Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması
31 Mayıs 2020
Mercanlar hem insanlar hem de deniz canlıları için önemli olan biyoçeşitlilik ekosistemleri oluştururlar. Ancak, hala tam potansiyel ve birçok mercan hücrelerinin fonksiyonu anlamıyorum. Burada, taşlı mercan hücre popülasyonlarının izolasyonu, etiketlemi ve ayrılması için geliştirilmiş bir protokol salıyoruz.
Bu protokol, canlı mercan hücre popülasyonlarının daha önce mümkün olmayan bir açıklama düzeyinde tanımlanmasını ve izole edilmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı, şimdiye kadar çoğunlukla ulaşılmaz olan hücre özgüllüğü düzeyine erişim sağlar. Prosedürü gösteren Dr Shannon Saigh, sitometri sitometri paylaşılan kaynak Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi'nde bir araştırma görevlisi olacaktır.
Canlı mercan hücre sıralaması için akış sitometresini ayarlamak için, akış sitometre yazılımında yeni bir proje şablonu açın ve lazer panelindeki analiz için uygun lazerleri seçin. Daha sonra, gating ve analiz stratejisini ayarlamak için uygun arsalarda bir yan dağılım avere karşı ileri dağılım çizimi oluşturun. Akış sitometrik analizi ve canlı mercan hücrelerinin sıralanması için, kontrol lekesiz hücre örneğini sitometrenin örnek odasına yükleyin ve okuma işlemini başlatın.
Mercan hücreleri özellikle kırılgan olduğundan, hücre lisisini önlemek için sitometre basıncını düşük tutun. Dağılım çiziminde, noktaları ortalamak ve olayları kaydetmeye başlamak için fotoğraf çarpanı gerilimini ayarlayın. İleriye karşı yan dağılım çiziminde, hücrelerin etrafında, ileri dağılım x ekseninde 10 ila 4.
Kontrol örneğini lekeli hücrelerin ilk örneğiyle değiştirin ve duraklamadan önce yaklaşık 10.000 hücre kaydedin. Daha sonra lekeli örnek grubuna özgü olayları geçit. Canlı mercan hücrelerini sıralamak için, akış sitometre yazılımındaki ilgi hücre popülasyonundan birini seçtikten sonra, her popülasyonun sıralaması için sitometre toplama odasına uygun toplama çözeltisinin 250 ila 500 mikrolitresini içeren bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
Bir kez zaman uygun bir miktar enkaz dışarı floş geçti, her yerde toplamak için istenilen nüfus sıralama başlar 10, 000 için birkaç milyon hücre. Her yeni leke, tür veya ayıklayıcı kullanıldığında, en az 20.000 ilgi hücresini 500 mikrolitre boyama ortamına sıralayarak ilgi popülasyonu üzerinde saflık kontrolü yapılmasını sağlar ve sıralamalı hücreleri yeniden analiz ederek olayların ilk sıralama için kullanılan kapıda okunduğunu onaylayın. In vitro çalışmalar için, bir kuvöz veya sterilbir ortama transfer edilene kadar buz üzerinde sıralanmış hücreleri saklayın.
Mercan hücreleri ile aynı şekil veya tanecikliliği paylaşmayan diğer hücresel olmayan parçacıkları getirmek için, ileri ve yan dağılım çiziminde bir geçit seçimi oluşturarak analizden çıkarılabilir. Ölü hücreler, lekesiz ve lekeli hücre süspansiyonlarının DAPI sinyalini histogram kullanarak karşılaştırarak ve yüksek DAPI ifade eden hücreleri gating ile dışlanabilir. Buna paralel olarak, otofloresan simbiyodenaziyi barındıran hücreler uzak kırmızı kanalda yüksek sinyal ile hücrelere karşı gating tarafından kaldırılabilir.
Bu yinelemeli gating işleminden sonra, kalan hücreler simbiyodenazisi eksik bozulmamış canlı mercan hücre popülasyonları temsil eder. Bu hücreler daha sonra reaktif oksijen türleri aktivitesi ve/veya lizozom içeriği gibi özelliklerle boyanarak farklı hücre alt popülasyonlarına sınıflandırılabilirler. Bazı hücrelerin diğerlerinden daha kırılgan olduğunu hatırlamak ve bu işlemi mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde yürütmek çok önemlidir.
Belirli hücreler izole edildikten sonra, hücre kültürleri oluşturma ve transkripsiyonomik profiller oluşturma gibi x-vivo fonksiyonel denemeler için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, deniz ekosistemlerindeki biyolojik çeşitlilik için kritik öneme sahip olan mercan hücrelerinin daha iyi anlaşılmasına yönelik ihtiyacı ele almaktadır. Yazarlar, taş mercan hücre popülasyonlarının izolasyonu ve etiketlenmesi için, benzeri görülmemiş bir hücre özgüllüğü seviyesine ulaşan özgün bir protokol sunmaktadırlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Mercan biyolojisi
- Hücre izolasyon teknikleri
- Ekosistem biyolojik çeşitliliği
Arka Plan
- Mercanlar, deniz yaşamı için temel ekosistemler oluşturur.
- Mercan hücre fonksiyonlarına dair mevcut bilgi sınırlıdır.
- Spesifik mercan hücre popülasyonlarının izole edilmesi, ileri araştırmalar için hayati önem taşımaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- Canlı hücre ayıklama için akış sitometrisi
- Model organizma olarak taş mercan
- Belirli hücre tiplerini tanımlama ve izole etme için kapılama stratejisi
Ana Sonuçlar
- Protokol, canlı mercan hücresi popülasyonlarının tanımlanmasına ve ayrıştırılmasına olanak tanır.
- Ayrıştırılan hücrelerin gelecekteki analizler için saflığını ve canlılığını sağlar.
- Alt popülasyonların ve bunların fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Çalışma, mercan hücrelerini izole etmek için güvenilir bir yöntem sunarak araştırma potansiyelini artırmaktadır.
- Bulgular, mercan biyolojisi ve ekosistem sağlığı hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Karmaşık dokulardan spesifik hücre popülasyonlarının izole edilmesi, erken aşama hedef doğrulaması ve mekanistik risk azaltma süreçlerinde kritik bir zorluk olmaya devam etmektedir. Floresanla aktive edilen hücre ayıklama (FACS), yüksek çözünürlüklü hücresel sorgulama sağlayarak yolak spesifik yanıtlardaki öngörü güvenini destekler. Bu yetenek, nadir veya hassas hücre tiplerinin hassas fonksiyonel analizlerini ve transkriptomik profillemesini gerektiren biyofarma keşif iş akışlarına doğrudan uygulanabilir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel doğrulama için canlı popülasyonları izole ederek, terapötik hipotezlerin tek hücre çözünürlüğünde sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Canlı hücre alt popülasyonlarını döküntülerden, ölü hücrelerden ve simbiyont ilişkili sinyallerden ayırarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Hedef etkileşimini ve yolak modülasyonunu netleştiren aşağı akış analizleri için saflaştırılmış girdiler oluşturarak portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir fonksiyonel analizler ve doz-yanıt profillemeleri için uygun, standartlaştırılmış, canlı hücre süspansiyonları üretir.
- Operasyonel Değer: Analiz hazırlığını sağlayan ve deneysel çalışmalar arasındaki değişkenliği minimize eden kapılama (gating) stratejileri oluşturur.
- Ölçeklenebilirlik: Çok kuyucuklu tarama ve omik uygulamaları için yeterli hücre sayısının (10.000 ile birkaç milyon arası) toplanmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Mekanistik takip için hastalıkla ilişkili hücre popülasyonlarının tutarlı izolasyonunu sağlayarak, keşif ve preklinik aşamalar arasında köprü kurar.
- Biyobelirteç Uyumluluğu: Hücresel fenotipleri fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirmek için stres yanıt belirteçlerinin (örneğin, reaktif oksijen türleri, lizozom içeriği) boyanmasını kolaylaştırır.
- Riske Göre Düzenlenmiş İlerleme: Saflaştırılmış popülasyonlar, preklinik modellerdeki veri güvenilirliğini artırarak heterojen örneklerden kaynaklanan yanlış pozitifleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
FACS, her aşamada hassas hücresel girdiler sağlayarak, hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yolak spesifik fonksiyonel sorgulama için canlı mercan (veya benzer memeli) hücre popülasyonlarını izole ederek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Deney tekrarlanabilirliğini ve kantitatif okuma güvenilirliğini artıran standartlaştırılmış, kapılamış hücre popülasyonları sağlar.
- Analitik: Deneysel koşulları karşılaştırmak için doğru transkriptomik, proteomik veya metabolik profilleme sağlayan yüksek saflıkta örnekler üretir.
- Translasyonel Araştırma: Canlı, strese yanıt veren hücre alt kümelerinin tutarlı bir şekilde hazırlanması yoluyla erken keşif aşamasını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Model sistemden bağımsız olarak, hücre altı çözünürlük gerektiren projeler genelinde yeniden kullanılabilir bir platform yetkinliği olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef dışı hücrelerden kaynaklanan gürültüyü azaltarak ve hedeflerin mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlayarak öngörüsel güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir kapılama (gating), düşük basınçlı ayıklama ve canlılığı koruyan toplama yöntemleri aracılığıyla numune hazırlığını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Daha temiz biyolojik veriler sağlayarak, hatalı hedef varsayımlarından kaynaklanan geç evre başarısızlık riskini azaltır ve devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: İlerleme kriterlerini bilgilendiren, güvenilir alt popülasyona özgü veriler aracılığıyla riskten arındırılmış önceliklendirme sağlar.
Uygulama Hususları
- Lazer seçimi, voltaj optimizasyonu ve hassas hücreler için saçılım grafiği kapılamasını (gating) içeren akış sitometrisi kurulumu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Düşük basınçlı sıralama ve çok parametreli deteksiyona (ileri/yan saçılım, floresan kanalları) uygun cihazlara bağımlıdır.
- Tekrar üretilebilirliği sağlamak için boyama protokollerinin, toplama ortamlarının ve kapılama eşiklerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Türler veya koşullar arasındaki hücre hassasiyeti değişkenliğini hesaba katmalı; bu da kayma gerilimi ve boyama süresinin iteratif optimizasyonunu gerektirir.
- Numune hazırlama kalitesiyle sınırlıdır; doğru sıralama için enzimatik veya mekanik dissosyasyon, epitop bütünlüğünü ve hücre canlılığını korumalıdır.
