Name: Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Öğrenin, lab-on-a-CD platformu kullanarak tek ve çoklu hücre tiplerinden üç boyutlu spheroid üretme yöntemini. Santrifüj kuvvetiyle hücreleri mikro kuyucuklara yerleştirerek doku mühendisliği araştırmaları için hızlı ve verimli kültür sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, NMG'nin Temel Bilim Araştırma Programı (2016R1D1A1B03934418) ve NMG'nin Bio & Medical Technology Development Program (2018M3A9H1023141) tarafından desteklenmiş ve Kore hükümeti MSIT tarafından finanse edilmiştir.

1. Santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) kültür çipi imalatı
<ol><li>CNC işleme ile CMS kültür yongasının üst ve alt katmanları için PC kalıpları yapın. Çipin ayrıntılı boyutları Şekil 1'deverilmiştir.</li>
	<li>5 dakika için 10:1 (w/w) oranında PDMS tabanını ve PDMS kür leme maddesini karıştırın ve hava kabarcıklarını temizlemek için 1 saat boyunca kurutucuya yerleştirin.</li>
	<li>CMS kültür çipkalıpiçine PDMS karışımı döktükten sonra, 1 saat daha fazla hava kabarcıkları kaldırmak ve 2 saat için 80 °C'de bir ısı odasında tedavi.</li>
	<li>Yüzeylere bakacak şekilde vakumlanmış plazma temizleyicisine yerleştirin ve 30 s için 18 W güçte hava destekli plazmaya maruz bırakın.</li>
	<li>CMS kültür çipinin iki tabakasını bağlayıp yapışma gücünü artırmak için 80 °C'de 30 dk ısı haznesine yerleştirin.</li>
	<li>CMS kültür çipini 121 °C ve 15 psi'de otoklav sterilizatörde sterilize edin.</li>
</ol>2. Hücre hazırlama
<ol><li>5 × 105–1 × 106 hASCveya MRC-5s hücrelerini içeren şişenin 1 mL'ini 36,5 °C'de 2 dk su banyosunda eritin.</li>
	<li>Bir şişeye 1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) ekleyin ve 1.000 μL'lik pipetle hafifçe karıştırın.</li>
	<li>DMEM'in 15 mL'ini 36,5 °C'ye kadar önceden ısıtılmış bir pipet kullanarak 150 mm çapındaki Petri kabına koyun ve şişedeki hücreleri ekleyin.</li>
	<li>1 gün sonra DMEM'i aspire edin ve 15 mL taze DMEM ile değiştirin. Daha sonra, her 2 veya 3 günde bir ortamı değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri Petri kabından ayırmak için Petri tabaklarına 4 mL tripsin ekleyin ve 4 dakika boyunca 36,5 °C'de bir kuvöze ve %5 CO2'ye yerleştirin.</li>
</ol>3. Monokültür küresel formasyonu
<ol><li>2,5 mL% 4 (w / v) pluronic F-127 çözeltisi CMS kültür çipi(Şekil 2A)giriş deliğine 500-1.000 rpm yonga dönerken ve daha sonra CMS sistemi(Şekil 2B)kullanarak 3 dakika için 4.000 rpm fiş döndürün . NOT: Pluronik kaplama, talaş dönerken giriş portuna hücre bağlanmasını önler. Havanın mikrokuyularda sıkışmadığından emin olun.</li>
	<li>CmS kültür çipi pluronik çözelti ile bir gecede 36,5 ° C 5% CO2dolu kuluçka .</li>
	<li>Pluronik çözeltiyi çıkarın, kalan pluronik solüsyonu DMEM ile yıkayın ve talaş temiz bir tezgahta 12 saat kurulayın.</li>
	<li>CMS kültür çipine 2,5 mL DMEM ekleyin ve çipin içini ıslatmak için 3 dakika boyunca ~4.000 rpm'de çipi döndürün.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna yer açmak için dönüşü durdurun ve 100 μL DMEM çekin.</li>
	<li>5 × 105 hASC veya 8× 105 MRC-5s içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin düzgün bir şekilde yeniden süspansiyon için 3-5x pipetleme ederek hücreleri dağıtın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 3000 rpm'de çipi döndürerek her mikrokuyudaki hücreleri santrifüj kuvvetle tuzağa düşürün. NOT: Aşırı dönme hızı çözelti fırlatma deliklerinden hücre kaçışına neden olabilir.</li>
	<li>Kültür 36.5 °C, >95% nem ve% 5 CO2,1.000-2.000 rpm dönen kuvözde 3 gün boyunca hücreleri. Kültür ortamını her gün değiştirin.</li>
</ol>4. Eşkültür küresel oluşumu
<ol><li>
Eşmerkezli küresel ler oluşumu
	<ol>
<li>İlk hücreleri ekleyin, 2.5 × 105 hASCs, ve 3.000 rpm de çip döndürün. 3 dakika sonra, ikinci hücreleri ekleyin, 4 × 105 MRC-5s, ve 3 dk için 3.000 rpm de çip döndürün. Hücreler enjekte edildiğinde, dönme hızını 500-1.000 rpm'ye kaydırın.</li>
		<li>Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem% ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm döner ekinde. Eşmerkezli küreseller 24 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Janus küresel formasyonu
	<ol>
<li>Çip 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ilk hücreleri içeren 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin, 2,5 × 105 hASC. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.</li>
		<li>Çipi 36,5 °C, >%95 nem ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Talaş 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ikinci hücre kümesi olan 4 × 105 MRC-5s içeren hücre süspansiyonlarının 100 μL'sini ekleyin. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.</li>
		<li>Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem, ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm dönerek. Janus küresel leri 24 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sandviç küresel formasyonu
	<ol>
<li>Çip 500-1.000 rpm'de dönerken pipetleme yaparak ilk hücreleri içeren 100 μL hücre süspansiyonları ekleyin. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.</li>
		<li>Çipi 36,5 °C, >%95 nem ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>İkinci hücreleri içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin, 3 × 105 MRC-5s, çip 500-1.000 rpm dönerken pipetleme tarafından. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.</li>
		<li>Çipi 36,5 °C, >%95 nem oranı ve %5 CO2'de 1.000-2.000 rpm'de 3 saat boyunca döndürerek kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Üçüncü hücreleri içeren hücre süspansiyonları 100 μL ekleyin, 1.5 × 105 hASCs, çip 500-1.000 rpm dönerken pipetleme tarafından. Daha sonra, 3 dakika için 3.000 rpm de çip döndürün.</li>
		<li>Kültür kuvöz hücreleri 36.5 °C, >95% nem% ve 5% CO2 1.000-2.000 rpm döner ekinde. Sandviç küreselleri 12 saat içinde oluşturulur. Uzun vadeli kültür için, kültür ortamını her gün değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hücre boyama
<ol><li>Hücre floresan boyasını oda sıcaklığına (20 °C) ısıtın.</li>
	<li>1 mM çözeltisi yapmak için şişe başına 20 μL susuz dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyin.</li>
	<li>DMEM kullanarak floresan'ı 1 μM'lik son çalışma konsantrasyonuna seyreltin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna floresan ekleyin ve pipet kullanarak yavaşça askıya alın.</li>
	<li>36,5 °C'de 20 dk inkübün, nem >%95 ve %5 CO2.</li>
</ol>

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+Advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: Advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Tung, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+3D+spheroid+culture+and+drug+testing+using+a+384+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array.</a> Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).</li>
<li>Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+in+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Spheroids in Cancer Research.</a> Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).</li>
<li>Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroidal+culture+of+cytotrophoblast+cells+mimics+the+phenotype+and+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+normal+and+preeclamptic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies.</a> Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).</li>
<li>Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+force-based+microfluidic+techniques+for+cellular+and+tissue+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+promotes+cell+yield+and+stemness+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance.</a> Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+spheroids+exhibit+enhanced+in-vitro+and+in-vivo+osteoregenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential.</a> Bmc Biotechnology. 14 (1), 105(2014).</li>
<li>Koh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidic+platform+for+ultrasensitive+detection+of+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin.</a> Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).</li>
<li>Steigert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemoglobin+measurement+on+a+centrifugal+microfluidic+platform+for+point-of-care+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics.</a> Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).</li>
<li>Park, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+centrifugal+microfluidic+device+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e1(2016).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-in-one+centrifugal+microfluidic+device+for+size-selective+circulating+tumor+cell+isolation+with+high+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).</li>
<li>Gorkin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+microfluidics+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Centrifugal microfluidics for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).</li>
<li>Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity-induced+multicellular+spheroid+generation+with+different+morphological+patterns+precisely+controlled+on+a+centrifugal+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform.</a> Biofabrication. 9 (4), (2017).</li>
<li>Rocca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+titanate+nanoparticles+and+hypergravity+stimulation+improve+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+into+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypergravity+stimulation+enhances+PC12+neuron-like+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation.</a> BioMed Research International. 2015, (2015).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CMS, enjekte edilen tüm hücrelerin atık olmadan mikrokuyu girdiği kapalı bir sistemdir ve bu da onu geleneksel mikrowell bazlı küresel üretim yöntemlerinden daha verimli ve ekonomik hale getirir. CMS sisteminde, ortam her 12-24 saatte bir çipteki ortamı çıkarmak için tasarlanmış bir emme deliğinden değiştirilir(Şekil 3A). Ortam emme işlemi sırasında, ortam ve mikrokuyu duvarı arasındaki yüzey gerilimi nedeniyle mikrokuyunun içinden neredeyse hiç ortam kaçamaz. PDMS'den yapılmış çip elastik v...

Biyolojik in vivo mikroortamları üç boyutlu (3D) küresel hücre kültürüne sahip simüle etmek, fizyolojik olarak daha gerçekçi deneysel üretmek için iki boyutlu (2D) hücre kültürüne (örn. geleneksel Petri kabı hücre kültürü) göre daha kolaydır. sonuçlar1. Şu anda mevcut küresel oluşum yöntemleri asma damla tekniği2dahil , sıvı-bindirme tekniği3, karboksimetil selüloz tekniği4, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan tekniği5, ve kullanımı biyoreaktörler6. Her yöntemin kendine has yararları olmasına rağmen, tekrarlanabilirlik, üretkenlik ve kokültür spheroidlerinin üretilmesinde daha fazla iyileşme gereklidir. Örneğin, manyetik kuvvet tabanlı mikroakışkan teknik5 nispeten ucuz olmakla birlikte, güçlü manyetik alanların canlı hücreler üzerindeki etkileri dikkatle düşünülmelidir. Mezenkimal kök hücre farklılaşması ve çoğalması çalışmalarında özellikle sferoid kültürün yararları, çeşitli çalışmalarda bildirilmiştir7,8,9.
Santrifüj mikroakışkan sistem, aynı zamanda lab-on-a-CD (kompakt disk) olarak bilinen, kolayca içinde sıvı kontrol etmek ve substrat rotasyon istismar için yararlıdır ve böylece immünoassays10gibi biyomedikal uygulamalarda kullanılmıştır , biyokimyasal belirteçleri tespit etmek için kolorimetrik tahliller11, nükleik asit amplifikasyon (PCR) tahlilleri, otomatik kan analiz sistemleri12, ve all-in-one santrifüj mikroakışkan cihazlar13. Sıvıyı kontrol eden itici güç, rotasyontarafından oluşturulan merkezcil kuvvettir. Ayrıca, karıştırma, değerleme ve örnek bölme birden fazla işlevleri sadece bu tek CD platformu yapılabilir. Ancak, yukarıda bahsedilen biyokimyasal analiz yöntemleri ile karşılaştırıldığında, kültür hücrelerine CD platformları uygulayarak daha az çalışma olmuştur, özellikle küresel ler14.
Bu çalışmada santrifüj mikroakışkan esaslı küresel (CMS) sisteminin insan yağkaynaklı kök hücrelerin (hASC) ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür veya kokültür ile performansını gösterdik (MRC-5). Bu yazı, grubumuzun araştırma metodolojisi15'iayrıntılı olarak açıklamaktadır. Böylece, küresel kültür lab-on-a-CD platformu kolayca çoğaltılabilir. CMS kültür çipi, yonga tutucu, DC motor, motor montaj ve dönen bir platformdan oluşan bir CMS üretim sistemi sunulmaktadır. Motor montaj akrilonitril bütadien stiren (ABS) ile basılmış 3D. Talaş tutucu ve dönen platform PC (polikarbonat) ile işlenmiş CNC (bilgisayar sayısal kontrol) vardır. Motorun dönüş hızı, darbe genişliği modülasyonuna dayalı bir PID (orantılı-integral-türevi) algoritması kodlayarak 200 ile 4.500 rpm arasında kontrol edilir. Boyutları 100 mm x 100 mm x 150 mm olup 860 g ağırlığındadır ve kullanımı kolaydır. CMS sistemi kullanılarak, küresel ler çeşitli yerçekimi koşulları altında oluşturulabilir 1 x g 521 x g,böylece yüksek yerçekimi altında hücre farklılaşma promosyon çalışma 2D hücrelerden uzatılabilir16,17 için 3D küresel. Çeşitli hücre türlerinin coculture da etkili in vivo ortamda taklit etmek için önemli birteknolojidir 18. CMS sistemi kolayca monokültür spheroids üretebilir, yanı sıra çeşitli yapı türlerinin coculture sheroids (örneğin, konsantrik, Janus, ve sandviç). CMS sistemi sadece basit küresel çalışmalarda değil, aynı zamanda 3Boyutlu organoid çalışmalarda, insan organ yapılarını göz önünde bulundurmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>3D yazıcı</td><td>Cubicon</td><td>3DP-210F</td><td></td></tr><tr><td>Yağ kaynaklı mezenkimal kök hücreler (hASC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-011</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Tamamlanmış ortamın ve tamponun %1'ini içeriyordu</td></tr><tr><td>CellTracker Yeşil CMFDA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>CellTracker Kırmızı CMTPX</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>C34552</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Bilgisayar sayısal kontrol (CNC) döner oyma makinesi</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>DC motor</td><td>Nurielectricity Inc.</td><td>MB-4385E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş eaggle'ın ortamı (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Tamamlanmış orta insan akciğer fibroblastlarının% 10'unu</td></tr><tr><td>içeriyordu (MRC-5)</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Inventor 2019</td><td>Autodesk</td><td></td><td>3D bilgisayar destekli tasarım programı</td></tr><tr><td>Petri kabı ve Phi; 150 mm</td><td>JetBiofill</td><td>CAD010150</td><td>Yüzey İşlem Görmüş</td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11/6/9003</td><td>Fosfat tamponlu tuzlu su ile %4 (a/h) çözeltiye</td></tr> <tr>seyreltin<td>Polikarbonat (PC)</td><td>Acrylmall</td><td>AC15PC</td><td>200 x 200 x 15 mm</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr></tbody></table>

Çok hücreli Üç boyutlu spheroidler Üretmek için lab-on-a-cd platformu

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Üç boyutlu küresel hücre kültürü hücre deneylerinde daha yararlı sonuçlar elde edebilir çünkü canlı vücudun hücre mikro ortamlarını iki boyutlu hücre kültüründen daha iyi simüle edebilir. Bu çalışmada, yüksek santrifüj kuvvet uygulayan üç boyutlu (3D) hücre küreselleri oluşturmak için santrifüj mikroakışkan tabanlı küresel (CMS) kültür sistemi adı verilen, motorlu laboratuvar-on-a-CD (kompakt disk) platformu imal ettik. Bu cihaz 1 x g ile 521 x garasında yerçekimi koşulları oluşturmak için dönüş hızlarını değiştirebilirsiniz. CMS sistemi 6 cm çapında, yüz 400 μm mikrowells vardır ve bir bilgisayar sayısal kontrol makinesi tarafından önceden yapılmış bir polikarbonat kalıp polidimethylsiloxane ile kalıplama tarafından yapılır. CMS sisteminin kanal girişindeki bir bariyer duvarı, çipin içindeki hücreleri eşit olarak yaymak için santrifüj kuvveti kullanır. Kanalın sonunda, hücrelerin mikrokuyulara girmesini sağlayan bir slayt bölgesi vardır. Bir gösteri olarak, küresel ler sistemi kullanarak yüksek yerçekimi koşulları altında insan yağ kaynaklı kök hücre ve insan akciğer fibroblastlarının monokültür ve coculture tarafından üretildi. CMS sistemi, konsantrik, Janus ve sandviçin çeşitli yapılarının ortak kültür spheroidlerini üretmek için basit bir operasyon şeması kullansın. CMS sistemi, tek veya birden fazla hücre tipinin küresel ve organoid kültürünü gerektiren hücre biyolojisi ve doku mühendisliği çalışmalarında yararlı olacaktır.

Yukarıdaki protokole göre 6 cm çapında CMS kültür çipi(Şekil 2)başarıyla yapılmıştır. İlk olarak, çip bir üst tabaka ve bir alt tabakadan ayrı olarak yapılmış ve daha sonra plazma yapıştırma ile birbirine bağlanmış. Elde edilen küreseloidler çipi ayırarak kolayca toplanabilir. CMS kültür yongasının kanalı bir giriş portu ve merkezi, slayt ve microwell bölgelerinden oluşur(Şekil 3). Hücre, orta ve pluronik çözeltiler 5 mm çapında bir giriş deliğinden enjekte edil...

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...

Bu teknik, sferoidlerin hızlı üretimi için öncü bir sistem olan bir laboratuvar-on-a-CD platformu kullanarak bireysel ve birden fazla hücre tiplerinden hücre sferoidleri oluşturmak için kullanılabilir. Bu teknik, hücreleri belirlenmiş mikrowelllere yatırmak için santrifüj kuvvet kullanır ve farklı küresel lerin üretimi için birden fazla hücre türünün sıralı olarak izaat inmesine olanak sağlar. CMS kültür yongası imalatı için, ilk bilgisayar sayısal kontrol işleme tarafından kültür çipinin üst ve alt katmanları için polikarbonat kalıplar yapmak.Sonraki karışımı PDMS baz ve PDMS kür ajan hava kabarcıkları kaldırmak için bir saat boyunca bir kurutucu karışımı yerleştirmeden önce beş dakika boyunca 10-bir oranında. CMS kültür yonga kalıpları içine gazdan arındırılmış PDMS karışımı dökün ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için bir saat daha kurutucu içine kalıpları yerleştirin. İkinci gaz giderme sonunda, yüzeylere bakacak şekilde vakumlanmış plazma temizleyicisine talaş koymadan önce karışımı 80 santigrat derecede iki saat boyunca Bir ısı odasında tedavi edin.Kültür yongalarını 30 saniye boyunca 18 watt'lık bir güçle hava destekli plazmaya maruz bırakın ve yapışma gücünü artırmak için çipin iki katmanını 80 santigrat derecede 80 derecede bağlayın. Sonra CMS kültür çipini 121 derecede 15 dakika otoklavda sterilize edin. Hücreleri küresel formasyona hazırlamak için, 36,5 santigrat derecelik su banyosunda 5 ila 10 kat 10 arasında içeren bir mililitrelik şişeyi iki dakika boyunca hafif karıştırma ile hücrelere bir mililitre DMEM eklemeden önce eritin.Daha sonra hücreleri 150 milimetre çapındaki Petri kabına ekleyin ve 15 mililitre 36,5 derecelik orta dereceyi içeren petri kabına ekleyin ve kabı 24 saat boyunca hücre kültürü kuvöze yerleştirin. Ertesi gün, supernatant taze DMEM 15 mililitre ile değiştirin ve kuvöz hücreleri geri dönün. Hücreleri ayırmak için, 36,5 santigrat derece ve% 5 karbondioksit dört dakika boyunca tripsin dört mililitre ile kültür oluşturmak, hücreler çanak altından kaldırdı zaman taze orta ile reaksiyon durdurma.Hücreleri etiketlemek için, bir milimolar çözelti elde etmek için şişeye 20 mikrolitre susuz dimetil sülfoksit eklemeden önce uygun bir hücre floresan boyasını oda sıcaklığına ısıtın. Floresan'ı DMEM'deki bir mikromolar'ın son çalışma konsantrasyonuna seyreltin ve boyayı nazik karıştırma ile ilgi hücresi süspansiyonuna ekleyin. Sonra hücreleri 20 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka yerleştirin.Monokültür küresel formasyonu için, çipi dakikada 500 ila 1,000 dönüşte döndürürken CMS kültür çipinin giriş deliğine ilk olarak %4 Pluronic F-127 çözeltisi 2,5 mililitre ekleyin. Tüm çözüm eklendiğinde, CMS sistemini kullanarak çipi dakikada 4.000 dönüşte üç dakika boyunca döndürün. Rotasyonun sonunda, kültür çipini bir gecede %5 karbondioksitle 36.5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi sabah, Pluronic çözeltisi çıkarın ve DMEM ile kültür çipi yıkayın. Talaşı temiz bir bankta 12 saat kuruttuktan sonra, giriş portuna 2,5 mililitre orta ekleyin ve talaşı dakikada 4,000 dönüşte üç dakika döndürün. Döndürme sonunda, giriş portundaki ortamın 100 mikrolitresini, fiş dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken, hazırlanan hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresi ile değiştirin.Daha sonra çipi üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine koymadan önce her mikrokuyudaki hücreleri santrifüj kuvvetle tuzağa düşürmek için dakikada 3,000 dönüşte üç dakikada döndürün ve her gün gösterildiği gibi ortamı yenileyin. Eşmerkezli küresel eşkültür üretimi için, çip dakikada 500-1, 000 rotasyon ve dakikada 3, 000 rotasyon üç dakika döner dönerken çipin giriş noktasına orta 100 mikrolitre hücre ilk popülasyon ekleyin. Döndürmenin sonunda, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken ikinci hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve çipi üç dakika daha dakikada 3,000 dönüşte döndürün.Her iki hücre hacmi de enjekte edildiğinde, çipi 24 saat boyunca dakikada 1,000 ila 2,000 dönüşle hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Janus küresel formasyonu için, çip dakikada 500-1, 000 dönüşte dönerken ilk hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve ardından dakikada 3,000 dönüşte üç dakika. Döndürmenin sonunda, çipi hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve üç saat boyunca dakikada 1,000 ila 2, 000 dönüşte rotasyon alabilen.Kuluçka sonunda, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken ikinci hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve talaş 3,000 dönüşte dakikada üç dakika boyunca döndürün. Daha sonra hücre kültürü kuluçka merkezindeki hücreleri 1,000 ila 2,000 dönüşte dakikada 24 saat boyunca yerleştirin. Sandviç küresel oluşumu için, ilk olarak ilk hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini eklerken, çip dakikada 500-1,000 dönüşte dönerken, dakikada üç dakikalık dönüşler ve ardından dakikada 3,000 dönüşte üç dakikalık dönüşler.Döndürmenin sonunda, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte dönerken ikinci hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini eklemeden önce, çipi hücre kültürü kuluçka makinesinde iki saat boyunca 1,000 ila 2,000 dönüşte bir rotator üzerine yerleştirin. Çipi 3,000 RPM'de üç dakika döndürün ve çipi üç saatlik bir kuluçka için kuvöze geri yerleştirin. Daha sonra ilk hücre popülasyonunun 100 mikrolitresini ekleyin, çip dakikada 500 ila 1,000 dönüşte döner ve hücreleri 12 saat boyunca gösterildiği gibi döndürün ve kültürlendirin.Gösterildiği gibi protokolü takip ederek, altı santimetre çapında cms kültür çipi başarıyla imal edilebilir. CMS kültür yongasının kanalı bir giriş bağlantı noktası ve merkezi, slayt ve microwell bölgelerinden oluşur. Tek tek CMS yongaları içinde kültürün ilk 24 saati için dakikada 2.000 rotasyonda alınan iki tür hücre kültürünün hızlandırılmış görüntüleri, gösterildiği gibi, küresel lerin başarılı oluşumunu göstermektedir.Üç günlük kültürden sonra mikrowelllerin görüntülenmesi, küresel lerin mükemmel bir tekdüzelik ve küresellik gösterdiğini göstermektedir. Konentrik, Janus ve sandviç yapılı cokültürd spheroids de oluşturulabilir. Buna ek olarak, hücre kültürleri yedi gün boyunca yüksek yerçekimi maruz, canlı / ölü boyama takip, çoğu hücre cips içinde uzun vadeli kültür hayatta olduğunu göstermektedir.CMS kültür yongasının üst ve alt katmanları bağlandıklarında dikkatlice hizalanmalıdır, aksi takdirde her mikrokuyudaki hücre sayısı eşit olmayabilir. Bu çalışma, coculture spheroid araştırma için giriş engelini düşürebilir ve yaygın olarak coculture çalışmalarda kullanılabilir, örneğin, ilgi yeni ilaçların taranması için.

lab-on-cd-platform-for-generating-multicellular-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz 3D doku parçacıklarının ve potansiyel uygulama üreten hücre-hücre etkileşimleri farklılıkları ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Spheroids, 2B hücre kültürü tek katmanlı modellere kıyasla bir hücrenin ortamını daha doğru bir şekilde temsil etmek için kullanılan bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının bir kolorektal kanser hücre hattından sferoidler ürettiğini ve sferoidlerin büyümesini izlemek için canlı hücre görüntüleme uyguladığını göreceğiz.

Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Burada, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanarak adipoz türevli stromal/kök hücre (ASC) sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini açıklıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu ASC sferoidleri, 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak kullanılabilir.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Görüntü yakalama ve proteomik kullanarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Öğrenin, lab-on-a-CD platformu kullanarak tek ve çoklu hücre tiplerinden üç boyutlu spheroid üretme yöntemini. Santrifüj kuvvetiyle hücreleri mikro kuyucuklara yerleştirerek doku mühendisliği araştırmaları için hızlı ve verimli kültür sağlar.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Daha fazla video keşfet