Biyolojik Olarak Aktif Mercan Matrisi Kullanılarak Ayrışmış Nöral Hücre Kültürlerinin Dayanıklılığının Arttırılması

Bu protokolün önemi, in vitro olarak nöronların, gliaların ve kök hücrelerin dayanıklılığını ve büyümesini artırmak için yeni bir yol sağlamasıdır. Diğer hücreler için de geçerlidir. Tekniğin temel avantajı, mercan iskeletinden yapılmış bir matrisin kullanılmasıdır.

Bu matris nöro hücreleri besler ve korur ve yeniden büyümeyi destekler. İn vitro nöral hücreler için destekleyici olan mercan iskeleti, beyin hasarı bölgelerinde rejeneratif bir implant olarak benzer şekilde işlev görebilir. Başlamak için, mercan iskeletini kırmak için bir çekiç kullanın ve 0,5 ila iki santimetrelik parçalara bölün.

Organik ve organik olmayan kalıntıları çözmek için mercan iskeleti parçalarını 10 dakika boyunca% 10 Sodyum hipoklorit çözeltisine batırın. Sonra bir kez çift damıtılmış su ile yıkayın. Kalan organik kalıntıları gidermek için, parçaları bir molar sodyum hidroksit çözeltisinde beş dakika bekletin, ardından bir kez çift damıtılmış suyla yıkayın.

Parçaları 10 dakika boyunca% 30 hidrojen peroksit çözeltisine batırarak organik birikintilerin giderilmesine devam edin ve parçaları üç kez çift damıtılmış su ile yıkayın. Mümkün olduğu kadar fazla çift damıtılmış suyu alın ve mercan parçalarını davlumbazda kurumaya bırakın. Daha sonra cam kapak fişlerini 100 milimetrelik bir cam Petri kabında 10 mililitre% 95 etanole batırarak temizleyin.

15 dakika sonra etanolü çıkarın ve her yıkama arasında 10 dakika bekleyerek üç kez çift damıtılmış su ile yıkayın. Çift damıtılmış suyu çıkarın ve tabağı 80 derece önceden ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin. Ardından, çift damıtılmış su buharlaşana kadar kapak kızaklarını hafifçe karıştırın.

Kapak kaymalarını otoklavlayın. Mercan iskeleti parçalarını bir havan topu kullanarak öğütün ve tamamen parçalanana kadar havaneli havan tokmağı. Boyutları 20 ila 200 mikrometre arasında değişen bir tahıl karışımı elde edilir.

Alternatif olarak, mercan iskeleti parçalarını, 30 saniye boyunca 1000 RPM hızda, altı santimetre bıçak uzunluğuna ve 0,5 ila bir santimetre genişliğe sahip bir elektrikli taşlama makinesi kullanarak öğütün. Tahılları saflaştırmak için, tahılları elektrikli 40 mikron filtre süzgecine aktarın. Elektrikli süzgeç ayarlarını dakikada 600 genlik hızla sallanacak ve saniyede altı kez zıplayacak şekilde ayarlayın.

Sonra tahılları otoklavlayın. Steril koşullar altında, mercan iskeleti tanelerini, bir mililitre PDL çözeltisi başına beş miligram veya 10 miligram tane konsantrasyonunu elde etmek için Hank'in çözeltisinde çözülen mililitre başına 20 mikrogramlık bir PDL'ye ekleyin. Çözeltiyi 25 santimetrekare başına yaklaşık iki mililitre konsantrasyonda şişelere ve tabaklara dökün ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Taneler batar ve dibe yapışır. Ertesi gün, şişeleri ve bulaşıkları bir kez steril çift damıtılmış suyla yıkayın. Şişeleri ve bulaşıkları davlumbazda kurumaya bırakın.

Cam kapak kızağını kaplamak için, önce mililitre başına beş veya 10 miligram konsantrasyonda çift damıtılmış suya mercan iskeleti taneleri ekleyin. Kapak fişlerini önceden 80 santigrat dereceye ısıtılmış bir ısıtma plakasına yerleştirin. Daha sonra 40 mikrolitre tahıl solüsyonunu kapak kaymasının ortasına damlatın ve tamamen buharlaşması için 15 dakika bekleyin.

Bu, tanelerin kapak kızağına yapışmasına neden olacaktır. Kaplanmış kapak kızaklarını otoklavlayın ve steril koşullarda saklayın. Daha sonra, kapak fişlerini steril 24 oyuklu bir plakanın kapağına yerleştirin, her bir kapak fişine mililitre PDL çözeltisi başına 100 mikrolitre 20 mikrogram ekleyin.

Sıvının tüm tahıl bölgesini ve kapak kayma yüzeyinin geri kalanını kapladığından emin olmak için ucu kullanın. Kapağı plakanın alt kısmıyla kapatın ve yerin kenarlarını parafin film ile sarın. Gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, kapak fişlerini bir kez çift damıtılmış su ile yıkayın ve kapüşonda kurulayın. Sıçan yavru kafalarını hazırladıktan sonra büyük cımbızla ağzından tutun. Kafatasını kaplayan deriyi küçük bir makasla kesin.

Temiz bir makasla beyinciğin yan tarafındaki kafatasının altına girin ve kafatasını sağa ve sola doğru keserek çıkarılmasını sağlayın. Küçük cımbız kullanarak kafatasını beyinden soyun. Beyni kafadan ayırın ve iki mililitre soğuk MEM içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına koyun.

Stereo mikroskop altında, hipokampusu incelemek için iki küçük cımbız kullanın. Hipokampusu MEM içeren hazırlanmış 35 milimetrelik tabağa aktarın. Hipokampusu neşter kullanarak yaklaşık bir milimetrelik dilimler halinde kesin.

200 mikrolitre tripsin çözeltisi ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 37 santigrat derecede ve% beş ila 10 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tripsini etkisiz hale getirmek için tabağa iki mililitre soğuk MEM ekleyin.

Daha sonra, tripsinizlenmiş dokuyu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış bir mililitre ilk gün ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için en büyük çapa sahip bir cam Pasteur pipeti kullanın. Dokuyu en büyük çaplı cam pipetten 10 ila 15 kez geçirerek eziyet edin. Daha sonra orta çaplı cam pipeti kullanarak bu işlemi tekrarlayın.

En küçük çaplı pipetle ezmeye devam edin. Hücre ölümünü azaltmak için köpürmekten kaçının. İlişkili olmayan doku parçalarının iki ila beş dakika batmasına izin verin.

Ardından süpernatanı başka bir 15 mililitrelik tüpe aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Mililitre başına 200.000 ila 400.000 hücre arasında tercih edilen hücre yoğunluğunu elde etmek için.

Seyreltmek için ilk gün orta kullanın. Daha sonra, her bir cam kapak fişine 100 mikrolitre hücre ekin. Tüm kapak fişini hücrelerle kapladığınızdan emin olun.

37 santigrat derece ve% beş ila 10 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, kuyucuklara 500 mikrolitre nöronal büyüme ortamı ekleyin. Cımbız kullanarak, kapak fişini eğerek ve her bir kapak fişini nazikçe uygun kuyucuğuna aktararak ilk gün ortamını çıkarın.

Kalan ortamı kapaktan emdirin. Plakayı 37 santigrat derecede ve% beş ila% 10 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçka makinesinin dibinde bir tepsi su kullanarak kuluçka makinesini maksimum düzeyde nemlendirin.

Ortamı değiştirmeyin. Kültürler bu koşullar altında bir aya kadar korunabilir. Bu çalışmada, elle öğütme ve elektrikli öğütme makinelerinin her ikisi de, boyutları 20 ila 200 mikrometre arasında değişen bir tahıl karışımı ile benzer sonuçlar verdi.

Manuel veya elektrikli süzgeçler iki tip tahıl karışımı üretti. Biri 40 ila 200 mikrometre arasında değişen tanelere, ikincisi ise 40 mikrometre veya daha küçük boyuta sahip. Faz kontrast mikrografları, mercan iskeleti taneleri ile kaplanmış örtü astarları üzerinde hipokampal hücrelerin yetiştirilmesinin, matrisin yokluğunda ve varlığında karmaşık nöronal ağlar oluşturduğunu göstermektedir.

Hücre çekirdeği boyama, tohumlamadan 14 gün sonra, matris üzerinde hücre yoğunluğunun, kaplanmamış örtü kızaklarına göre daha yüksek olduğunu gösterdi. Mikrotübül ile ilişkili protein iki ile boyama, kontrole kıyasla matris üzerinde karmaşık bir nöronal ve dendritik ağ oluştuğunu gösterdi. Ek olarak, glial fibriler asidik protein kullanılarak görselleştirilen mercan iskeleti matrisi üzerinde büyütülen glial hücreler önemli morfolojik değişikliklere uğramıştır.

Daha yuvarlak ve daha düz göründükleri kontrol substratı üzerinde büyütülen glial hücrelerden daha uzun süreçlerle daha sivri bir görünüm elde ettiler. Hücreleri izole ederken, Mercan tanelerinin ayrılmasını önlemek için hızlı çalışmayı, gerekirse CO2 ekleyerek pH'ı korumayı ve mümkün olduğunca nazik çalışmayı unutmamak önemlidir.