila 2,000 dönüşte dakikada 24 saat boyunca yerleştirin. Sandviç küresel oluşumu için, ilk olarak ilk hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini eklerken, çip dakikada 500-1,000 dönüşte dönerken, dakikada üç dakikalık dönüşler ve ardından dakikada 3,000 dönüşte üç dakikalık dönüşler.

Döndürmenin sonunda, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken ikinci hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini eklemeden önce, çipi hücre kültürü kuluçka makinesinde iki saat boyunca 1,000 ila 2,000 dönüşte bir rotator üzerine yerleştirin. Çipi 3,000 RPM'de üç dakika döndürün ve çipi üç saatlik bir kuluçka için kuvöze geri yerleştirin. Daha sonra ilk hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte döner ve hücreleri 12 saat boyunca gösterildiği gibi döndürün ve kültürlendirin.

Gösterildiği gibi protokolü takip ederek, altı santimetre çapında cms kültür çipi başarıyla imal edilebilir. CMS kültür yongasının kanalı bir giriş bağlantı noktası ve merkezi, slayt ve microwell bölgelerinden oluşur. Tek tek CMS yongaları içinde kültürün ilk 24 saati için dakikada 2.000 rotasyonda alınan iki tür hücre kültürünün hızlandırılmış görüntüleri, gösterildiği gibi, küresel lerin başarılı oluşumunu göstermektedir.

Üç günlük kültürden sonra mikrowelllerin görüntülenmesi, küresel lerin mükemmel bir tekdüzelik ve küresellik gösterdiğini göstermektedir. Konentrik, Janus ve sandviç yapılı cokültürd spheroids de oluşturulabilir. Buna ek olarak, hücre kültürleri yedi gün boyunca yüksek yerçekimi maruz, canlı / ölü boyama takip, çoğu hücre cips içinde uzun vadeli kültür hayatta olduğunu göstermektedir.

CMS kültür yongasının üst ve alt katmanları bağlandıklarında dikkatlice hizalanmalıdır, aksi takdirde her mikrokuyudaki hücre sayısı eşit olmayabilir. Bu çalışma, coculture spheroid araştırma için giriş engelini düşürebilir ve yaygın olarak coculture çalışmalarda kullanılabilir, örneğin, ilgi yeni ilaçların taranması için.